Method Article

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

DOI:

10.3791/62330

⸱

March 23rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Abstract

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O revestimento do epitélio intestinal é composto por uma simples camada de células epiteliais especializadas que expõem seu lado apical ao lúmen e respondem a pistas externas. A recente otimização das condições de cultura in vitro permite a recriação do nicho de células-tronco intestinais e o desenvolvimento de sistemas avançados de cultura tridimensional (3D) que recapitulam a composição celular e a organização do epitélio. Organoides intestinais incorporados em uma matriz extracelular (ECM) podem ser mantidos para longo prazo e auto-organizado para gerar um epitélio bem definido e polarizado que engloba um lúmen interno e um lado basal exposto externo. Essa natureza restritiva dos organoides intestinais apresenta desafios no acesso à superfície apical do epitélio in vitro e limita a investigação de mecanismos biológicos como absorção de nutrientes e interações hospedeira-microbiota/hospedeiro-patógeno. Aqui, descrevemos dois métodos que facilitam o acesso ao lado apical do epitélio organoide e suportam a diferenciação de tipos específicos de células intestinais. Primeiro, mostramos como a remoção do ECM induz uma inversão da polaridade das células epiteliais e permite a geração de organoides 3D apical-out. Em segundo lugar, descrevemos como gerar monocamadas bidimensionais (2D) a partir de suspensões de células únicas derivadas de organoides intestinais, compostas de tipos celulares maduros e diferenciados. Essas técnicas fornecem novas ferramentas para estudar interações apical-específicas do epitélio com pistas externas in vitro e promover o uso de organoides como plataforma para facilitar a medicina de precisão.

Introduction

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O epitélio intestinal é o segundo maior epitélio do corpo humano e consiste em uma camada celular polarizada que facilita a absorção de nutrientes e age como uma barreira contra insultos ambientais1. Esta distinção entre os lados apical e basolateral permite que as células do epitélio realizem suas diversas funções. O compartimento apical é exposto ao lúmen e media as interações epiteliais com estímulos ambientais e microrganismos, ao mesmo tempo em que facilita a absorção de nutrientes. A superfície basolateral abriga junções intercelulares e aderências de matriz celular, ao mesmo tempo em que se interliga com células do sistema imunológico e outros tecidos2. Essas junções geram uma monocamada impermeável presa à membrana do porão, que age como uma barreira e fornece os nutrientes absorvidos ao tecido corporal circundante.

O estabelecimento de sistemas culturais capazes de recapitular essas funções in vitro tem sido desafiador3. Modelos in vitro convencionais utilizam linhas de células cancerígenas colorretais transformadas, como caco-2, para gerar culturas monocamadas 2D. Apesar de serem capazes de modelar múltiplas funções do compartimento absortivo, esses modelos não podem recapitular totalmente a composição e função do epitélio intestinal, que limitam as principais características funcionais e aplicações4,5.

O surgimento de organoides como um avançado sistema de cultura 3D gerado a partir de células-tronco que podem se auto-organizar e diferenciar-se para tipos de células específicas de órgãos, foi um avanço no estudo in vitro do epitélio intestinal6. Os organoides intestinais estão incorporados em uma matriz extracelular (ECM) que se assemelha à lamina basal e forma junções de matrizcelular que permitem que essas culturas mantenham a polaridade apicobasal do epitélio. Os organoides exibem uma arquitetura fechada na qual o lado apical é exposto ao compartimento luminal, imitando assim a estrutura do intestino. Embora essa organização fechada ofereça a oportunidade de estudar funções específicas de orientação, limita investigações que requerem acesso ao lado apical do epitélio. Diferentes abordagens têm sido tomadas para superar essas limitações em 2D e 3D, incluindo fragmentação organoide, microinjeção organoide e geração de culturas monocamadas7. A fragmentação organoide causa a perda da organização estrutural e a destruição das junções celulares, o que permite a exposição da superfície apical do epitélio ao meio. Esta técnica aproveita a capacidade regenerativa dos fragmentos para reformar organoides quando semeada em uma matriz extracelular e tem sido usada para modelar doenças infecciosas e interações hospedeiro-patógeno8,9. No entanto, o acesso simultâneo à superfície apical e basal também pode provocar respostas não específicas à infecção.

Uma abordagem alternativa que permite o acesso à superfície apical e preserva tanto a arquitetura estrutural quanto as junções celulares é representada pela microinjeção de fatores no lúmen dos organoides. Este método tem sido amplamente utilizado para estudar interações hospedeiro-patógeno e modelar os efeitos de Cryptosporidium10, H. pylori11e C. difficile12 no epitélio gastrointestinal in vitro. Utilizando técnicas semelhantes, foi determinado o potencial mutagênico dos pks+ cepa de E. coli no epitélio intestinal13. Embora eficaz, a microinjeção organoide é uma tarefa laboriosa e ineficiente considerando o alto número de organoides que precisam ser injetados para obter efeitos mensuráveis e, portanto, limita sua aplicação para ensaios de alto rendimento.

Avanços recentes com organoides intestinais também forneceram métodos para o estabelecimento de culturas organoides monocamadas 2D, expondo assim sua superfície apical14,15,16,17. Essas monocamadas derivadas de organoides recapitulam propriedades in vivo do epitélio intestinal. Eles exibem uma composição celular fisiologicamente relevante, contendo populações de células-tronco diferenciadas e tronco e modelam a diversidade através do eixo cripto-villus. À medida que a polaridade apicobasal é mantida, as propriedades monocamadas inerentes permitem o fácil acesso dos lados apical e basolateral e as trocas de mídia podem imitar o fluxo intestinal e a remoção de resíduos permitindo a cultura de longo prazo. Essas características tornam as monocamadas derivadas de organoides favoráveis a estudos com foco em interações luminais e fornecem um modelo superior para integridade da barreira epitelial e permeabilidade18,19.

