Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Abstract

Este trabalho apresenta uma nova plataforma microfluida, econômica e confiável, com potencial para gerar tecidos multicamadas complexos. Como prova de conceito, foi modelado um compartimento humano simplificado e indiferenciado contendo um compartimento dérmico (estrommal) e um compartimento epidélico (epitelial). Para isso, foi desenvolvido um dispositivo versátil e robusto, à base de vinil, dividido em duas câmaras, superando algumas das desvantagens presentes em dispositivos microfluidos à base de polidimtilsiloxano (PDMS) para aplicações biomédicas, como o uso de equipamentos caros e especializados ou a absorção de pequenas moléculas hidrofóbicas e proteínas. Além disso, foi desenvolvido um novo método baseado no fluxo paralelo, possibilitando a deposição in situ dos compartimentos dérmico e epidérmico. A construção da pele consiste em uma matriz fibrina contendo fibroblastos primários humanos e uma monocamada de queratinócitos imortalizados semeados no topo, que é posteriormente mantido sob condições dinâmicas de cultura. Essa nova plataforma microfluidica abre a possibilidade de modelar doenças de pele humanas e extrapolar o método para gerar outros tecidos complexos.

Introduction

Recentemente, foram feitos avanços no desenvolvimento e produção de modelos in vitro de pele humana para a análise da toxicidade de produtos cosméticos e farmacêuticos¹. Pesquisadores de indústrias farmacêuticas e de cuidados com a pele têm usado animais, sendo os camundongos os mais comuns, para testar seus produtos^2,3,4,5. No entanto, testar produtos em animais nem sempre é preditivo da resposta em humanos, o que frequentemente leva à falha de drogas ou efeitos adversos em humanos e,^{consequentemente,}a perdas econômicas⁵,⁶. O Reino Unido foi o primeiro país que proibiu o uso de animais para testes cosméticos em 1998. Mais tarde, em 2013, a UE proibiu os testes e aprovação de cosméticos em animais (Regulamento de Cosméticos da UE nº 1223/2009)⁷.

Essa proibição também está sendo considerada por outros países, como no 'The Humane Cosmetics Act' nos EUA⁸. Além das preocupações éticas, as diferenças anatômicas entre pele animal e humana tornam os testes em animais demorados, caros e muitas vezes ineficazes. Além disso, o tamanho global do mercado de testes toxicológicos in vitro deve atingir US$ 26,98 bilhões até 2025⁹. Por essas razões, é necessário desenvolver novos métodos e alternativas para esses estudos in vitro, como modelos de pele humana bioengenharia, que possibilitam testes para segurança e efeitos tóxicos de cosméticos e drogas sem o uso de animais.

Existem dois tipos diferentes de modelos de pele humana disponíveis comercialmente, in vitro. O primeiro tipo consiste em equivalentes epidérmicos estratificados contendo múltiplas camadas de queratinócitos diferenciadores que são semeados em diferentes materiais. Alguns deles foram aprovados pela Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) e validados pelo (Centro Europeu para validação de Métodos Alternativos (ECVAM) para testes de corrosão e irritação da pele, como EpiDerm ou SkinEthic^10,11,12. O segundo tipo são equivalentes de pele cheia com uma camada de diferenciação de queratinócitos humanos semeados em um andaime tridimensional (3D) que contém fibroblastos, como T-Skin e EpiDerm-FT. No entanto, esses modelos são cultivados sob condições estáticas, o que os torna incapazes de representar com precisão as condições fisiológicas humanas.

O interesse recente tem focado na geração de modelos in vitro de pele 3D em formatos de inserção de cultura celular (CCI) com perfusão dinâmica^{13,14,15,16,17,18,19}. No entanto, esses sistemas não podem ser considerados stricto sensu como microfluidic skin-on-chips, conforme sua definição clássica no campo. A definição de Ingber para órgãos-em-um-chip afirma que o órgão deve ser colocado dentro dos canais microfluidos, condição que apenas alguns dispositivos cumprem^20,21. A pele sobre chips modelou até agora epithelia simples como camadas de células únicas e/ou camadas de células dérmicas separadas por uma membrana porosa^22,23. Embora tenha havido alguns avanços modelando a pele em sistemas microfluidos^16,24, atualmente não há literatura mostrando um sistema órgão-em-um-chip que se encaixe na definição de Ingber, capaz de produzir uma pele multicamadas in situ e incluindo componentes epiteliais e estrânicos.

