Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

Resumo

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Resumo

A metástase é a principal causa de morte por câncer. Apesar da melhora nas estratégias de tratamento, o câncer metastático tem um prognóstico ruim. Enfrentamos, portanto, uma necessidade urgente de compreender os mecanismos por trás do desenvolvimento da metástase e, assim, propor tratamentos eficientes para o câncer avançado. Cânceres metastáticos são difíceis de tratar, pois biópsias são invasivas e inacessíveis. Recentemente, houve um interesse considerável em biópsias líquidas, incluindo o ácido desoxiribonucleico circulante livre de células (DNA) e as células tumorais circulantes do sangue periférico e estabelecemos várias linhas de células tumorais circulantes de pacientes com câncer colorretal metastático para participar de sua caracterização. De fato, para caracterizar funcionalmente essas células raras e mal descritas, o passo crucial é expandi-las. Uma vez estabelecidas, as linhas de células tumorais circulantes (CTC) podem então ser cultivadas em condições de suspensão ou aderentes. No nível molecular, as linhas CTC podem ser utilizadas para avaliar a expressão de marcadores específicos de interesse (como diferenciação, células-tronco epiteliais ou cancerígenas) por imunofluorescência ou análise de citometria. Além disso, as linhas CTC podem ser usadas para avaliar a sensibilidade medicamentosa a quimioterapias padrão-ouro, bem como a terapias-alvo. A capacidade das linhas CTC para iniciar tumores também pode ser testada por injeção subcutânea de CTCs em camundongos imunodeficientes.

Finalmente, é possível testar o papel de genes específicos de interesse que possam estar envolvidos na disseminação do câncer editando genes CTC, por ácido ribonucleico de pinos curtos (shRNA) ou Crispr/Cas9. Os CTCs modificados podem, assim, ser injetados em baços de camundongos imunodeficientes, para imitar experimentalmente parte do processo de desenvolvimento metastático in vivo.

Em conclusão, as linhas CTC são uma ferramenta preciosa para futuras pesquisas e para medicina personalizada, onde permitirão a previsão da eficiência do tratamento utilizando as próprias células que são originalmente responsáveis pela metástase.

Introdução

Apesar das recentes melhoras no diagnóstico precoce do câncer e na estratégia terapêutica, mais de noventa por cento da morbidade do câncer ainda se deve à metástase¹. O processo metastático é uma cascata de várias etapas que começa com o descolamento local das células do tumor primário e sua entrada na corrente sanguínea onde se tornam células tumorais circulantes (CTCs) para finalmente colonizar locais distantes como fígado e pulmões, no caso do câncer colorretal (CRC)². Recentemente, tem-se aumentado a atenção para biópsias líquidas, que são uma ferramenta não invasiva para detectar e enumerar CTCs de amostras de sangue de pacientes. A heterogeneidade genética intratumor é uma das principais causas de resistência a medicamentos; assim, isolar células representativas do material tumoral constitui uma ferramenta promissora para a medicina personalizada³.

Apesar da baixa frequência de CTCs no sangue (1 CTC por 10⁶ - 10⁷ leucócitos)⁴, várias técnicas de detecção e isolamento foram desenvolvidas com base em diferenças de propriedade entre CTCs e outros componentes do sangue⁵. O número de CTCs em amostras de sangue do paciente, sozinho, pode fornecer informações sobre o estágio de malignidade, resposta ao tratamento e progressão da doença^6,7. Assim, o isolamento do CTC é uma ferramenta crucial para estudos translacionais avaliarem a heterogeneidade genética ou realizarem o rastreamento de medicamentos, bem como para estudos fundamentais para caracterizar essas células invasoras, pois são os principais atores da indução metastática^8,9. De fato, em comparação com as linhas de células cancerígenas estabelecidas comercialmente que acumularam milhares de mutações ao longo do tempo, os CTCs frescos compartilham as principais características do tumor primário original, incluindo uma capacidade potente de metástase, e eles são um melhor reflexo da doença. Essas características fazem deles uma ferramenta robusta para estudos fundamentais, especialmente em experimentos eliminatórios de fatores-chave previstos envolvidos na metástase. O resultado desses experimentos pode ser validado in vivo, emcamundongos, conforme descrito abaixo.

Uma vez que os CTCs são isolados, eles podem ser expandidos em condições de cultura não aderentes e, em seguida, eles podem ser manipulados assim como qualquer linha de células cancerígenas disponíveis, ou seja, eles podem ser igualmente cultivados em condições aderentes ou incorporados em Matrigel, dependendo da questão científica¹⁰. Por exemplo, para testar a expressão e localização de uma proteína de interesse, as esferas CTC podem ser cultivadas em condições de suspensão e serem incorporadas em Histogel para realizar imunofluorescência em seções de esferas. Além disso, se a proteína é membranous, sua expressão em células vivas pode ser medida por citometria.