Estudos têm demonstrado que a polaridade das células epiteliais é fortemente regulada pelas proteínas ECM nos esferoides MDCK20,21 e recentemente em organoides intestinais humanos22. A remoção de componentes de ECM ou inibição do receptor integrino que media as junções da matriz celular resulta em uma inversão de polaridade dos organoides intestinais e na exposição do lado apical do epitélio ao médio22. Essa abordagem tem atraído o interesse de pesquisadores que trabalham com doenças infecciosas, pois permite fácil acesso ao lado apical em 3D e torna-o favorável a ensaios de alto rendimento. Aqui, descrevemos um protocolo modificado baseado no recente trabalho do laboratório Amieva22,que facilita a geração de organoides intestinais 3D que facilmente expõem seu lado apical. Também delineamos um protocolo que pode gerar de forma eficiente e reprodutivelmente monocamadas 2D intestinais derivadas de organoides intestinais.

Protocol

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A derivação das culturas organoides intestinais humanas foi realizada como descrito em outros lugares23. Os organoides foram mantidos na cultura, conforme descrito pela Folha de Informações do Produto (PIS) para o Meio de Expansão Organoide Intestinal (refere-se à Tabela de Materiais).

1. Inversão da polaridade organoide intestinal

NOTA: Esta seção delineará o protocolo para inverter a polaridade dos organoides intestinais 3D. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para o estabelecimento de organoides polarizados com uma superfície apical exposta em suspensão em uma placa de cultura. Este protocolo destina-se a um ensaio de ponto final, embora os organoides possam ser mantidos nesta conformação por mais de 2 semanas e manter uma pequena população de células-tronco que lhes permite restabelecer organoides apical-in após a passagem.

  1. Revestimento de louça e tubos com solução anti-aderente
    NOTA: Para maximizar o número de organoides intestinais apical-out e evitar o apego indesejável ao material cultural, o pré-revestimento do material cultural é geralmente necessário. A seção abaixo descreve o revestimento da cultura e do plasticware com solução anti-aderente.
    1. Placas de cultura de revestimento a serem usadas na parte de suspensão do protocolo da seguinte forma.
      1. Adicione 0,5 mL de solução anti-aderente a cada poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços.
      2. Gire a placa para espalhar a solução uniformemente pela superfície e pelas paredes dos poços.
      3. Centrifugar a placa a 1.300 x g por 10 min.
      4. Remova a solução anti-aderente de cada poço usando um aspirador ou uma pipeta de 1 mL.
      5. Lave os poços com 1 mL de DMEM/F-12 com HEPES de 15mM (DMEM/F12).
      6. Encha cada um lavado bem com 0,5 mL de DMEM/F-12 e armazene a placa a 37 °C e 5% de CO2 até o uso.
        NOTA: Se não forem utilizadas imediatamente, as placas revestidas podem ser mantidas na incubadora por pelo menos 1 semana.
    2. Revestimento de tubos cônicos de 15 mL usados neste protocolo da seguinte forma.
      1. Adicione 4 mL de solução anti-aderente ao tubo cônico de 15 mL.
      2. Gire o tubo para espalhar a solução uniformemente pela superfície das paredes.
      3. Centrifugar o tubo a 1.300 x g por 10 min.
      4. Remova a solução anti-aderente do tubo.
      5. Lave o tubo 1x com 5 mL de DMEM/F-12 e aspire o DMEM/F-12. Os tubos estão prontos para uso.
        NOTA: Se não for usado imediatamente, adicione 5 ml de DMEM/F12 e armazene a 4 °C. Os tubos revestidos podem ser mantidos a 4 °C por pelo menos uma semana.
  2. Inversão de polaridade de organoides intestinais por cultura de suspensão
    NOTA: As etapas abaixo descrevem a inversão de organoides intestinais previamente cultivados sob as condições padrão da cúpula do ECM. Os procedimentos descritos aqui são para um poço de uma placa de 24 poços. Se estiver usando outros produtos de cultura, ajuste os volumes de acordo.
    1. Remova e descarte cuidadosamente o meio de cada poço contendo organoides sem interromper a cúpula da matriz extracelular da membrana do porão. Certifique-se de que o tamanho dos organoides é de 150-250 μm de diâmetro (tipicamente no dia 3-5) antes de iniciar o protocolo de inversão.
    2. Adicione 1 mL de solução de dissociação gelada em cada poço.
    3. Incubar à temperatura ambiente (15-25 °C) por 1 min.
    4. Adicione pelo menos 2 mL de solução anti-aderente a um tubo de 15 mL a ser usado para revestir pontas plásticas.
    5. Adicione pelo menos 2 mL de DMEM/F-12 a um tubo de 15 mL a ser usado para lavar pontas plásticas enxaguadas com solução anti-aderente.
    6. Cubra uma ponta de pipeta de 1 mL com solução anti-aderente, pipetando 1 mL de solução três vezes no tubo com solução anti-aderente a partir da etapa 1.2.4.
    7. Lave a ponta no DMEM frio/F-12, tubos de 1 mL de solução três vezes no tubo com DMEM/F-12 a partir da etapa 1.2.5.
    8. Usando a ponta revestida, desaloja cuidadosamente as cúpulas, pipetando lentamente. Tome cuidado para não interromper ou fragmentar os organoides.
    9. Transfira a suspensão organoide para uma placa tratada com solução anti-aderente (a partir da etapa 1.1.1).
    10. Coloque a placa em um shaker a 4 °C por 30 min. Um agitador de giroscópio pode ser usado a 70 rpm.
      NOTA: Evite tremores severos, como o vórtice da amostra, pois pode resultar em fragmentação organoide. A formação de bolhas e espuma pode indicar agitação severa.
    11. Depois de 30 min, remova a placa. Usando uma ponta de pipeta de 1 mL revestida com solução anti-aderente, pipeta suavemente a solução para cima e para baixo.
    12. Coloque a placa em um shaker a 4 °C por 15 min. Um agitador de giroscópio pode ser usado a 70 rpm.
    13. Remova a placa e deixe os organoides se estabelecerem pela gravidade (1-2 min à temperatura ambiente). Observe a placa sob o microscópio para verificar a sedimentação organoide.
      NOTA: Evite agitação extensiva da placa, pois pode causar o resuspendido dos organoides.
    14. Após os organoides se estabelecerem, remova o máximo possível da solução de dissociação e lave adicionando 1,5 mL de DMEM/F-12.
    15. Permita que os organoides sedimentem e remova o máximo possível do supernante. Repita o passo de lavagem mais uma vez.
      NOTA: Observe a placa sob o microscópio para verificar a sedimentação organoide antes de realizar qualquer etapa de lavagem.
    16. Remova o máximo possível do DMEM/F-12 e adicione 0,5 mL de Meio de Expansão Organoide Intestinal. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
    17. No dia seguinte, realize uma mudança média parcial inclinando a placa em um ângulo de 25 a 30 graus, e removendo o meio ao longo da parede do poço. Remova 0,4 mL de cuidado médio para não remover organoides suspensos.
    18. Adicione 0,4 mL de expansão organoide intestinal. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias.
      NOTA: Após 3 dias, a maioria dos organoides deve ter uma polaridade apical-out, mas grandes agregados podem ter se formado.
    19. Se os agregados tiverem se formado, use uma pipeta de 1 mL com uma ponta revestida com solução anti-aderente (conforme descrito nas etapas 1.2.6 e 1.2.7) para esmatar os agregados, pipetando para cima e para baixo 20 vezes enquanto pressiona a extremidade da ponta na parte inferior da placa.
    20. Coloque a placa a 37 °C e 5% de CO2 e realize uma mudança média completa no dia seguinte com o meio de Expansão Organoide Intestinal (conforme descrito na seção 1.2.17).
    21. Após 2 dias (dia 5 em suspensão), organoides intestinais apical-out podem ser usados em ensaios a jusante.