Neste trabalho, uma nova plataforma microfluida baseada em vinil, econômica e robusta para aplicações de pele em um chip, é apresentada. Esta plataforma foi produzida pela micro-usinagem, que proporciona mais simplicidade no processo de fabricação, além de maior flexibilidade e versatilidade no layout do dispositivo, superando algumas das limitações do PDMS²⁵. Também foi projetada uma maneira de introduzir uma construção de pele simplificada através de um fluxo paralelo controlado com bombas de seringa. O fluxo paralelo permite que dois fluidos com viscosidades muito diferentes (um pré-gel tampão e fibrina neste caso) sejam perfundidos através de um canal sem se misturarem. Como prova de conceito, foi introduzido no dispositivo uma construção dermo-epidérmica contendo fibroblastos embutidos em uma matriz fibrina imitando a derme, além da qual uma monocamada de queratinócitos foi carregada para emular a epiderme indiferenciada. A altura do compartimento dérmico pode ser modulada modificando as taxas de fluxo. A principal novidade deste trabalho, em comparação com os modelos descritos anteriormente^{22,26,27,28,29}, é o desenvolvimento de uma construção 3D dentro de uma microcâmara por meio de microfluidos. Embora este artigo apresente uma pele simplificada e indiferenciada, o objetivo a longo prazo é gerar e caracterizar uma construção de pele totalmente diferenciada para demonstrar sua viabilidade e funcionalidade para fins de testes medicamentosos e cosméticos.

Protocol

1. Projeto de chip e parâmetros de micromaquinção

1. Projetar as camadas de chip microfluidos com software de design de código aberto FreeCAD; consulte a Tabela 1 para as dimensões dos canais. Inclua quatro orifícios de 2,54 mm de diâmetro no design para usar um alinhador personalizado para uma superposição de camada correta.

	Comprimento (μm)	Largura (μm)
Câmara inferior	28,400	800
Câmara superior	31,000	800

Tabela 1: Dimensões dos canais superior e inferior do dispositivo.

2. Corte 95 folhas de vinil transparentes e de 95 μm de espessura, adesivas e transparentes em quadrados de 30 cm x 30 cm para caber corretamente no plotter.
3. Use o software Brother CanvasWorkspace para criar um espaço de trabalho de 30 cm x 30 cm e preenchê-lo com os padrões projetados para as diferentes camadas do chip(Figura 1A). Armazená-lo em um arquivo .svg.
4. Corte as folhas de vinil de 30 cm x 30 cm com o plotdor de borda(Figura 1B-D).
   1. Coloque a folha de vinil em um tapete adesivo de aderência baixa e elimine todas as bolhas de ar, se necessário.
   2. Carregue o arquivo .svg para o plotador e defina os parâmetros de corte: lâmina de corte: nível 3; pressão de corte: nível 0; velocidade de corte: nível 1. Coloque o tapete adesivo com o vinil no plotador e inicie o processo de corte.
5. Corte o padrão do canal superior em vinil de fita dupla face de 12 μm de espessura seguindo as etapas anteriores.

Figura 1: Design de chip e processo de micromaquintura. (A) Layout de software mostrando o espaço de trabalho preenchido com os padrões superior e inferior projetados para o chip. (B) Plotter de borda durante o processo de corte; lâmina de corte, folha de vinil inteira e tapete adesivo são mostrados. (C) Vinil padronizado sendo separado da folha de corte. (D) Amostra de uma camada de vinil adesivo padronizada com o design do canal superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Fabricação de camadas PDMS

1. Misture o PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10:1 (v/v), e coloque a mistura sob vácuo por 15 minutos para remover bolhas de ar. Despeje 55 mL da mistura em um prato de cultura quadrada de 55 cm² para obter uma camada de 2 mm de espessura. Remova bolhas com uma agulha.
2. Cure a mistura (passo 2.1) em forno por 1h a 80 °C. Desenforme o PDMS e corte-o em retângulos com as dimensões do chip. Faça furos para a tubulação com uma agulha de seringa de 18 G.

3. Montagem de chips

NOTA: Para melhor compreensão, consulte a Figura 2.

1. Monte todo o dispositivo usando um alinhador para ajustar canais, entradas e tomadas corretamente. Empilhe quatro camadas de vinil (com o micropattern inferior correspondente) para a montagem do canal inferior, mantendo a fita de cobertura da camada inferior para evitar grudar no alinhador.
2. Corte e coloque a membrana porosa de policarbonato (PC) na parte superior do canal inferior para separá-la da parte superior. Tenha cuidado para não cobrir as entradas do canal inferior.
3. Adicione dez camadas de vinil com o design da câmara superior. Coloque uma camada de vinil de fita dupla face com o padrão do canal superior na parte superior. Remova o chip do alinhador e coloque-o na lâmina de vidro.
4. Coloque uma folha PDMS de 2 mm de espessura em cima da camada de vinil de fita dupla face para fornecer ancoragem adequada para a tubulação e para evitar vazamentos. Deixe um peso em cima do chip durante a noite para garantir que o chip esteja completamente impermeável. Esterilize o chip lavando 70% de v/v de etanol por 5 min, e depois lave com H₂O destilado.

