Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle tridimensionale semplificato e indifferenziato utilizzando una piattaforma microfluidica microlavorazione. Un approccio a flusso parallelo consente la deposizione in situ di un compartimento dermico per la semina di cellule epiteliali sulla parte superiore, il tutto controllato da pompe a siringa.
Abstract
Questo lavoro presenta una piattaforma microfluidica nuova, economica e affidabile con il potenziale per generare tessuti multistrato complessi. Come prova di concetto, è stata modellata una pelle umana semplificata e indifferenziata contenente un compartimento dermico (stromale) e un compartimento epidermico (epiteliale). Per raggiungere questo obiettivo, è stato sviluppato un dispositivo versatile e robusto, a base di vinile diviso in due camere, superando alcuni degli inconvenienti presenti nei dispositivi microfluidici a base di polidimetilsilossano (PDMS) per applicazioni biomediche, come l'uso di apparecchiature costose e specializzate o l'assorbimento di piccole molecole e proteine idrofobiche. Inoltre, è stato sviluppato un nuovo metodo basato sul flusso parallelo, che consente la deposizione in situ di entrambi i compartimenti dermico ed epidermico. Il costrutto cutaneo è costituito da una matrice di fibrina contenente fibroblasti primari umani e un monostrato di cheratinociti immortalizzati seminati sulla parte superiore, che viene successivamente mantenuto in condizioni di coltura dinamiche. Questa nuova piattaforma microfluidica apre la possibilità di modellare le malattie della pelle umana ed estrapolare il metodo per generare altri tessuti complessi.
Introduction
Recentemente, sono stati compiuti progressi verso lo sviluppo e la produzione di modelli in vitro di pelle umana per l'analisi della tossicità dei prodotti cosmetici e farmaceutici1. I ricercatori nelle industrie farmaceutiche e della cura della pelle hanno utilizzato animali, i topi sono i più comuni, per testare i loro prodotti2,3,4,5. Tuttavia, la sperimentazione di prodotti sugli animali non è sempre predittiva della risposta nell'uomo, che spesso porta a fallimento del farmaco o effetti avversi nell'uomo e di conseguenza a perdite economiche5,6. Il Regno Unito è stato il primo paese che ha vietato l'uso di animali per i test cosmetici nel 1998. Successivamente, nel 2013, l'UE ha vietato la sperimentazione e l'omologazione dei cosmetici negli animali (regolamento UE sui cosmetici n. 1223/2009)7.
Questo divieto è anche preso in considerazione da altri paesi come in "The Humane Cosmetics Act" negli Stati Uniti8. Oltre alle preoccupazioni etiche, le differenze anatomiche tra pelle animale e umana rendono la sperimentazione animale dispendiosa in termini di tempo, costosa e spesso inefficace. Inoltre, si prevede che le dimensioni del mercato globale dei test tossicologici in vitro raggiungeranno i 26,98 miliardi di dollari entro il 20259. Per questi motivi, è necessario sviluppare nuovi metodi e alternative per quegli studi in vitro, come i modelli bioingegnerizzati della pelle umana, che consentono di testare la sicurezza e gli effetti tossici di cosmetici e farmaci senza l'uso di animali.
Esistono due diversi tipi di modelli di pelle umana disponibili in commercio, in vitro. Il primo tipo è costituito da equivalenti epidermici stratificati contenenti più strati di cheratinociti differenzianti che vengono seminati su materiali diversi. Alcuni di essi sono stati approvati dall'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) e convalidati dal Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) per i test di corrosione e irritazione cutanea, come EpiDerm o SkinEthic10,11,12. Il secondo tipo sono equivalenti a pelle intera con uno strato di cheratinociti umani differenzianti seminati su un'impalcatura tridimensionale (3D) che contiene fibroblasti, come T-Skin ed EpiDerm-FT. Tuttavia, questi modelli sono coltivati in condizioni statiche, il che li rende incapaci di rappresentare con precisione le condizioni fisiologiche umane.
L'interesse recente si è concentrato sulla generazione di modelli cutanei 3D in vitro in formati di inserto di coltura cellulare (CCI) con perfusione dinamica13,14, 15,16,17,18,19. Tuttavia, questi sistemi non possono essere considerati stricto sensu come skin-on-chip microfluidici secondo la loro definizione classica nel campo. La definizione di Ingber per organs-on-a-chip afferma che l'organo deve essere collocato all'interno dei canali microfluidici, che è una condizione che solo pochi dispositivi soddisfano20,21. Skin-on-chips hanno finora modellato per lo più epiteli semplici come strati unicellulari e / o strati cellulari dermici separati da una membrana porosa22,23. Sebbene ci siano stati alcuni progressi nella modellazione della pelle nei sistemi microfluidici16,24, attualmente non esiste letteratura che mostri un sistema organ-on-a-chip che si adatti alla definizione di Ingber, in grado di produrre una pelle multistrato in situ e comprendente sia componenti epiteliali che stromali.