Para estudos funcionais, para testar o papel de uma proteína de interesse que pode desempenhar um papel na colonização hepática, os CTCs com genes editados, por shRNA ou CRISPR/Cas9, podem ser injetados no baço de camundongos imunodeficientes. Este último experimento é um modelo poderoso para imitar a colonização da metástase hepática¹¹.

A capacidade dos CTCs de iniciar tumores pode ser avaliada injetando um número muito pequeno de células em camundongos imuno-deficientes. Como a iniciação tumoral é uma marca registrada das células-tronco cancerígenas (CSCs) este ensaio indicará a porcentagem de CSCs dentro das linhas CTC. Este fenótipo de células-tronco torna as linhas de células tumorais circulantes resistentes a algumas terapias de câncer padrão-ouro. Os CTCs expandidos podem, portanto, ser usados para triagem de medicamentos e identificar o melhor tratamento potencial eficiente para o paciente; A resposta ctc ao tratamento pode ser testada in vitro usando um ensaio de viabilidade de luminescência, por exemplo.

Em uma perspectiva de longo prazo, o rastreamento de medicamentos em CTCs recém-isolados e amplificados poderia ser usado como uma nova ferramenta para a medicina personalizada para ajudar na escolha do tratamento mais eficiente e adaptado para os pacientes.

No presente artigo, são detalhados protocolos para a cultura de linhas CTC, para coloração de proteínas específicas via imunostaining e citometria, para a realização de ensaios de citotoxicidade, bem como experimentos in vivo xenoenxerto com CTC.

Protocolo

Todos os protocolos in vivo foram aprovados pelos órgãos de ética animal.

1. Amplificação CTC em Condições de Cultura 3D

1. Para cultivar CTCs em suspensão, os primeiros CTCs de sementes em poços de uma placa de 24 poços de anexo ultra-baixo (ULA) na concentração máxima de 5 células/μL e em 1 mL de m12 médio (ou seja, DMEM-F12 avançado suplementado com 2 mM l-glutamina, penicilina de 100 Unidade/mL e estreptomicina, suplemento N2, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento do fibroblasto^{10 ng/mL}).
2. Para permitir a formação da esfera e a expansão celular, incubar as células em condições hipóxiis (2% O₂) entre 6 e 10 dias.
3. Uma vez que as esferas sejam grandes o suficiente (100 μm), para evitar necrose, dissociá-las para amplificação.
   1. Coloque a suspensão celular em um tubo de 2 mL ou um tubo de 15 mL e centrífuga a 300 x g por 5 minutos.
   2. Remova o supernatante e adicione 500 μL de reagente de dissociação suave (por exemplo, Accumax) à pelota.
   3. Vórtice suavemente e incubar a suspensão celular com reagente de dissociação suave por 20 a 30 minutos a 37 °C.
      NOTA: Exceder o tempo de incubação no reagente de dissociação suave (Accumax) pode causar aumento anormal da mortalidade celular.
   4. Adicione 1,5 mL de Salina Tamponada fosfato (PBS) e centrífugue o tubo por 5 minutos a 300 x g.
   5. Despeje o supernasce e resuspense a pelota no meio M12 fresco para atingir a densidade de 1-5 células por μL.
   6. Semente a suspensão celular em novos poços de uma placa de fixação Ultra-Baixa: 10 mL para frascos T75, 2 mL para 6 placas de poço e 100 μL para 96 placas de poço

2. Imuno-fluorescência (IF) Coloração nas Seções da Esfera CTC

1. Centrifugar esferas CTC em um tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min, aspirar o supernasce e lavar a pelota duas vezes com PBS.
2. Resuspenque a pelota com 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) e incubar por 20 minutos no gelo. Centrifugar a suspensão a 300 x g e lavar duas vezes com 5 mL de PBS.
3. Resuspenque a pelota com (ou seja, 15 a 20 μL) de histogel quente e líquido. Com uma pipeta, pegue toda a suspensão e faça uma gota em uma superfície pré-identificada a 4 °C e deixe polimerizar por 5 a 10 minutos.
   NOTA: Trabalhe rápido para evitar a polimerização da suspensão na ponta.
4. Retire a gota sólida com a lâmina de um bisturi e insira-a em um de incorporação compartimentado.
5. Executar as seguintes etapas: inclusão de parafina, secção de parafina, reidratação de seção, recuperação de antígeno e incubação de anticorpos. Essas etapas são as mesmas de qualquer tumor ou órgão embutido na parafina e processado para coloração de imunofluorescência¹².
   NOTA: O pode ser armazenado em 70% de etanol a 4 °C até a incorporação da parafina.