Figura 2: Montagem de chip microfluido. (A) Esquema geral da montagem do dispositivo. Câmaras inferiores e superiores são compostas de quatro e onze folhas de vinil sobrepostas, respectivamente. (B) Vistas superiores e laterais do chip microfluido. Os canais superior e inferior estão representados em rosa e azul, respectivamente. (C) Imagem do conjunto do chip usando um alinhador personalizado. (D) Imagem do chip após a montagem completa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Conexões de bomba

NOTA: A representação gráfica das conexões das bombas é mostrada na Figura 3.

1. Conecte a bomba 1 à entrada da câmara superior 1 (UCi1).
2. Conecte a bomba 2 à entrada da câmara superior 2 (UCi2).
3. Conecte a bomba 3 à entrada da câmara inferior (LCi).
4. Conecte a Saída de Câmara Superior (UCo) e a Saída de Câmara Inferior (LCo) a um tubo de resíduo.
5. Conecte as seringas a cada entrada usando tubos de politefluoroetileno (PTFE) e conectores de aço inoxidável de 18 G.

Figura 3: Conexões de bomba e entradas/saídas de localização. (A) Diagrama mostrando a conexão das três bombas diferentes às suas respectivas entradas. As tomadas se conectam a um contêiner de lixo. (B) Imagem do chip com entradas e tomadas rotuladas. Abreviaturas: LCi = entrada de câmara inferior; LCo = saída de câmara inferior; UCi1 = entrada de câmara superior 1; UCi2 = entrada da câmara superior 2; UCo = saída de câmara superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Cultura celular

NOTA: A linha de células HaCaT tem origem comercial. Os fibroblastos primários humanos são provenientes de doadores saudáveis e foram obtidos a partir da coleta de amostras biológicas de origem humana registradas no Registro Nacional de Biobancos para Investigação Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".

1. Trabalhe em uma capa de cultura celular, previamente esterilizada sob luz ultravioleta e limpa com etanol.
2. Descongelar células H2B-GFP-HaCaT (queratinócitos de pele imortalizados humanos, hKCs) e fibroblastos primários GFP-humanos (hFBs) a 37 °C, adicionar 2 mL de cultura média e centrífuga por 7 min a 20 °C a 250 × g.
   NOTA: As células H2B-GFP-HaCaT são queratinócitos imortais humanos modificados para expressar uma proteína fluorescente híbrida histone H2B-green (GFP), fornecendo aos seus núcleos fluorescência verde. GFP-hFBs são fibroblastos primários humanos transformados com o vetor pLZRS-IRES-EGFP para expressar fluorescência verde citoplasmática. Essas células foram modificadas após protocolos publicados anteriormente^30,31
3. Cultura tanto hKCs quanto hFBs em 1x DMEM suplementados com 10% de soro bovino fetal e 1% de solução antibiótico/antimíctico. Pré-aqueça o meio de cultura a 37 °C antes de usar.
4. Retire as células lavando-as com 1x salina tamponada com fosfato (PBS), adicionando 2 mL de ácido tetraáctico de trippsina/etilenodiamina (EDTA) e incubando-as por 10 minutos a 37 °C.
5. Inativar trippsina adicionando 4 mL de meio de cultura. Resuspend as células, e transferi-las para um tubo de 15 mL. Remova 10 μL para contar células em uma câmara de Neubauer e determine a concentração apropriada.
6. Centrifugar o tubo de 15 mL por 7 min a 20 °C a 250 × g. Remova o supernasce e resuspenque as pelotas na concentração desejada: hFBs a 50.000 células/mL e hKCs a 5·× 10⁶ células/mL.

6. Preparação pré-gel de fibrinogen

1. Ative a trombina adicionando 1mL de CaCl₂ (1% w/v em NaCl) ao frasco.
2. Adicione os seguintes componentes para obter 1 mL de um hidrogel fibrina em uma concentração final de fibrina de 3,5 mg/mL: 59 μL de trombina ativada (10 unidades NIH/mL), 59 μL de ácido tranexamico(Tabela de Materiais,100 mg/mL), 764 μL de meio de cultura contendo 50.000 hFBs/mL, 118 μL de fibrinogênio (20 mg/mL em NaCl (0,9% w/v)).
   NOTA: O fibrinogênio deve ser adicionado no último momento.

