Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

As células natural killer (NK) são um importante subconjunto de linfócitos que expressam CD56 e não apresentam expressão do marcador de células T, CD3 ^1,2. As células NK convencionais são classificadas como células imunes inatas responsáveis pela imunovigilância de células infectadas por vírus e células cancerosas. Ao contrário das células T, as células NK reconhecem células infectadas ou malignas usando CD16 ou outros receptores ativadores e não requerem a formação de um complexo entre peptídeos antígenos e moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ^3,4. Investigações clínicas recentes usando células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK para tratar cânceres CD19-positivos recidivantes ou refratários (linfoma não-Hodgkin ou leucemia linfocítica crônica [LLC])mostraram as excelentes vantagens de segurança das células CAR-NK⁵. Por exemplo, a infusão de células CAR-NK está associada à doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) mínima ou insignificante, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e síndrome de liberação de citocinas (SRC)^6,7,8,9,10. No entanto, os métodos convencionais para expandir as células NK humanas mostraram fenótipos exaustivos com forte morte fratricida e escassez de telômeros, o que representa um grande desafio na obtenção de um número adequado de células NK funcionais para imunoterapia adotiva¹¹.

Para superar esses desafios, um método foi desenvolvido para expandir as células NK primárias diretamente de células mononucleares do sangue periférico não fracionado (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB) usando uma linhagem celular 721.221 (doravante, 221) irradiada e geneticamente modificada, uma linhagem celular linfoblastóide B humana com baixa expressão de moléculas MHC classe I³. Estudos prévios mostraram a importância da IL-21 na expansão celular NK; portanto, uma IL-21 ligada à membrana geneticamente modificada expressando uma versão da linhagem celular 721.221 (a partir de agora, 221-mIL-21) foi desenvolvida 11,12,13,14,15. Os resultados mostraram que as células NK primárias expandidas por células alimentadoras de 221-mIL-21 foram expandidas para uma média de >40.000 vezes com alta pureza persistente de células NK por aproximadamente 2-3 semanas. Informações adicionais sobre a aplicação desse protocolo podem ser encontradas em Yang et ^al.16.

Este protocolo tem como objetivo demonstrar o procedimento passo-a-passo da nova expansão de células PBNK, CBNK, NK derivadas de tecidos e CAR-NK ex vivo.

O trabalho relacionado a tecidos humanos e sangue neste protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Rutgers (IRB)

1. Expansão celular NK dos tecidos hepáticos (Dia 0), como mostra a Figura 1.

NOTA: O número inicial de células e a viabilidade estão fortemente correlacionados com o tempo desde a remoção do órgão e a quantidade inicial da amostra de tecido. No entanto, se os tecidos forem colocados em 30 mL de Solução Sal Balanceada de Hank (HBSS) e mantidos no gelo ou na geladeira a 4 °C durante a noite, as células NK ainda podem ser expandidas em alta pureza e viabilidade até 24 h depois.

