Artigo de método

Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana

DOI:

10.3791/62336

⸱

8 de fevereiro de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers-New Jersey Medical School, 2Department of Microbiology, Biochemistry & Molecular Genetics, Public Health Research Institute Center, New Jersey Medical School, Rutgers University, 3Center for Immunity and Inflammation, New Jersey Medical School, Rutgers-The State University of New Jersey

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A terapia de células imunes modificadas pelo receptor de antígeno quimérico (CAR) tornou-se um tratamento emergente para cânceres e doenças infecciosas. A imunoterapia baseada em NK, particularmente a célula CAR-NK, é um dos mais promissores desenvolvimentos "prontos para uso" sem toxicidade grave com risco de vida. No entanto, o gargalo para o desenvolvimento de uma terapia CAR-NK bem-sucedida é alcançar um número suficiente de células CAR-NK não exaustivas, de longa duração e "prontas para uso" de terceiros. Aqui, desenvolvemos um novo método de expansão CAR-NK usando uma linhagem celular B transformada pelo vírus Epstein-Barr (EBV) expressando uma forma de membrana geneticamente modificada de interleucina-21 (IL-21). Neste protocolo, procedimentos passo-a-passo são fornecidos para expandir as células NK e CAR-NK do sangue do cordão umbilical e do sangue periférico, bem como dos tecidos sólidos dos órgãos. Este trabalho irá melhorar significativamente o desenvolvimento clínico da imunoterapia CAR-NK.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células natural killer (NK) são um importante subconjunto de linfócitos que expressam CD56 e não apresentam expressão do marcador de células T, CD3 1,2. As células NK convencionais são classificadas como células imunes inatas responsáveis pela imunovigilância de células infectadas por vírus e células cancerosas. Ao contrário das células T, as células NK reconhecem células infectadas ou malignas usando CD16 ou outros receptores ativadores e não requerem a formação de um complexo entre peptídeos antígenos e moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) 3,4. Investigações clínicas recentes usando células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK para tratar cânceres CD19-positivos recidivantes ou refratários (linfoma não-Hodgkin ou leucemia linfocítica crônica [LLC])mostraram as excelentes vantagens de segurança das células CAR-NK5. Por exemplo, a infusão de células CAR-NK está associada à doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) mínima ou insignificante, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e síndrome de liberação de citocinas (SRC)6,7,8,9,10. No entanto, os métodos convencionais para expandir as células NK humanas mostraram fenótipos exaustivos com forte morte fratricida e escassez de telômeros, o que representa um grande desafio na obtenção de um número adequado de células NK funcionais para imunoterapia adotiva11.

Para superar esses desafios, um método foi desenvolvido para expandir as células NK primárias diretamente de células mononucleares do sangue periférico não fracionado (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB) usando uma linhagem celular 721.221 (doravante, 221) irradiada e geneticamente modificada, uma linhagem celular linfoblastóide B humana com baixa expressão de moléculas MHC classe I3. Estudos prévios mostraram a importância da IL-21 na expansão celular NK; portanto, uma IL-21 ligada à membrana geneticamente modificada expressando uma versão da linhagem celular 721.221 (a partir de agora, 221-mIL-21) foi desenvolvida 11,12,13,14,15. Os resultados mostraram que as células NK primárias expandidas por células alimentadoras de 221-mIL-21 foram expandidas para uma média de >40.000 vezes com alta pureza persistente de células NK por aproximadamente 2-3 semanas. Informações adicionais sobre a aplicação desse protocolo podem ser encontradas em Yang et al.16.

Este protocolo tem como objetivo demonstrar o procedimento passo-a-passo da nova expansão de células PBNK, CBNK, NK derivadas de tecidos e CAR-NK ex vivo.

Protocolo

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O trabalho relacionado a tecidos humanos e sangue neste protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Rutgers (IRB)

1. Expansão celular NK dos tecidos hepáticos (Dia 0), como mostra a Figura 1.

NOTA: O número inicial de células e a viabilidade estão fortemente correlacionados com o tempo desde a remoção do órgão e a quantidade inicial da amostra de tecido. No entanto, se os tecidos forem colocados em 30 mL de Solução Sal Balanceada de Hank (HBSS) e mantidos no gelo ou na geladeira a 4 °C durante a noite, as células NK ainda podem ser expandidas em alta pureza e viabilidade até 24 h depois.