3. Análise da Citometria

1. Centrifugar esferas CTC em um tubo de 15 mL a 300 x g por 5 min e lavar a pelota duas vezes com PBS.
2. Aspire o supernasciante e adicione 500 μL do reagente de dissociação suave à pelota.
3. Vórtice suavemente e incubar a suspensão celular com o reagente de dissociação suave por 20 a 30 min a 37 °C.
   NOTA: Excedendo 40 minutos de incubação no reagente de dissociação suave (Accumax) pode resultar em um aumento anormal da mortalidade celular.
4. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 300 x g, eliminar o supernasce e resuspensar a pelota em 5 mL de tampão de bloqueio (ou seja, PBS com 1% de albumina de soro bovino (BSA)).
5. Passe a suspensão da célula através de um coador de células de 40 μm para eliminar as esferas restantes.
6. Após a contagem, coloque 200.000 células em três tubos de triagem celular ativados por fluorescência (FACS), centrífuga a 300 x g por 5 min e remova o supernatante. Use um dos três tubos FACS como um controle que não receberá nenhum reagente de coloração.
7. De acordo com a folha de dados, adicione o anticorpo apropriado nos dois tubos FACS restantes (ou seja, um anticorpo conjugado contra a proteína de interesse, um controle de isótipo conjugado).
8. Após o tempo de incubação recomendado, adicione 300 μL do tampão de bloqueio para lavar as células, centrifugar os 3 tubos a 300 x g e aspirar o supernasce. Repita este passo duas vezes. Em seguida, resuspense a pelota com o tampão de bloqueio com um reagente de coloração de viabilidade celular (exceto para o controle do tubo FACS sem qualquer coloração).
9. Mantenha os tubos no gelo até a análise FACS. Use primeiro o tubo sem coloração para identificar o portão para a viabilidade celular e a coloração do anticorpo. Em seguida, analise o tubo FACS com o anticorpo conjugado contra a proteína de interesse, para quantificar a porcentagem de CTC expressando a proteína de interesse. O tubo FACS com o controle do isótipo conjugado não deve indicar uma mudança. Isso confirma que a mudança é específica para a proteína de interesse direcionada.
   NOTA: Se possível, use uma linha celular expressando um alto nível de interesse da proteína como controle positivo e uma linha celular que não expresse a proteína como um controle negativo.

4. Ensaio de Viabilidade de Luminescência (CellTiter-Glo)

1. CTCs dissociados de resuspend (conforme descrito na seção 1.4.5) em m12 médio. Conte as células e adapte a concentração celular a 200.000 células/mL.
2. Em uma placa ULA 96-well, semente 10.000 CTCs dissociados por poço, em 50 μL, e incubar a placa em hipóxia (2% O₂) por 24 h.
3. No dia seguinte, adicione 50 μL da droga testada aos CTCs. Recomenda-se anteriormente realizar uma titulação da concentração da droga, para determinar a concentração inibitória meia maximal (IC50). Trate alguns poços com veículo apenas para determinar a viabilidade celular basal.
   NOTA: O número de células semeadas pode diferir entre as linhas CTC, dependendo do tempo de duplicação. Além disso, as células devem ser semeadas em triplicados para minimizar a variabilidade dos resultados.
4. Incubar placas em hipóxia por mais 48 h.
5. No dia 3, coloque as placas cultivadas e o tampão de viabilidade da célula de luminescência e substrate à temperatura ambiente e reconstitua o substrato com um volume apropriado de tampão, de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Adicione 70 μL da mistura de viabilidade de luminescência em cada placa cultivada bem. Coloque placas em um agitador orbital por 20 minutos para induzir a lise celular e, em seguida, transfira 100 μL da mistura em uma placa multi-bem de paredes opacas, compatível com o luminômetro.
7. Deixe a placa descansar à temperatura ambiente, cubra-a com papel alumínio para estabilizar o sinal luminescente.
   NOTA: O sinal luminescente é estável por até 3 horas.
8. Gravar luminescência usando um leitor de microplaca (ou seja, Tecan Infinite 200 Pro).
9. Para análise de dados, calcule a média da unidade de luz relativa triplicada RLU por condição. Para avaliar a porcentagem de viabilidade de acordo com cada concentração de medicamentos necessária: (RLU de células tratadas/RLU de células não tratadas) x 100.