1. Identificar áreas de tecido viáveis para obter linfócitos de tecidos e seções usando equipamentos cirúrgicos estéreis.
2. Coloque os tecidos em 30 mL de HBSS (sem cálcio ou magnésio) e mantenha no gelo até que esteja pronto para se preparar para o isolamento.
3. Pique o tecido em cubos de <0,5 cm usando lâminas de barbear estéreis ou tesouras e pinças dentro de um armário de biossegurança.
4. Prepare uma solução de colagenase IV 1x (1 mg/mL) diluindo um estoque de 10x em HBSS (10x Collagenase IV: 10 mg/mL ou ~200 U/mL).
5. Coloque os pedaços de tecido picados nos tubos dissociadores de tecido. Encha os tubos com não mais de 4 g de tecido e mergulhe os pedaços de tecido em ~10 mL de 1x colagenase IV.
   NOTA: O uso de DNase I não é recomendado, pois pode diminuir ligeiramente a viabilidade e o rendimento de NK. Consulte a Tabela de Materiais para os tubos dissociadores de tecido específicos utilizados.
6. Coloque os tubos dissociadores de tecido num dissociador de tecidos e misture a 37 °C para picar bem o tecido.
   NOTA: Para o tecido hepático, isso pode levar mais de 30 minutos. Para tecidos mais friáveis, cerca de 15 minutos podem ser suficientes. Consulte a Tabela de Materiais para tubos dissociadores de tecidos específicos e o dissociador de tecidos usado.
7. Remova os tubos dissociadores de tecido e triturar através do filtro de células de nylon de 40 μm usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mL. Colete o eluente e descarte os grandes fragmentos não digeridos.
8. Gire o eluente a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
9. Ressuscite os pellets celulares em sílica revestida com polivinilpirrolidona (PVP) a 30% para remover as células adiposas que, de outra forma, contaminariam a fração final de linfócitos.
   1. Para preparar 1x sílica revestida de PVP, use diluição 9:1 de sílica revestida de PVP em 10x PBS.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a sílica revestida de PVP específica usada.
   2. Para preparar 30% de sílica revestida de PVP, dilua 1x sílica revestida de PVP com PBS/HBSS.
10. Gire o pellet da célula a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
11. Ressuspeite a pastilha celular em 9 mL de meio R-10.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a composição da mídia R-10
12. Colocar cuidadosamente a suspensão celular sobre 4 mL de Ficoll ou meios de separação de linfócitos para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares.
13. Separe as camadas centrifugando a 400 x g durante 23 minutos à temperatura ambiente com a aceleração e os travões desligados ou na regulação mais baixa. Decante cuidadosamente a camada média-superior e colha a interfase contendo linfócitos infiltrantes de tecido.
14. Enxaguar as células com 10 mL de meio e proceder à contagem celular, citometria de fluxo, alíquota e congelamento de células, ou protocolo primário de expansão NK.

2. Expansão primária de células NK a partir de PBMCs (ou CB ou tecidos de órgãos) (Dia 0), como mostra a Figura 2.

1. Descongelar o PBMC congelado e as células alimentadoras congeladas e irradiadas num banho-maria a 37 °C.
2. Lavar o PBMC e 100 células de 221-mIL-21 irradiadas por Gama (irradiadas por Gy) por centrifugação a 400 x g por 5 min com 10 mL de meio R-10 separadamente.
3. Salve 1 x 10⁶ células de PBMC para citometria de fluxo.
   NOTA: A pureza inicial da célula NK é um fator importante no cálculo da taxa de expansão da célula NK.
4. Ressuspender as células em 1 mL de meio R-10. Conte as células usando Trypan Blue.
5. Misture 5x 10 6 células de PBMC com 10 x 10 6 células de 100 células 221-mIL-21 irradiadas por Gy em uma placa especial de⁶ poços (ver Tabela de Materiais).
6. Adicione 30 mL de meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) (ver Tabela de Materiais).
7. Incubar a placa especial de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂.
8. Substitua o meio por um meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) para manter as células NK a cada 3-4 dias.
   NOTA: Mantenha menos de 20 x 10⁶ células por poço para expansão adicional a cada alteração de mídia. Para a melhor viabilidade, certifique-se de que o número total de células em cada poço não exceda 100 x 10⁶ células.
9. Registre o número total de células, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada 3-4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK.

3. Fixação de células 293T (Dia 2), como mostra a Figura 2.

1. Dividir 1,8 x 10⁶ 293T células em 11 mL de D-10 meio por placa de 100 mm tratada.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a composição da mídia D-10
2. Incubar células 293T a 37 °C com 5% de CO₂.

4. Transfecção de retrovírus (Dia 3)

1. Em um tubo de 1,7 mL, misture 470 μL de meio sérico reduzido com 30 μL de reagente de transfecção.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para o meio sérico reduzido específico e o reagente de transfecção utilizados.
2. Em um tubo separado de 1,7 mL, adicione 2,5 μg de plasmídeo pRDF, 3,75 μg de plasmídeo Pegpam3 e 2,5 μg de construção CAR no vetor SFG no meio sérico reduzido para que o volume final seja de 500 μL.
3. Misture as soluções nas etapas 4.1 e 4.2 gota a gota.
4. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 min.
5. Adicione 1 mL da mistura da etapa 4.4 à placa de células 293T no Dia 1 de maneira gota a gota.
6. Incubar a(s) placa(s) a 37 °C com 5% de CO₂ durante 48-72 h.