  1. Identificar áreas de tecido viáveis para obter linfócitos de tecidos e seções usando equipamentos cirúrgicos estéreis.
  2. Coloque os tecidos em 30 mL de HBSS (sem cálcio ou magnésio) e mantenha no gelo até que esteja pronto para se preparar para o isolamento.
  3. Pique o tecido em cubos de <0,5 cm usando lâminas de barbear estéreis ou tesouras e pinças dentro de um armário de biossegurança.
  4. Prepare uma solução de colagenase IV 1x (1 mg/mL) diluindo um estoque de 10x em HBSS (10x Collagenase IV: 10 mg/mL ou ~200 U/mL).
  5. Coloque os pedaços de tecido picados nos tubos dissociadores de tecido. Encha os tubos com não mais de 4 g de tecido e mergulhe os pedaços de tecido em ~10 mL de 1x colagenase IV.
    NOTA: O uso de DNase I não é recomendado, pois pode diminuir ligeiramente a viabilidade e o rendimento de NK. Consulte a Tabela de Materiais para os tubos dissociadores de tecido específicos utilizados.
  6. Coloque os tubos dissociadores de tecido num dissociador de tecidos e misture a 37 °C para picar bem o tecido.
    NOTA: Para o tecido hepático, isso pode levar mais de 30 minutos. Para tecidos mais friáveis, cerca de 15 minutos podem ser suficientes. Consulte a Tabela de Materiais para tubos dissociadores de tecidos específicos e o dissociador de tecidos usado.
  7. Remova os tubos dissociadores de tecido e triturar através do filtro de células de nylon de 40 μm usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mL. Colete o eluente e descarte os grandes fragmentos não digeridos.
  8. Gire o eluente a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
  9. Ressuscite os pellets celulares em sílica revestida com polivinilpirrolidona (PVP) a 30% para remover as células adiposas que, de outra forma, contaminariam a fração final de linfócitos.
    1. Para preparar 1x sílica revestida de PVP, use diluição 9:1 de sílica revestida de PVP em 10x PBS.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a sílica revestida de PVP específica usada.
    2. Para preparar 30% de sílica revestida de PVP, dilua 1x sílica revestida de PVP com PBS/HBSS.
  10. Gire o pellet da célula a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
  11. Ressuspeite a pastilha celular em 9 mL de meio R-10.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a composição da mídia R-10
  12. Colocar cuidadosamente a suspensão celular sobre 4 mL de Ficoll ou meios de separação de linfócitos para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares.
  13. Separe as camadas centrifugando a 400 x g durante 23 minutos à temperatura ambiente com a aceleração e os travões desligados ou na regulação mais baixa. Decante cuidadosamente a camada média-superior e colha a interfase contendo linfócitos infiltrantes de tecido.
  14. Enxaguar as células com 10 mL de meio e proceder à contagem celular, citometria de fluxo, alíquota e congelamento de células, ou protocolo primário de expansão NK.

2. Expansão primária de células NK a partir de PBMCs (ou CB ou tecidos de órgãos) (Dia 0), como mostra a Figura 2.

  1. Descongelar o PBMC congelado e as células alimentadoras congeladas e irradiadas num banho-maria a 37 °C.
  2. Lavar o PBMC e 100 células de 221-mIL-21 irradiadas por Gama (irradiadas por Gy) por centrifugação a 400 x g por 5 min com 10 mL de meio R-10 separadamente.
  3. Salve 1 x 106 células de PBMC para citometria de fluxo.
    NOTA: A pureza inicial da célula NK é um fator importante no cálculo da taxa de expansão da célula NK.
  4. Ressuspender as células em 1 mL de meio R-10. Conte as células usando Trypan Blue.
  5. Misture 5x 10 6 células de PBMC com 10 x 10 6 células de 100 células 221-mIL-21 irradiadas por Gy em uma placa especial de6 poços (ver Tabela de Materiais).
  6. Adicione 30 mL de meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) (ver Tabela de Materiais).
  7. Incubar a placa especial de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2.
  8. Substitua o meio por um meio R-10 suplementado com IL-2 humana (200 U/mL) e IL-15 humana (5 ng/mL) para manter as células NK a cada 3-4 dias.
    NOTA: Mantenha menos de 20 x 106 células por poço para expansão adicional a cada alteração de mídia. Para a melhor viabilidade, certifique-se de que o número total de células em cada poço não exceda 100 x 106 células.
  9. Registre o número total de células, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada 3-4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK.