In questo lavoro, viene presentata una nuova piattaforma microfluidica a base di vinile, economica, robusta e per applicazioni skin-on-a-chip. Questa piattaforma è stata prodotta mediante micro-lavorazione, che fornisce maggiore semplicità nel processo di fabbricazione, nonché una maggiore flessibilità e versatilità nel layout del dispositivo, superando alcuni dei limiti di PDMS25. È stato inoltre progettato un modo per introdurre un costrutto cutaneo semplificato attraverso un flusso parallelo controllato con pompe a siringa. Il flusso parallelo consente di perfusare due fluidi con viscosità molto diverse (un tampone e un pre-gel di fibrina in questo caso) attraverso un canale senza mescolarsi tra loro. Come prova di concetto, nel dispositivo è stato introdotto un costrutto dermo-epidermico contenente fibroblasti incorporati in una matrice di fibrina che imita il derma, in cima al quale è stato caricato un monostrato di cheratinociti per emulare l'epidermide indifferenziata. L'altezza del compartimento dermico può essere modulata modificando le portate. La principale novità di questo lavoro, rispetto ai modelli precedentemente descritti22,26,27,28,29,è lo sviluppo di un costrutto 3D all'interno di una microcamera per mezzo della microfluidica. Sebbene questo articolo presenti una pelle indifferenziata semplificata, l'obiettivo a lungo termine è quello di generare e caratterizzare un costrutto cutaneo completamente differenziato per dimostrare la sua vitalità e funzionalità a scopo di test farmacologici e cosmetici.
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Protocol
1. Progettazione del chip e parametri di microlavorazione
- Progettare gli strati di chip microfluidici con il software di progettazione open source FreeCAD; fare riferimento alla Tabella 1 per le dimensioni dei canali. Includere quattro fori di diametro di 2,54 mm nel progetto per utilizzare un allineatore personalizzato per una corretta sovrapposizione dello strato.
| Lunghezza (μm) | Larghezza (μm) | |
| Camera inferiore | 28,400 | 800 |
| Camera superiore | 31,000 | 800 |
Tabella 1: Dimensioni dei canali superiore e inferiore del dispositivo.
- Tagliare fogli di vinile trasparente adesivi di 95 μm di spessore in quadrati di 30 cm x 30 cm per adattarli correttamente al plotter.
- Utilizzare il software Brother CanvasWorkspace per creare uno spazio di lavoro di 30 cm x 30 cm e riempirlo con i modelli progettati per i diversi livelli del chip (Figura 1A). Archivialo in un file .svg.
- Tagliare i fogli di vinile da 30 cm x 30 cm con il plotter di bordo (Figura 1B-D).
- Attaccare il foglio di vinile a un tappetino adesivo a bassa aderenza ed eliminare tutte le bolle d'aria, se necessario.
- Caricare il file .svg sul plotter e impostare i parametri di taglio: lama di taglio: livello 3; pressione di taglio: livello 0; velocità di taglio: livello 1. Posizionare il tappetino adesivo con il vinile nel plotter e avviare il processo di taglio.
- Tagliare il modello del canale superiore su vinile a nastro biadesivo spesso 12 μm seguendo i passaggi precedenti.
Figura 1: Progettazione del chip e processo di microlavorazione. (A) Layout del software che mostra lo spazio di lavoro riempito con i modelli superiore e inferiore progettati per il chip. (B) Plotter di spigoli durante il processo di taglio; vengono mostrati lama da taglio, foglio intero in vinile e tappetino adesivo. (C) Vinile a motivi geometrici staccato dal foglio tagliato. (D) Campione di uno strato di vinile adesivo modellato con il design del canale superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Fabbricazione dello strato PDMS
- Mescolare il PDMS e l'agente polimerizzante in un rapporto di 10:1 (v/v) e porre la miscela sotto vuoto per 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Versare 55 ml del composto in una coltura quadrata di 55 cm2 per ottenere uno strato di 2 mm di spessore. Rimuovere le bolle con un ago.
- Polimerizzare la miscela (fase 2.1) in forno per 1 ora a 80 °C. Sformare il PDMS e tagliarlo in rettangoli con le dimensioni del chip. Fai dei fori per il tubo con un ago per siringa da 18 G.
3. Assemblaggio del chip
NOTA: per una migliore comprensione, vedere la Figura 2.