5. Revestimento da placa de retronectina (Dia 3)

1. Diluir a proteína retronectina com solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50-100 μg/mL.
2. Adicionar 500 μL da retronectina diluída em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada (5 poços por construção CAR). Selar a placa com parafilme e incubá-la a 4 °C durante a noite.

6. Transdução (Dia 4)

1. Centrifugar a placa de retronectina a 2103 x g durante 30 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
2. Bloquear cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de meio R-10.
3. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO₂ durante 1 h.
4. Pré-aqueça a centrífuga a 32 °C enquanto a placa de retronectina estiver bloqueada.
5. Recolha o sobrenadante do retrovírus filtrando as células 293T transfectadas utilizando um filtro de 0,45 μm.
6. Alíquota de 2 mL do sobrenadante do retrovírus filtrado em cada poço.
7. Centrifugar a placa de 24 poços a 2103 x g durante 2 h a 32 °C.
8. Durante a centrifugação da placa, colete as células PBNK expandidas do Dia 0 e conte as células usando Azul de Tripano.
   NOTA: Continue expandindo as células PBNK adicionando meios R-10 suplementados com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL).
9. Diluir as células PBNK expandidas com meios R-10 suplementados com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL) para 2,5 x 10 5-5 x 10 5 células/mL (^0,5 x 10 6-1 x 10⁶ células por poço).
   NOTA: Registre o número total de células, a viabilidade e salve 5 x 10⁵ células PBNK expandidas para citometria de fluxo, pois esses valores são importantes na determinação da taxa de expansão de células NK.
10. Após a centrifugação, aspirar parcialmente o sobrenadante do retrovírus de cada poço.
    NOTA: Não aspirar completamente, ou seja, deixar aproximadamente 100 μL de sobrenadante de retrovírus por poço, pois isso diminuirá a eficiência da transdução.
11. Alíquota 2 mL das células PBNK expandidas diluídas da etapa 6,8 para cada poço.
12. Centrifugar a placa a 600 x g durante 10 min a 32 °C. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO₂ durante 48-72 h.
    NOTA: Não parafilme a placa.

7. Coleta de células CAR-NK (Dia 6 ou 7), conforme mostra a Figura 2.

1. Recolha suavemente as células da placa de 24 poços e transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 ml
   NOTA: Tente não gerar bolhas, pois isso resultará em uma diminuição na viabilidade celular.
2. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 5 min.
3. Ressuscite o pellet com 1 mL de meio R-10 e conte as células usando Trypan Blue.
   NOTA: Salve 5 x 10⁵ células para citometria de fluxo para determinar a eficiência da transdução.
4. Transfira as células ressuspensas para uma placa especial de 6 poços contendo 30 mL de meio R-10 suplementado com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL).
5. Incubar a placa especial de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂.
6. Substitua o meio R-10 suplementado com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL) para manter as células NK a cada 3 a 4 dias.
   NOTA: Mantenha menos de 20 x 10⁶ células por poço para expansão adicional a cada alteração. Para a melhor viabilidade, certifique-se de que o número total de células em cada poço não exceda 100 x 10⁶ células.
7. Registre o número total de células, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada 3-4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK.
8. Use as células para ensaios in vitro ou in vivo apropriados.
   NOTA: As células PBNK expandidas ex vivo e CAR-NK podem ser cultivadas em uma incubadora de 37 °C por aproximadamente 4 semanas.
9. Examine o número e a pureza das células NK no dia 7, dia 11, dia 14, dia 18 e dia 21 por citometria de fluxo.