3. Fixação de células 293T (Dia 2), como mostra a Figura 2.

  1. Dividir 1,8 x 106 293T células em 11 mL de D-10 meio por placa de 100 mm tratada.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a composição da mídia D-10
  2. Incubar células 293T a 37 °C com 5% de CO2.

4. Transfecção de retrovírus (Dia 3)

  1. Em um tubo de 1,7 mL, misture 470 μL de meio sérico reduzido com 30 μL de reagente de transfecção.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para o meio sérico reduzido específico e o reagente de transfecção utilizados.
  2. Em um tubo separado de 1,7 mL, adicione 2,5 μg de plasmídeo pRDF, 3,75 μg de plasmídeo Pegpam3 e 2,5 μg de construção CAR no vetor SFG no meio sérico reduzido para que o volume final seja de 500 μL.
  3. Misture as soluções nas etapas 4.1 e 4.2 gota a gota.
  4. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 min.
  5. Adicione 1 mL da mistura da etapa 4.4 à placa de células 293T no Dia 1 de maneira gota a gota.
  6. Incubar a(s) placa(s) a 37 °C com 5% de CO2 durante 48-72 h.

5. Revestimento da placa de retronectina (Dia 3)

  1. Diluir a proteína retronectina com solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50-100 μg/mL.
  2. Adicionar 500 μL da retronectina diluída em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada (5 poços por construção CAR). Selar a placa com parafilme e incubá-la a 4 °C durante a noite.

6. Transdução (Dia 4)

  1. Centrifugar a placa de retronectina a 2103 x g durante 30 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
  2. Bloquear cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de meio R-10.
  3. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2 durante 1 h.
  4. Pré-aqueça a centrífuga a 32 °C enquanto a placa de retronectina estiver bloqueada.
  5. Recolha o sobrenadante do retrovírus filtrando as células 293T transfectadas utilizando um filtro de 0,45 μm.
  6. Alíquota de 2 mL do sobrenadante do retrovírus filtrado em cada poço.
  7. Centrifugar a placa de 24 poços a 2103 x g durante 2 h a 32 °C.
  8. Durante a centrifugação da placa, colete as células PBNK expandidas do Dia 0 e conte as células usando Azul de Tripano.
    NOTA: Continue expandindo as células PBNK adicionando meios R-10 suplementados com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL).
  9. Diluir as células PBNK expandidas com meios R-10 suplementados com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL) para 2,5 x 10 5-5 x 10 5 células/mL (0,5 x 10 6-1 x 106 células por poço).
    NOTA: Registre o número total de células, a viabilidade e salve 5 x 105 células PBNK expandidas para citometria de fluxo, pois esses valores são importantes na determinação da taxa de expansão de células NK.
  10. Após a centrifugação, aspirar parcialmente o sobrenadante do retrovírus de cada poço.
    NOTA: Não aspirar completamente, ou seja, deixar aproximadamente 100 μL de sobrenadante de retrovírus por poço, pois isso diminuirá a eficiência da transdução.
  11. Alíquota 2 mL das células PBNK expandidas diluídas da etapa 6,8 para cada poço.
  12. Centrifugar a placa a 600 x g durante 10 min a 32 °C. Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2 durante 48-72 h.
    NOTA: Não parafilme a placa.

7. Coleta de células CAR-NK (Dia 6 ou 7), conforme mostra a Figura 2.

  1. Recolha suavemente as células da placa de 24 poços e transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 ml
    NOTA: Tente não gerar bolhas, pois isso resultará em uma diminuição na viabilidade celular.
  2. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 5 min.
  3. Ressuscite o pellet com 1 mL de meio R-10 e conte as células usando Trypan Blue.
    NOTA: Salve 5 x 105 células para citometria de fluxo para determinar a eficiência da transdução.
  4. Transfira as células ressuspensas para uma placa especial de 6 poços contendo 30 mL de meio R-10 suplementado com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL).
  5. Incubar a placa especial de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2.
  6. Substitua o meio R-10 suplementado com IL-2 (200 U/mL) e IL-15 (5 ng/mL) para manter as células NK a cada 3 a 4 dias.
    NOTA: Mantenha menos de 20 x 106 células por poço para expansão adicional a cada alteração. Para a melhor viabilidade, certifique-se de que o número total de células em cada poço não exceda 100 x 106 células.
  7. Registre o número total de células, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada 3-4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK.
  8. Use as células para ensaios in vitro ou in vivo apropriados.
    NOTA: As células PBNK expandidas ex vivo e CAR-NK podem ser cultivadas em uma incubadora de 37 °C por aproximadamente 4 semanas.
  9. Examine o número e a pureza das células NK no dia 7, dia 11, dia 14, dia 18 e dia 21 por citometria de fluxo.