2. Estabelecimento de monocamadas de células intestinais 2D e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) derivadas de organoides intestinais 3D derivados

NOTA: Esta seção delineará o protocolo para a geração de culturas monocamadas 2D a partir de organoides intestinais. Esta técnica oferece a vantagem de estabelecer uma cultura monocamada confluente e polarizada com uma superfície apical exposta em uma placa de cultura tecidual contendo inserção de membrana de cultura celular. Embora a monocamada comece a se diferenciar no formato submerso e monocamada, uma diferenciação adicional da monocamada pode ser alcançada mudando para uma cultura ALI depois de ter atingido a confluência. Tanto os protocolos monocamadas quanto os subsequentes ali destinam-se a ensaios de ponto final e, embora a cultura da monocamada mantenha uma pequena população de células-tronco, nenhum deles pode ser dividido eficientemente e aprovado após sua criação.

  1. Preparando mídia e placas para a cultura da monocameira intestinal
    1. Prepare o Meio de Diferenciação Organoide Intestinal conforme delineado pelo fabricante para cultura monocamide (ver Lista de Materiais). Adicione Y-27632 apenas a um volume de meio que será usado dentro de 1 semana em uma concentração final de 10 μM. Se não for usado imediatamente, armazene a 4 °C.
    2. Trippsina pré-quente EDTA (0,05%) a 37 °C.
    3. Pelo menos 2 h antes de semear culturas de monocamadas, prepare uma solução de revestimento ECM de 2% da seguinte forma.
      1. Descongele o ECM no gelo e adicione 1:50 ao PBS frio e estéril para preparar uma solução de 2%. Prepare quantidades suficientes para adicionar 100 μL ao poço superior de cada 0,33 cm (0,33 cm2)inserção de membrana de cultura celular a ser usada. Ajuste o volume adequadamente para culturas maiores ou menores.
    4. Adicione 100 μL a cada poço e incuba cada placa a 37 °C e 5% de CO2 até que seja necessário (pelo menos 2 h antes da semeadura).
  2. Dissociando organoides intestinais para geração e cultura de monocamadas
    1. Remova um número apropriado de poços de cultura organoide da incubadora. Consulte a Tabela 1 para obter o número recomendado de poços para colher para vários produtos de cultura.
    2. Aspire todos os meios das culturas organoides sem perturbar a cúpula do ECM.
    3. Adicione 1 mL de solução de dissociação a cada poço.
    4. Incubar em temperatura ambiente (15-25 °C) por pelo menos 1 min.
    5. Usando uma pipeta de 1 mL, pipeta vigorosamente para cima e para baixo para interromper a cúpula e liberar os organoides.
    6. Acumule os organoides suspensos de cada poço em um tubo cônico de 15 mL. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos com agitação suave ou balanço. Organoides para semeadura de vários poços podem ser agrupados nesta etapa, até 10 mL de volume em cada tubo.
    7. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    8. Remova e descarte o supernaspe. Adicione 5 mL DMEM/F-12 para organoides resuspend.
    9. Misture e centrífuga novamente a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    10. Aspirar o supernante, removendo o máximo possível, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
      NOTA: Alguns ECM residuais podem permanecer na pelota; no entanto, isso não deve afetar significativamente a dissociação dos organoides.
    11. Adicione 1 mL de organoides pré-aquecidos (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) aos organoides resusgasuspend. Misture bem para garantir uma suspensão uniforme. Adicione a um adicional de 1 mL de Trypsin-EDTA para um grande número de células, ou se uma quantidade significativa de ECM permanece.
    12. Incubar a 37 °C por 5-10 min.
    13. Misture bem com uma pipeta de 1 mL para interromper os organoides o máximo possível. Organoides devem ser completamente dissociados em células únicas ou pequenos fragmentos. Se fragmentos maiores ou organoides inteiros permanecerem após a pipetação completa, continue a incubação com Trypsin-EDTA a 37 °C por mais 3-5 min.
      NOTA: Não incubar com Trypsin-EDTA por mais de 20 minutos, pois isso pode resultar em uma perda maior de viabilidade celular.