5. Injeções subcutâneas

1. Em um tubo de microcentrifuge, resuspend células em 100 μL de PBS estéril. Se o número de células injetadas for baixo, resuspend as células em 1:1 PBS/Matrigel, reduzidas em fatores de crescimento, para concentrar as células e promover a iniciação tumoral.
   NOTA: A densidade celular pode ser de 10 células (para desafiar a capacidade de iniciação do tumor) a 1 milhão de células, dependendo da questão científica e do objetivo do experimento.
2. Puxe o volume total em uma seringa de insulina.
3. Em um rato imuno-deficiente, belisque a pele do flanco entre o índice e o dedo anelar e insira suavemente a agulha na base da pele.
   NOTA: Este procedimento não é doloroso e é feito em camundongos conscientes.
4. Injete lentamente o volume no mesmo local para evitar a propagação das células. Isso vai criar uma pequena bolha sob a pele.
5. Aplique pressão suave no local da injeção para evitar o backflow do volume.
6. Monitore o crescimento do tumor, a cada dois dias, usando uma pinça.
7. Sacrifique o animal se o tumor exceder 1500 mm³. Dependendo da disponibilidade do material, eutanize os camundongos por dióxido de carbono ou gases anestésicos inalação ou por luxação cervical.

6. Injeção Intrasplenica

1. Antes de começar, autoclave os instrumentos cirúrgicos (tesoura e fórceps) a 124 °C por 15 min e limpe todas as superfícies do espaço de trabalho com 70% de etanol.
2. Em um tubo de microcentrifusagem, resuspend células em 50 μL de PBS estéril e armazená-las no gelo. A densidade celular pode passar de 0,5 para 1 milhão de células. Um número maior de células pode causar um desenvolvimento de coágulos na circulação sanguínea.
3. Antes de injetar as células, injete 100 μL de 0,015 mg/mL buprenorfina subcutânea, para alívio da dor.
4. Coloque o rato em uma câmara de indução, onde o isoflurane é mantido em 3%, por 2-3 min. Quando o animal não está mais respondendo ao movimento, coloque-o no lado direito em uma almofada de aquecimento e mantenha a anestesia usando uma máscara facial de circuito respiratório que fornece uma mistura de gás de O₂ e isoflurano.
5. Aplique lubrificante ocular sobre cada olho para evitar a secagem dos olhos durante a cirurgia. Desinfete a área torácica com solução povidone-iodo (ou seja, Betadine).
6. No lado dorsoventral, faça uma pequena incisão de 0,5 cm usando uma tesoura abaixo da 10ª costela falsa.
7. Levante suavemente o baço e coloque-o sobre gaze estéril. Usando uma seringa de insulina, injete os 50 μL de CTCs na ponta do baço. Certifique-se de manter a seringa ereta e esperar 3-5 minutos para evitar o fluxo de volta e, em seguida, remova a agulha.
8. Ligate os vasos esplênicos dos dois lados (artérias e veias) e remova o baço cortando diretamente acima das duas ligaduras. O baço é removido para evitar a formação indesejada de tumores neste órgão.
9. Costure o peritônio abdominal e, em seguida, a pele usando suturas estéreis degradáveis 5.0.
10. Mantenha o mouse aquecido até sua recuperação completa da anestesia.
11. Monitore o mouse 3 dias por semana para função corporal anormal, movimento anormal e postura e para perda de peso.
12. Sacrifique o animal quando os pontos finais humanos chegarem (aproximadamente 6 semanas após a cirurgia) para analisar a metástase hepática.

Resultados

Ambas as expressões EpCAM e CD26 observadas por IF (Figura 1A painel direito) e FACS ( Figura1B), respectivamente, indicam que a linha CTC é epitelial e exibem uma das marcas do CSC¹⁰. Este traço epitelial pode ser ainda caracterizado pela coloração com anticorpos direcionados contra outros marcadores epiteliais e mesenquimais. Assim, seria possível saber aproximadamente onde está a linha CTC ao longo do eixo epitelial-me...

Discussão

O protocolo descrito acima foi utilizado inicialmente para caracterização funcional ctc colorretal, mas pode ser usado para outros tipos de câncer, como o câncer de mama e pode ser adaptado para modelos de camundongos.

O verdadeiro fator limitante é o número de CTCs presentes na amostra de sangue e a eficiência da técnica utilizada para isolá-las e expandi-las. Várias técnicas de isolamento CTC foram descritas com base em propriedades específicas de CTC, como o Parsortix, um dispositivo microf...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução Accumax	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células Luminescentes	Promega	G7570
Corning Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz de Membrana Embasal	Corning	354230
Costar 24 poços Fundo Plano Transparente Ultra-Baixo Acessório Múltiplo Placas de poço,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, grau premium	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, grau premium	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Suplemento	Gibco
Penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL)	Gibco	15070063