Resultados

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Um fluxo de trabalho esquemático de isolamento de células NK infiltrantes de tecido e expansão de células PBNK usando a metodologia de célula alimentadora de 221-mIL-21 é mostrado na Figura 1 e na Figura 2. Células PBNK expandidas foram coletadas a cada 3 ou 4 dias para citometria de fluxo para determinar a pureza das células NK por coloração de células com CD56 anti-humano e CD3 anti-humano. O experimento foi repetido utilizando-se dois doadores diferentes para mostrar a reprodutibilidade do sistema de expansão (Figura 3). Células PBNK expandidas por 221-mIL-21 demonstraram expandir-se quase 5 × 104 dobras (Figura 3A). Além disso, a pureza das células NK foi altamente mantida, em torno de 85% ao longo dos 21 dias de expansão (Figura 3B). Usando o sistema de expansão da célula alimentadora 221-mIL-21, a pureza da célula NK variou consistentemente entre 85%-95%, independente dos doadores (dados não mostrados). Para demonstrar a robustez do sistema de expansão 221-mIL-21, os PBMCs foram corados para anti-CD56 e anti-CD3 antes da expansão, o que mostrou uma pureza celular de 7,09% para as células NK e uma alta porcentagem de células T (Figura 4A). PBMCs foram cocultivados com 221-mIL-21 para expandir as células NK; a pureza de NK foi verificada antes da transdução CAR-NK no Dia 4 (Figura 4A). As células CAR-NK foram coletadas e coradas para anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2, que apresentaram alta população de células NK (86,9 % no Dia 7) e alta eficiência de transdução CAR de aproximadamente 70% (Figura 4). Maiores eficiências de transdução (até 95%) também foram observadas usando o sistema de embalagem de retrovírus. No total, esses dados mostram que as células alimentadoras de 221-mIL-21 poderiam expandir com sucesso as células NK e preservar a pureza da célula NK ex vivo.