    14. Uma vez que os organoides são suficientemente dissociados, adicione um volume igual de DMEM/F-12 (por exemplo, 1 mL DMEM/F-12 por mL Trypsin-EDTA) e pipeta para cima e para baixo para misturar completamente. Inativar Trypsin-EDTA adicionando 10% de FBS ao DMEM/F-12 nesta etapa.
    15. Fragmentos de centrífuga a 200 x g por 5 min a 2-8 °C.
    16. Se os organoides dissociados não conseguirem pelotas, isso é comum e pode ser devido a um acúmulo de muco liberado pelas células dissociadas. Neste caso, misture as células completamente por pipetar para cima e para baixo e centrifuá-las novamente a 200 x g por 5 min a 2-8 °C.
    17. Remova cuidadosamente o máximo de supernasce possível, deixando apenas a pelota celular.
    18. Resuspense as células em 100 μL de meio de diferenciação organoide intestinal (com 10 μM Y-27632) para cada poço a ser semeado. Ajuste o volume adequadamente para tamanhos de poços maiores ou menores.
    19. Retire as placas revestidas da incubadora (preparada na etapa 3.1.4) e remova o excesso de ECM de cada poço.
    20. Adicione 100 μL da suspensão celular ao poço superior de cada inserção de cultura celular.
    21. Adicione 500 μL de meio de diferenciação organoide intestinal ao poço inferior de cada inserção de cultura celular.
    22. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
    23. Substitua o meio tanto nos poços superiores quanto inferiores a cada 2 a 3 dias. As culturas de monocamadas devem atingir a confluência dentro de 7 dias e muitas vezes atingirão a confluência dentro de 2-3 dias.
  3. Estabelecendo uma cultura de Interface Ar-Líquido (ALI)
    NOTA: Se desejar, uma maior diferenciação de uma cultura de monocamada intestinal submersa pode ser realizada transitando a cultura monocamada submersa para uma cultura ALI. Este método de cultura permitirá um aumento no número de tipos de células diferenciadas, particularmente células da linhagem secreta, como cálice e células enteroendócrinas.
    1. Estabeleça uma cultura monocamada em uma inserção de cultura celular descrita acima nas etapas 2.2.1-2.2.23 e mantenha essa cultura em 100% de confluência por pelo menos 4 dias.
    2. Para estabelecer uma cultura ALI, remova o meio dos poços superiores e inferiores. Adicione o meio de diferenciação organoide intestinal fresco (com Y-27632) ao poço inferior, deixando o poço superior vazio.
    3. Incubar a 37 °C e 5% de CO2.
    4. Substitua o meio no poço inferior a cada 2-3 dias e deixe que a monocamheira se diferencie por pelo menos 1 semana.
    5. Enxágüe o poço superior com PBS estéril para remover o excesso de acúmulo de muco, se necessário.
      Nessas condições, a cultura ALI pode ser mantida por pelo menos 2-3 semanas.

Results

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Os organoides foram gerados a partir de amostras de biópsia seguindo o protocolo descrito anteriormente23 e no PIS para o Meio de Expansão Organoide Intestinal (ver Tabela de Materiais). Figura 1A, Painel Esquerdo,mostra o fenótipo dos organoides intestinais cultivados em uma cúpula com meio de expansão organoide intestinal. Nestas condições culturais, os organoides apresentam uma morfologia cística definida por um epitélio fino (10-25 μm) que inclui um lúmen (Figura 1A, Painel Direito). Nesta fase, o lado apical do epitélio intestinal enfrenta o lúmen, enquanto o lado basolateral entra em contato com a matriz extracelular circundante. Quando a maioria dos organoides atingiu o tamanho desejado, a matriz extracelular foi removida, e os organoides foram então cultivados em suspensão. A perda da ligação celular à matriz extracelular desencadeia um processo de inversão nos organoides, resultando em uma reversão da polaridade do epitélio organoide, expondo o lado apical do epitélio ao meio de crescimento e internalizando o lado basolateral.

Em algumas culturas, organoides em suspensão agregam e fundem, efeito mais profundo durante os primeiros 3 dias(Figura 1B, Painel Esquerdo). A aplicação de uma técnica de corte permite o desprendimento dos organoides e a continuação das culturas por dias com reaggregação mínima(Figura 1B, Painel Direito).