7. Protocolo de fluxo paralelo

1. Bombeie 1x PBS com bomba 3 através da LCi a 50 μL/min durante todo o processo.
2. Bombear fluido sacrificial (1x PBS) com bomba 2 através do UCi2 a 100 μL/min.
3. Carregue a seringa com o pré-gel, coloque-a rapidamente na bomba 1 e execute-a a 200 μL/min(Figura 4A).
4. Pare as bombas 1 e 2 quando o pré-gel sair do UCo.
5. Deixe o chip sem remover a tubulação a 37 °C por pelo menos 10 minutos para permitir a gelação.
6. Meio de cultura da bomba a 50 μL/h com bomba 3 a UCi2 durante a noite.
7. Bloqueie uci1 com um boné.

8. hKCs semeadura de monocamadas

1. Verifique sob o microscópio que os hFBs estão espalhados 24 h após a geração do compartimento dérmico.
2. Introduza os hKCs com bomba 2 a UCi2 a 5 ×·10⁶ células/mL a 40 μL/min por 1 min(Figura 4B).
3. Deixe o chip durante a noite a 37 °C em uma incubadora saturada de umidade para fixação celular.
4. Bombeie meio de cultura fresca com bomba 3 somente através de LCi a 50 μL/min(Figura 4C).

Figura 4: Protocolo microfluido para a geração da construção transversal dermo-epidérmica. (A) Seção transversal mostrando o processo de fluxo paralelo para gerar o compartimento dérmico. (B) Semeador de monocamadas de cerato 24 h após geração de compartimento dérmico. (C) Manutenção da cultura celular dentro do dispositivo microfluido. (D) Recriação transversal da pele dentro do chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Ensaio de viabilidade celular

NOTA: O kit ao vivo/morto mancha células com fluorescência verde ou vermelha, dependendo de seu estado vivo ou morto. Para a adequada diferenciação de viabilidade, devem ser utilizados hKCs não fluorescentes e hFBs nesta etapa. Todas as etapas do procedimento são realizadas através da UCi2 com a bomba 2.

1. Lave o canal superior com 1x PBS por 5 min a 50 μL/min para remover o meio de cultura.
2. Bombeie ar para remover o PBS 1x a 50 μL/min.
3. Prepare a solução Calcein AM/Ethidium homodimer-1 (Live/Dead) seguindo as instruções do fabricante.
4. Bombear solução Viva/Morta a 50 μL/min por 2 min.
5. Incubar 30 min a 37 °C no escuro.
6. Lave o canal superior bombeando 1x PBS a 50 μL/min por 2 min para remover qualquer reagente restante.
7. Observe a amostra sob o microscópio confocal. Use um comprimento de onda de excitação de 495/590 nm e um comprimento de onda de emissão de 519/617 nm para células vivas e mortas, respectivamente.

Results

O chip projetado é composto por duas câmaras fluidas separadas por uma membrana pc de tamanho de poros de 5 μm que permite o crescimento da célula, permitindo a passagem de moléculas promotoras de crescimento da câmara inferior. A câmara superior contém a construção tecidual, neste caso, uma monocamadas de hKCs em um hidrogel fibrina contendo hFBs.

A altura dos canais é determinada pelo número de folhas adesivas adicionadas a cada canal. A câmara inferior é composta por 4 camadas (380 μm) e a ...

Discussion

A motivação para desenvolver esse método foi o desejo de modelar doenças de pele e estudar os efeitos de terapias novas e inovadoras em uma plataforma de alto rendimento. Até o momento, este laboratório produz esses equivalentes dermo-epidérmicos, lançando manualmente ou com a ajuda da tecnologia de bioimpressão 3D - o gel fibrin com fibroblastos em uma placa de inserção de cultura celular e semeadura dos queratinócitos em cima dele. Uma vez que os queratinócitos atingem a confluência, a cultura 3D é exposta à interface ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrina	Rottafarm		Ácido tranexâmico
Antibiótico/antimicótico	Thermo Scientific HyClone
Cloreto de cálcio	Sigma Aldrich
Placas de cultura	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Fita dupla face vinil	ATP Sistemas adesivos		GM 107CC, 12 µ m de espessura
	Irmão		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogênio	Sigma Aldrich		Extraído do plasma humano
Lâmina de vidro	Thermo Scientific
GFP-Fibroblastos dérmicos	humanos-Primários		. Presente da Dra. Marta Garcí uma
linhagem celular H2B-GFP-HaCaT	ATCC		Queratinócitos imortalizados. Presente da Dra. Marta Garcí um
kit vivo/morto	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Membrana de policarbonato	Merk TM		5 µ m tamanho do poro
Polidimetilsiloxano	Dow Corning		Sylgard 184
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich
Seringas	Terumo	5 mL
	Sigma Aldrich		10 NIH/frasco
Vinil adesivo transparente	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µ m de espessura
Trypsin / EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16 " OD, 0,020" Id