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Figura 1: Diagrama da expansão de células NK a partir de amostras sólidas de órgãos humanos. Resumidamente, as amostras de fígado humano obtidas são picadas em pequenos cubos para digestão mecânica. As células dissociadas são então isoladas usando sílica revestida de PVP e meios de separação de linfócitos. Além disso, as células NK são expandidas usando o protocolo de expansão descrito na Figura 2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Fluxo de trabalho esquemático da geração de células CAR-NK a partir de PBMCs. Resumidamente, células alimentadoras de 221-mIL21 foram irradiadas a 100 Gy antes da cocultura com PBMCs suplementados com IL-2 e IL-15 no Dia 0. Em paralelo, as células 293T foram transfectadas com o sistema de embalagem de retrovírus para produzir o retrovírus CAR que foi então transduzido para as células PBNK expandidas na presença de IL-2 e IL-15. As células CAR-NK primárias foram colhidas no Dia 7 e continuaram a expansão por 21 dias. Esse número foi modificado a partir de Yang et al.16. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Expansão dinâmica em lapso de tempo das células PBNK. (A) Expansão da dobra da PBNK durante um curso de 22 dias. As células foram coradas com anti-CD56 e anti-CD3 nos dias indicados para citometria de fluxo. O número total de células NK foi determinado multiplicando a pureza das células NK pelo número total de células. A taxa de expansão foi gerada da seguinte forma: (Número de células NK)Tn/(Número de células NK)T0, onde Número de células NK = (porcentagem da pureza das células NK) × (número total de células), T 0 é o número de células NK no dia0 e Tn é o número de células NK no dia do tempo n. (B) Pureza das células NK durante um curso de tempo de 22 dias. A expansão das células NK foi repetida duas vezes com dois doadores diferentes. As barras de erro representam ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise citométrica de fluxo representativa de células CAR-NK. (A) Gráficos de pontos representativos mostrando o lapso de tempo dinâmico da pureza das células NK das células CAR-NK durante um curso de 18 dias. A análise da citometria de fluxo foi avaliada pela coloração das células com anti-CD56 e anti-CD3 nos horários indicados. O dia 0 indica a pré-expansão do PBNK. O dia 4 indica pós-expansão do PBNK e pré-transdução das células CAR-NK. O dia 7 indica a pós-transdução das células CAR-NK. (B) Gráficos de pontos representativos mostrando a eficiência de transdução de células CAR-NK usando o sistema de embalagem de retrovírus. As células foram coradas com anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2 para citometria de fluxo. (C) Gráficos de pontos representativos mostrando a expressão CAR em vários subconjuntos, incluindo CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ e CD56-CD3- no Dia 18. As células foram coradas com anti-CD56, anti-CD3 e anti-hIgG(H+L) F(ab')2 (indicando expressão de CAR) para citometria de fluxo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A maioria dos produtos CAR-NK atuais em ensaios clínicos utiliza linhagens celulares NK 17, como NK-92, uma linhagem celular isolada de um paciente com linfoma não-Hodgkin18, NK-92MI, IL-2 independente NK-92 linhagem celular19, e NKL, isolada de um grande paciente com linfócitos granulares20, pois essas linhagens celulares são facilmente proliferativas para produtos "prontos para uso". No entanto, essas linhagens celulares, por exemplo, células NK-92, apresentam eficácias clínicas marginais e expansão in vivo, pois necessitam de irradiação prévia à infusão, limitando assim sua proliferação e citotoxicidade in vivo21. Diante dessas razões, várias estratégias estão sendo exploradas atualmente para expandir as células NK primárias de várias fontes, incluindo sangue periférico, CB, medula óssea (BM), células-tronco embrionárias humanas (HSCs), células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e tecidos tumorais21,22,23. Por exemplo, as células NK podem ser expandidas ex vivo usando interleucinas, incluindo IL-15, IL-18 e IL-21. Linhagens celulares linfoblastóides, como células K562 ou linhagens celulares linfoblastoides transformadas pelo vírus Epstein-Barr, como 721,221 células, também são usadas para expansão celular NK16. No entanto, as estratégias supracitadas muitas vezes geram número insuficiente de células NK para uma transferência adotiva da imunoterapia CAR-NK22,24. Para ajudar a resolver o problema, o estudo aqui mostra um protocolo para uma expansão celular NK ex vivo usando uma linhagem celular geneticamente modificada transformada em EBV, células alimentadoras de 221-mIL-21.

A metodologia de expansão usando células alimentadoras de 221-mIL-21 mostrada neste protocolo é otimizada para expandir as células NK com uma taxa de expansão de pelo menos 10 a 100 vezes maior do que outras linhagens celulares de leucemia, incluindo HL-60 e OCl-AML3 expressando membrana IL-21, K562 e K652-mIL21 expressando o ligante OX4022,24,25. A expressão de CAR também é avaliada por aproximadamente 2 semanas ex vivo. Mais significativamente, a estratégia de expansão de células alimentadoras de 221-mIL-21 pode ser aplicada para expandir as células NK de várias fontes, incluindo PBMCs, CB e órgãos sólidos, como o fígado, sem uma etapa inicial de enriquecimento de NK. Embora o sistema de alimentação de 221-mIL-21 não seja tão dependente do doador quanto as linhagens celulares de alimentação acima mencionadas, ele não é totalmente independente dos doadores. Em média, o sistema de expansão 221-mIL-21 pode atingir 90% da pureza da célula NK com um alto número de células NK, com aproximadamente <5% de contaminação por células T no dia 14 pós-expansão. Portanto, para eliminar as possibilidades de contaminação por células T, é necessário isolar as células NK das amostras obtidas antes da expansão ex vivo ou usar um sistema de seleção CD3+ para eliminar as células T após uma expansão ex vivo.