Organoides intestinais cultivados em cúpulas de ECM continuam a expandir -se (Figura 1C, Painel Esquerdo) e apresentam formação espontânea de estruturas secundárias de brotamento, assemelhando-se a pequenas criptas, no lado basolateral do epitélio em torno do lúmen ( Figura1C, PainelDireito). Ao mesmo tempo, os organoides mantidos por 5 dias na ausência de matriz extracelular continuam a se desenvolver em suspensão(Figura 1D, Painel Esquerdo). A inversão da polaridade é caracterizada pelo espessamento (30-40 μm) do epitélio que circunda o núcleo dos organoides e o aparecimento de uma variedade de morfologias: alongada(Figura 1D, Painel Direito e Figura Suplementar 1A),cística (Figura Suplementar 1B)e irregular(FiguraSuplementar 1C). Isso é frequentemente combinado com um encolhimento do espaço luminal dentro do organoide, impactando seu tamanho geral.

A inversão eficiente também pode ser confirmada analisando a expressão de marcadores de polaridade específicos do intestino. Os organoides intestinais apical-out mostram uma localização distinta dos núcleos em direção ao lúmen do organoide, conforme indicado pelo sinal 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI). A expressão de marcadores apical, como VILLIN (Figura 2A) e ZO-1 (Figura 2B),é detectada no lado externo do epitélio que está exposto ao meio. Esta localização contrasta fortemente com a observada em organoides intestinais cultivados em ECM. Organoides incorporados de matriz extracelular manchados para núcleos (DAPI), VILLIN(Figura 2C)e ZO-1 (Figura 2D) demonstram uma polaridade apicobasal onde o lado apical está voltado para o lúmen da organoide.

A remoção completa do ECM é necessária para obter uma inversão eficiente de polaridade dos organoides intestinais. Ocasionalmente, uma porção de organoides encontrados em culturas de suspensão cercadas por resíduos de ECM, mostra uma morfologia cística que sugere uma falha na inversão polaridade do epitélio (Figura Suplementar 2A). A análise da coloração imunofluorescente, realizada nessas organoides, fornece evidências da posição basolateral dos núcleos (DAPI) ao longo do epitélio e da expressão do ZO-1 no lado apical que enfrenta o lúmen da organoide (Figura Suplementar 2B)confirmando que a remoção incompleta do ECM causa retenção da polaridade apicobasal de forma semelhante às organoides incorporadas ao ECM.

O protocolo para o estabelecimento de culturas de monocamadas intestinais resulta em uma cultura monocamada confluente dentro de 7 dias após a semeadura e a cultura muitas vezes atingirá a confluência dentro de apenas 2-3 dias. Um dos principais determinantes do sucesso é o número e a qualidade das células usadas para semear a monocamada. Figura 3A, Painel Esquerdo fornece um exemplo de uma densidade ideal de semeadura de aproximadamente 150.000 células em uma inserção de membrana de cultura celular de 6,5 mm. Esse número não é fixo e pode ser altamente variável com base no doador e na qualidade da cultura organoide de origem; portanto, o número do celular deve ser otimizado com base nessas variáveis. Se a densidade de semeadura for muito baixa, ou de má qualidade(Figura 3A, Painel Direito), pode não haver anexos suficientes para formar uma cultura monocamada confluente.

Uma vez estabelecida a monocamada(Figura 3B),as células formam junções apertadas, criando uma aparência de paralelepípedo(Figura 3B, Painel Esquerdo). Se não conseguirem formar uma monocamada confluente(Figura 3B, Painel Direito),a aparência da monocamada muitas vezes será "irregular", com regiões de fixação celular de boa qualidade, mas com lacunas maiores entre essas regiões. Essas culturas não fornecem uma barreira funcional entre os compartimentos basal e apical e não são adequadas para os ensaios descritos. Uma monocamada confluente orienta sua borda de escova contendo VILLIN em direção ao lado apical do epitélio, com seu núcleo posicionado em direção ao polo basolateral da célula (Figura 4B). Entre as células, são formadas junções intercelulares compostas por complexos multiprofissionais, incluindo o ZO-1(Figura 4B). Sua presença é fundamental para fornecer a função barreira da cultura epitelial.

Uma vez confluente, a transição para uma cultura ALI induz ainda mais diferenciação da cultura (Figura 3C). Pequenas células de cálice redondas aparecem e a monocamada em si assume uma aparência mais dobrada. Embora as células de cálice estejam presentes dentro do epitélio da cultura submersa(Figura 4A),elas são mais proeminentes após a diferenciação ali. Células cálices presentes dentro do muco do epitélio secrete, levando a uma aparência nebulosa sobre o topo do epitélio. As células de cálice e o muco secretado podem ser visualizados pela coloração da proteína de mucina secretada, MUC2 (Figura 4A,C e D) e o aumento da população de células de cálice pode ser medido por um aumento na expressão MUC2 (Figura Suplementar 3A). Não é necessário remover esta camada de muco semelhante a gel e ela grudará na superfície do epitélio e permanecerá seguindo lavagens repetidas. Se for necessário remover a cultura com um composto mucolítico, como 10 mM N-acetil cysteine ou 50 μg/mL DTT remove o excesso de muco. Além do aumento da população de células de cálice, a interface ALI também aumenta a presença de células enteroendócrinas (conforme indicado pela expressão CHGA) (Figura Suplementar 3B) e enterócitos maduros (conforme indicado pela expressão KRT20) (Figura Suplementar 3C).