Um fluxo de trabalho esquemático de isolamento de células NK infiltrantes de tecido e expansão de células PBNK usando a metodologia de célula alimentadora de 221-mIL-21 é mostrado na Figura 1 e na Figura 2. Células PBNK expandidas foram coletadas a cada 3 ou 4 dias para citometria de fluxo para determinar a pureza das células NK por coloração de células com CD56 anti-humano e CD3 anti-humano. O experimento foi repetido utilizando-se dois doadores diferentes para mostrar a reprodutibilidade do sistema de expansão (Figura 3). Células PBNK expandidas por 221-mIL-21 demonstraram expandir-se quase 5 × 104 dobras (Figura 3A). Além disso, a pureza das células NK foi altamente mantida, em torno de 85% ao longo dos 21 dias de expansão (Figura 3B). Usando o sistema de expansão da célula alimentadora 221-mIL-21, a pureza da célula NK variou consistentemente entre 85%-95%, independente dos doadores (dados não mostrados). Para demonstrar a robustez do sistema de expansão 221-mIL-21, os PBMCs foram corados para anti-CD56 e anti-CD3 antes da expansão, o que mostrou uma pureza celular de 7,09% para as células NK e uma alta porcentagem de células T (Figura 4A). PBMCs foram cocultivados com 221-mIL-21 para expandir as células NK; a pureza de NK foi verificada antes da transdução CAR-NK no Dia 4 (Figura 4A). As células CAR-NK foram coletadas e coradas para anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2, que apresentaram alta população de células NK (86,9 % no Dia 7) e alta eficiência de transdução CAR de aproximadamente 70% (Figura 4). Maiores eficiências de transdução (até 95%) também foram observadas usando o sistema de embalagem de retrovírus. No total, esses dados mostram que as células alimentadoras de 221-mIL-21 poderiam expandir com sucesso as células NK e preservar a pureza da célula NK ex vivo.

Figura 1: Diagrama da expansão de células NK a partir de amostras sólidas de órgãos humanos. Resumidamente, as amostras de fígado humano obtidas são picadas em pequenos cubos para digestão mecânica. As células dissociadas são então isoladas usando sílica revestida de PVP e meios de separação de linfócitos. Além disso, as células NK são expandidas usando o protocolo de expansão descrito na Figura 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho esquemático da geração de células CAR-NK a partir de PBMCs. Resumidamente, células alimentadoras de 221-mIL21 foram irradiadas a 100 Gy antes da cocultura com PBMCs suplementados com IL-2 e IL-15 no Dia 0. Em paralelo, as células 293T foram transfectadas com o sistema de embalagem de retrovírus para produzir o retrovírus CAR que foi então transduzido para as células PBNK expandidas na presença de IL-2 e IL-15. As células CAR-NK primárias foram colhidas no Dia 7 e continuaram a expansão por 21 dias. Esse número foi modificado a partir de Yang et al.16. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Expansão dinâmica em lapso de tempo das células PBNK. (A) Expansão da dobra da PBNK durante um curso de 22 dias. As células foram coradas com anti-CD56 e anti-CD3 nos dias indicados para citometria de fluxo. O número total de células NK foi determinado multiplicando a pureza das células NK pelo número total de células. A taxa de expansão foi gerada da seguinte forma: (Número de células NK)Tn/(Número de células NK)T0, onde Número de células NK = (porcentagem da pureza das células NK) × (número total de células), T 0 é o número de células NK no dia0 e Tn é o número de células NK no dia do tempo n. (B) Pureza das células NK durante um curso de tempo de 22 dias. A expansão das células NK foi repetida duas vezes com dois doadores diferentes. As barras de erro representam ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise citométrica de fluxo representativa de células CAR-NK. (A) Gráficos de pontos representativos mostrando o lapso de tempo dinâmico da pureza das células NK das células CAR-NK durante um curso de 18 dias. A análise da citometria de fluxo foi avaliada pela coloração das células com anti-CD56 e anti-CD3 nos horários indicados. O dia 0 indica a pré-expansão do PBNK. O dia 4 indica pós-expansão do PBNK e pré-transdução das células CAR-NK. O dia 7 indica a pós-transdução das células CAR-NK. (B) Gráficos de pontos representativos mostrando a eficiência de transdução de células CAR-NK usando o sistema de embalagem de retrovírus. As células foram coradas com anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2 para citometria de fluxo. (C) Gráficos de pontos representativos mostrando a expressão CAR em vários subconjuntos, incluindo CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ e CD56-CD3- no Dia 18. As células foram coradas com anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (indicando expressão de CAR) para citometria de fluxo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.