Uma das críticas ao usar um sistema de expansão celular NK é que as células alimentadoras podem não ter sido totalmente erradicadas após a expansão ou antes de uma transfusão, o que pode possuir preocupações regulatórias significativas; portanto, a erradicação completa das células alimentadoras antes de uma transfusão é crucial. No entanto, ensaios clínicos recentes do CAR-NK nos quais células alimentadoras K562-mIL21-4-1BBL foram utilizadas para a expansão celular CBNK ex vivo 24,25 não mostraram complicações preocupantes. Além disso, nossos dados preliminares mostraram uma diminuição gradual da população irradiada de 221-mIL-21 à medida que a expansão progredia (dados não mostrados). No entanto, estudos mais extensos são necessários para que esse método de expansão seja implementado em um ambiente clínico. Coletivamente, o sistema de expansão 221-mIL-21 ajuda a resolver o desafio de expandir as células primárias CAR-NK e, portanto, contribuirá significativamente para o uso mais amplo da imunoterapia baseada em células CAR-NK no futuro próximo.

Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Liu (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang e Dr. Chih-Hsiung Chen) por seus comentários sobre os manuscritos. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Gianpietro Dotti pelos vetores SFG e ao Dr. Eric Long pelas 721.221 células. Este trabalho foi apoiado em parte por HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) e Rutgers-Health Advance Funding (programa NIH REACH), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti e R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) e Rutgers University-New Jersey Medical School Startup funding para o D. Liu Laboratory.

Materiais



Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura de tecidos estéreis tratadas com superfície de 100 mmVWR10062-880Para transfecção
de células 293TATCCCRL-3216Para transfecção
Placa G-REX de 6 poçosWilson Wolf80240MPara expansão de células NK
AF647-conjugado AffiniPure F(ab')2 fragmento de cabra anti-humano IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-606-088Para fluxo construção
de citometria CAR no vetor SFGGerado no laboratório do Dr. Dongfang LiuPara transfecção
10%
D-10 media
Ingrediente: DMEM		VWR45000-304
D-10 media
Ingrediente: Soro Fetal Bovino (FBS)		Corning35-010-CV10%
D-10 media
Ingrediente: Penicilina Estreptomicina		VWR45000-6521%
FastFlow & Membrana de PES expresso de baixa ligação MilliporeMillexSLHPR33RBpara transdução
Reagente de transfecçãoGenejuice VWR80611-356
tubos C gentleMACSMiltenyi Biotec130-093-237Para isolamento de TILs
gentleMACS OctoMiltenyi BiotecCitaçãopara isolamento de TILs
salina balanceada de Hank (HBSS - sem cálcio ou magnésio)ThermoFisher14170120Para isolamento de TILs
IL-15 humanoPeprotech200-15Para expansão de células NK
IL-2 humanoPeprotech200-02Para expansão de células NK
Células alimentadoras irradiadas de 221-mIL21Geradas no laboratório do Dr. Dongfang LiuCongelado em meio criopreservado
Corning25-072-CVPara isolamento de TILs
OPTI-MEMThermoFisher31895Para transfecção
PE anti-clone CD3 humano HIT3aBiolegend300308Para citometria de fluxo
PE / Cy7 clone anti-CD56 humano (NCAM) 5.1H11BioLegend362509Para citometria de fluxo
Plasmídeo Pegpam3Gerado no laboratório do Dr. Dongfang Liu transfecção
PercollGE Healthcare17089101Para isolamento de TILs
Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs)New York Blood CenterIsolado do plasma de doadores saudáveis, congelado em meio criopreservado
Tampão fosfato salino (PBS)Corning21-040-CVPara transdução
de plasmídeo pRDFGerado no laboratórioPara transfecção
R-10 media
Ingredientes: RPMI 1640		VWR45000-404
R-10 media
Ingrediente: L-glutamina		VWR45000-3041%
R-10 media
Ingrediente: Penicilina Estreptomicina		VWR45000-6521%
R-10 media
Ingrediente: Soro Fetal Bovino (FBS)		Corning35-010-CV10%
RetronectinaGerado no laboratório do Dr. Dongfang Liufeito em casaPara transdução
Trypan BlueCorning25-900-ClPara contagem de células
Placa de 24 poços não tratadaFisher Scientific13-690-071Para transdução
Colagenase IV Sigma C4-22-1G Para isolamento de TILs Meio de criopreservação Ingrediente: Soro Fetal Bovino (FBS)Corning 35-010-CV 90%Meio de criopreservação Ingrediente: Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma D2050 Para de transfecção Solução Meios de separação de linfócitos Para do Dr. Dongfang Liu

Referências

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