Imagem microscópica de agregados celulares e células individuais, destacando a estrutura celular em pesquisa.
Figura 1: Estágios da geração organoide intestinal apical-out. (A) Imagens representativas de uma cúpula com organoides do tamanho desejado no dia 4 (Painel esquerdo, barra de escala = 500 μm). Os organoides são de parede fina, com compartimento luminal aberto (Painel Direito, Barra de Escala = 100 μm). (B) Imagem representativa de um poço com agregação extensiva após 3 dias de suspensão (Painel esquerdo, barra de escala = 200 μm). Imagem de fragmentos de aglomerados logo após a tesoura (Painel Direito, Barra de Escala = 200 μm). (C) Imagem representativa de organoides intestinais na cúpula no dia 7. Os organoides apresentam um lúmen expandido com a formação de pequenos botões no lado basolateral do epitélio (ampliação de 20x esquerda, ampliação direita de 100x da região marcada, barra de escala = 200 μm). (D) Imagem representativa dos organoides intestinais após a remoção do ECM e cultura de suspensão subsequente por 5 dias. Os organoides obtêm uma morfologia densa com um epitélio espesso e expõem seu lado apical ao meio. (Ampliação de 20x esquerda, ampliação direita de 100x da região marcada, barra de escala = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de imunofluorescência; tecido epitelial; Marcadores DAPI, Villin, E-Cadherin, ZO-1; junções celulares.
Figura 2: Coloração imunofluorescente para marcadores de polaridade celular em organoides intestinais. Apical-out(A,B), e organoides intestinais orientados apical -out(C,D) foram manchados com marcadores apical ZO-1 e VILLIN, e com marcador epitelial E-CADHERIN (vermelho). DAPI (azul) foi usado para visualizar núcleos. Painéis esquerdos exibem imagens tiradas em ampliação de 25x e painéis à direita exibem imagens de diferentes organoides na ampliação de 63x (apenas o painel C exibe ampliação de 25x e 63x do mesmo organoide). (A) Organoides intestinais apical-out manchados com VILLIN (verde) e E-CADHERIN (vermelho) indicam a exposição do lado apical ao médio. (B) Organoides intestinais apical-out manchados com ZO-1 (verde) e E-CADHERIN (vermelho) mostram a presença de junções apertadas e reversão da polaridade apicobasal. (C) Organoide intestinal embutido em matrigel manchado com VILLIN (verde) e E-CADHERIN (vermelho) mostrando o lado apical voltado para o lúmen organoide. (D) Organoides intestinais embutidos em matrigel manchados com ZO-1 (verde) e E-CADHERIN (vermelho) indicando a presença de junções apertadas apical voltadas para o lúmen do organoide. (Barra de escala = 100 μm). Os organoides foram manchados pela imunofluorescência e imageados usando protocolos publicados anteriormente24,25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de microscopia de culturas de células A, B, C; padrões de crescimento celular, análise morfológica.
Figura 3: Estabelecimento de culturas de monocamadas intestinais. (A) Imagem representativa de organoides 3D após o tratamento com 0,05% Trypsin-EDTA. Organoides são dissociados a células únicas ou pequenas células-aglomerados em preparação para culturas de monocamadas semeadas. Painel Esquerdo: exemplo de uma densidade de semeadura ideal para uma cultura monocamada, aproximadamente 150.000 células por 100 μL em uma inserção de membrana de cultura celular de 6,5 mm. Painel Direito: exemplo de densidade de semeadura subótima em <50.000 células por 100 μL em uma inserção de membrana de cultura celular de 6,5 mm. (B) Imagem representativa de brightfield de uma cultura monocamada submersa. Painel esquerdo: camada 100% confluente com a aparência característica de paralelepípedos. Painel Direito: aproximadamente 50% monocamada confluente. As lacunas observadas na monocamada (indicada pela linha tracejada) se fecham ao longo do tempo devido à contínua proliferação das células-tronco intestinais. (C) Imagem representativa brightfield de uma cultura ALI diferenciada em 7 dias. (Barra de escala = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens de microscópio confocal; marcadores de células epiteliais DAPI, MUC2, VILLIN, ZO-1, E-Caderina.
Figura 4: Coloração imunofluorescente para marcadores celulares diferenciados em culturas de monocamadas. (A) Imagem de pilha de Z de coloração imunofluorescente de uma cultura monocamada submersa para a proteína mucina MUC2, indicando a presença de células de cálice dentro da cultura monocamada (verde = MUC2, azul = DAPI). (B) Imagem em pilha de Z de coloração imunofluorescente de uma monocamada submersa. A coloração villin (verde) ao longo da extremidade apical do epitélio indica a presença de uma borda de escova e a coloração ZO-1 (vermelha) indica a presença de junções apertadas entre as células (azul = DAPI). (C) Imagem em pilha de Z de coloração imunofluorescente de uma cultura monocamada diferenciada ali para a proteína mucina MUC2, indicando a presença de um número significativamente maior de células de cálice dentro da cultura monocamada ALI (verde = MUC2, azul = DAPI). (D) Crioseção da cultura monocamada diferenciada ali, manchada para a presença de MUC2 (verde) e E-CADHERIN (vermelho) indicando a presença de células de cálice no epitélio e a secreção de muco ao longo do lado apical da cultura monocamada. (Barra de escala = 200 μm). As culturas de monocamadas foram manchadas pela imunofluorescência e imagens utilizando protocolos publicados anteriormente26,27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Espectro de fenótipos de organoide intestinal apical-out na suspensão da cultura. (A,B,C) Imagens representativas adicionais de morfologias organoides intestinais mantidas em suspensão 5 dias após a remoção do ECM. A polaridade organoide inverteu. Os organoides tornaram-se mais densos com um epitélio espesso e o lado apical dos organoides está voltado para fora. Os organoides podem apresentar uma variedade de morfologias: alongadas (A),císticas (B) e irregulares(C). (Barra de escala = 100 μm). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Os organoides intestinais não conseguem inverter a polaridade na presença de meio de matriz de membrana de porão residual em culturas de suspensão. (A) Imagem representativa da remoção incompleta do ECM e falha em inverter a polaridade dos organoides. Os remanescentes de matrigel estão presentes ao redor dos organoides e contribuem para a manutenção da polaridade epitélio orientada para o apical-in. Organoides mostram uma morfologia cística com um epitélio fino em torno do lúmen (Barra de escala = 200 μm). (B) Imagem representativa de um organoide não invertido encontrado em condições de cultura de suspensão. Núcleos (azul = DAPI) e E-CADHERIN (vermelho) estão posicionados para o lado basolateral, ZO-1 (verde) é expresso para o lado apical que enfrenta o lúmen do organoide. (Barra de escala = 100 μm). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Expressão genética de marcadores celulares diferenciados em culturas monocamadas. (A,B,C) Expressão de MUC2, CHGAe KRT20 em cultura monocamada submersa e diferenciada ali gerada no Meio de Diferenciação Organoide Intestinal em relação a uma cultura organoide 3D cultivada com meio de expansão organoide intestinal estabelecida via qPCR. O estabelecimento de uma cultura monocamada submersa aumenta a expressão de cada marcador celular diferenciado; no entanto, a diferenciação como cultura ALI aumenta a expressão de cada marcador exponencialmente. Barras de erro = +/- SEM. Clique aqui para baixar este Arquivo.

MONOCAMADASNÚMERO DE POÇOS DE ORGANOIDES INTESTINAIS PARA COLHER (a partir de 50 μL cúpula/por poço a ser semeado)
Inserção transwell de 6,5 mm1 - 2 poços
Inserção transwell de 12 mm3 - 4 poços
Placa de 6 poços6 - 8 poços
Placa de 24 poços3 - 4 poços
Placa de 96 poços1 - 2 poços

Tabela 1: Número de poços de organoides intestinais para colher para vários produtos culturais

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelos organoides epiteliais tornaram-se plataformas poderosas que podem ser usadas para modelar a organização tecidual, a progressão da doença e identificar terapêuticas23,28,29. A microinjeção organoide tem adicionado valor à capacidade dos organoides de modelar doenças infecciosas, pois permite a interação do patógeno com o lado apical do epitélio hospedeiro. Os recentes avanços nas técnicas de microinjeção otimizaram a velocidade de injeção em organoides e alcançaram uma taxa de até 90 organoides injetados por hora. A função de barreira nos organoides injetados foi preservada, e a baixa concentração de oxigênio dentro do lúmen permitiu a sobrevivência da bactéria injetada obrigatória-anaeróbica30. No entanto, estudos têm notado a presença de heterogeneidade em populações organoides dentro do mesmo poço. Essas diferenças foram observadas em tamanho e forma31, níveis de expressão dos genes-chave32,bem como taxas de proliferação33. Respostas diferenciadas dentro da mesma população organoide a compostos como forskolin e PGE2, ou à toxina da cólera, também foram descritas28,33. Esses resultados destacam a necessidade de altos números organoides em estudos e limitam a utilização da injeção luminal.

A cultura organoide convencional baseia-se no encapsulamento e propagação de organoides em um hidrogel. No entanto, hidrogéis podem apresentar limitações na difusão e introduzir gradientes de concentração, o que pode aumentar a heterogeneidade34. Além disso, a alta variabilidade tem sido documentada, não apenas entre culturas e doadores, mas também dentro de condições experimentais individuais. A fonte do doador, as propriedades bioquímicas do hidrogel e a heterogeneidade intrínseca do organoide como sistema cultural são fatores importantes que podem aumentar a variabilidade experimental e limitar a reprodutibilidade dos resultados obtidos em aplicações a jusante. Ambos os métodos aqui descritos fornecem um meio simples de expor o lado apical do epitélio, permitindo a modelagem de compostos e patógenos de interesse, adicionando-os diretamente ao meio da cultura. A redução da utilização de hidrogel pode limitar a variabilidade experimental das fontes técnicas de erro.

Os organoides intestinais apical-out mantêm características-chave do sistema do modelo organoide e sua escalabilidade os tornam mais favoráveis a ensaios de alto rendimento, em comparação com a monocamada 2D. No entanto, como os organoides mantêm sua estrutura 3D, a acessibilidade do lado basal é limitada e pode dificultar estudos que requerem acesso a ambos os lados simultaneamente.

Demonstramos que a inversão de polaridade dos organoides intestinais depende da eficiente e absoluta remoção do ECM, preservando também a estrutura intacta dos organoides. Tanto o uso da solução de dissociação para remover o ECM quanto a solução anti-aderente para prevenir a adesão dos organoides ao plasticware contribuíram para amenização da eficiência global do protocolo publicado por Co, J. Y. e colegas22, particularmente no que diz respeito ao número de organoides apical-out produzidos para aplicações a jusante.

Além disso, observamos que nosso protocolo suporta uma inversão mais eficiente de organoides menores que 250 μm e o uso de organoides maiores pode resultar em uma redução da produção organoide, devido à fragmentação causada pela pipetação. Pontas largas, como as indicadas na Tabela de Materiais,podem permitir a utilização de organoides maiores. No entanto, pontas largas são menos eficazes na dissociação de ECM quando comparadas às pontas padrão devido à menor força mecânica aplicada. Portanto, pode ser necessária a repetição das etapas 1.2.9-1.2.11 para interrupção suficiente e remoção completa de todos os remanescentes de ECM ao trabalhar com organoides maiores.

Organoides em suspensão podem sobreviver por pelo menos 2 semanas. Após esse período, observamos alterações de morfologia e aumento do número de mortes celulares. A presença de células proliferadoras nos organoides apical-out22 permite o restazio de culturas organoides intestinais apical-in. Isso pode ser conseguido dissociando organoides apical-out para células únicas e incorporando-as em ECM com Meio de Expansão Organoide Intestinal.

Uma limitação frequentemente encontrada em protocolos que descrevem o estabelecimento de organoides intestinais em culturas de suspensão é a geração de grandes agregados. Isso impacta várias variáveis como eficiência, reprodutibilidade das características morfológicas, permeabilidade aos compostos e sinalização paracrina. Semelhante ao protocolo publicado por Co, J. Y. e colegas, aqui confirmamos ter obtido inversão de polaridade de pelo menos 97% de todos os organoides suspensos sem tesourar após 3 dias de suspensão. No entanto, ao contrário da publicação, introduzimos uma etapa de dissociação mecânica a fim de reduzir a formação de grandes agregados e aumentar o rendimento. Uma vez que este procedimento pode danificar o epitélio dos organoides, estendemos o período de incubação dos organoides por mais 2 dias para permitir a recuperação completa do epitélio e garantir culturas de alta qualidade para aplicações a jusante. A introdução de agitação constante com o uso de um agitador de incubadora ou um frasco rotador poderia potencialmente reduzir eventos de fusão, minimizar a fragmentação e aumentar a oxigenação. Essas abordagens alternativas podem manter as culturas por mais tempo, reduzir a morte celular e permitir uma maior diferenciação dos organoides intestinais apical-out.

O estabelecimento de uma monocamadas 2D derivada de organoide fornece várias vantagens e desvantagens em comparação com as organoides de polaridade invertidas. O protocolo aqui descrito permite o rápido estabelecimento de uma cultura monocamada confluente, tipicamente, em menos de 7 dias e a opção de manutenção a longo prazo das culturas por um longo período de tempo (até 10 semanas). O protocolo e a mídia aqui utilizada também permitem a diferenciação eficiente de um número significativo de células, nem sempre encontradas em outras culturas monocamadas derivadas de organoides16. Estabelecer uma monocamada em uma membrana de inserção de cultura celular permite o acesso simultâneo aos lados apical e basolateral do epitélio tornando-os ideais para estudos de integridade de barreiras e transporte epitelial. Esse acesso simplificado também os torna mais favoráveis aos estudos de infecção e tratamento medicamentoso. Além disso, essas culturas mantêm muitas das características exclusivas do doador, mantendo sua relevância para estudos específicos do paciente. O método de cultura ALI também facilita a diferenciação de um epitélio mais funcional composto por tipos de células secretas e absortivas, tornando-o mais representativo do epitélio intestinal humano. A relativa estabilidade dessas culturas também permite que elas sejam mantidas por um período prolongado de tempo, proporcionando a possibilidade de estudos de longo prazo. No entanto, limitações dessa abordagem são o alto número de células necessárias para estabelecer uma monocamada confluente e a necessidade de manter total confluência para ter uma separação funcional entre as câmaras apical e basolateral. A arquitetura criptográfica característica, que pode ser modelada nas culturas organoides 3D também se perde ao estabelecer uma cultura monocamada. No entanto, o formato experimentalmente amigável da cultura e a facilidade com que os lados apical e basolateral do epitélio podem ser acessados, tornam-no uma ferramenta poderosa para o estudo da fisiologia intestinal.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G. S., W.C., e S. S. são funcionários da STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (Reino Unido). M. S., F. E., S. L., A. E., e R. K.C. são funcionários da STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Canadá).

Acknowledgements

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Esta pesquisa foi financiada pela concessão do Horizon 2020 OrganoVIR 812673 sobre o projeto Organoids for Virus Research - Um programa inovador de treinamento-ITN.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de enxágue antiaderenteSTEMCELL Technologies Inc.7010Para revestimento de culturas. Referido como solução anti-aderente no texto principal.
Tubos cônicos, 15 mLSTEMCELL Technologies Inc.38009
Corning Matrigel Matrix, Fator de Crescimento Reduzido (GFR), Corning Sem Vermelho de Fenol356231Matriz Extracelular (ECM) para manutenção e estabelecimento de linhas organoides.
Inserções Transwell Costar de 6,5 mm ou 12 mmSTEMCELL Technologies Inc.38023/38024Para cultura de monocamada 2D.
Costar 24 Bem Placa de fundo plano, tratada com cultura de tecidosSTEMCELL Technologies Inc.38017Para manutenção e estabelecimento de linhas organoides.
D-PBS (sem Ca++ e Mg++)STEMCELL Technologies Inc.37350Para lavar 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Millipore SigmaD2650Reconstituição de pequenas moléculas
DMEM/F-12 com 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies Inc.36254Para lavagem
de reagente de dissociação celular suave (GCDR)STEMCELL Technologies Inc.7174Para remoção de Matrigel. Referido como reagente de dissociação no texto principal.
Meio de Crescimento Organoide IntestiCult (Humano)STEMCELL Technologies Inc.6010Para expansão de linhas organoides antes da diferenciação. Referido como Meio de Expansão Organoide Intestinal no texto principal.
Meio de diferenciação de organoides IntestiCult (humano)STEMCELL Technologies Inc.100-0214Para estabelecimento de monocamadas e diferenciação 3D. Referido como Meio de Diferenciação Organoide Intestinal no texto principal.
Tripsina-EDTA (0,05%)STEMCELL Technologies Inc.7910Para estabelecimento de monocamada 2D.
Y-27632STEMCELL Technologies Inc.72302Inibidor da via RHO/ROCK, inibe ROCK1 e ROCK2. Usado para o estabelecimento 2D da monocamada.
Pontas de furo largoCorning#TF-1005-WB-RSManuseio de organoides

References

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