- Assemblare l'intero dispositivo utilizzando un allineatore per regolare correttamente canali, prese e prese. Accumulare quattro strati di vinile (con il corrispondente micropattern inferiore) per assemblare il canale inferiore, mantenendo il nastro di copertura dello strato inferiore per evitare di attaccarsi all'allineatore.
- Tagliare e posizionare la membrana porosa in policarbonato (PC) sopra il canale inferiore per separarla da quella superiore. Fare attenzione a non coprire le insenature del canale inferiore.
- Aggiungi dieci strati di vinile con il design della camera superiore. Attaccare uno strato di vinile a nastro biadesivo con il motivo del canale superiore sulla parte superiore. Rimuovere il chip dall'allineatore e incollarlo sulla diapositiva di vetro.
- Posizionare un foglio PDMS di 2 mm di spessore sopra lo strato di vinile a nastro biadesivo per fornire un ancoraggio appropriato per il tubo ed evitare perdite. Lasciare un peso sulla parte superiore del chip durante la notte per garantire che il chip sia completamente impermeabile. Sterilizzare il chip lavando il 70% v/v di etanolo per 5 minuti, quindi lavare con H2O distillato.
Figura 2: Assemblaggio di chip microfluidici. (A) Schema generale dell'insieme del dispositivo. Le camere inferiore e superiore sono composte rispettivamente da quattro e undici fogli di vinile sovrapposti. (B) Viste superiori e laterali del chip microfluidico. I canali superiore e inferiore sono rappresentati rispettivamente in rosa e blu. (C) Immagine dell'assemblaggio del chip utilizzando un allineatore su misura. (D) Immagine del chip dopo l'assemblaggio completo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Connessioni della pompa
NOTA: la rappresentazione grafica delle connessioni delle pompe è illustrata nella Figura 3.
- Collegare la pompa 1 all'ingresso della camera superiore 1 (UCi1).
- Collegare la pompa 2 all'ingresso 2 della camera superiore (UCi2).
- Collegare la pompa 3 all'ingresso della camera inferiore (LCi).
- Collegare l'uscita della camera superiore (UCo) e l'uscita della camera inferiore (LCo) a un tubo di scarico.
- Collegare le siringhe a ciascun ingresso utilizzando tubi in politetrafluoroetilene (PTFE) e connettori in acciaio inossidabile da 18 G.
Figura 3: Connessioni delle pompe e posizione delle prese/uscite. (A) Diagramma che mostra il collegamento delle tre diverse pompe alle rispettive prese. Le prese si collegano a un contenitore per i rifiuti. (B) Immagine del chip con prese e uscite etichettate. Abbreviazioni: LCi = ingresso camera inferiore; LCo = uscita camera inferiore; UCi1 = ingresso camera superiore 1; UCi2 = ingresso camera superiore 2; UCo = uscita camera superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Coltura cellulare
NOTA: La linea cellulare HaCaT ha un'origine commerciale. I fibroblasti primari umani provengono da donatori sani e sono stati ottenuti dalla raccolta di campioni biologici di origine umana registrati nel "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
- Lavora in una cappa di coltura cellulare, precedentemente sterilizzata sotto luce ultravioletta e pulita con etanolo.
- Scongelare le cellule H2B-GFP-HaCaT (cheratinociti cutanei immortalizzati umani, hKCs) e i fibroblasti primari GFP-umani (hFB) a 37 °C, aggiungere 2 mL di terreno di coltura e centrifugare per 7 minuti a 20 °C a 250 × g.
NOTA: Le cellule H2B-GFP-HaCaT sono cheratinociti immortalizzati umani modificati per esprimere una proteina fluorescente ibrida di istone H2B-verde (GFP), fornendo ai loro nuclei una fluorescenza verde. I GFP-hFB sono fibroblasti primari umani trasformati con il vettore pLZRS-IRES-EGFP per esprimere la fluorescenza verde citoplasmatica. Queste cellule sono state modificate seguendo i protocolli30,31 precedentemente pubblicati - Coltura sia di hKCs che di hFB in 1x DMEM integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di soluzione antibiotica/antimicotica. Preriscaldarsi del terreno di coltura a 37 °C prima dell'uso.
- Staccare le cellule lavandole con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), aggiungendo 2 ml di tripsina/acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) e incubandole per 10 minuti a 37 °C.
- Inattivare la tripsina aggiungendo 4 ml di terreno di coltura. Risuspendare le cellule e trasferirle in un tubo da 15 ml. Rimuovere 10 μL per contare le cellule su una camera Neubauer e determinare la concentrazione appropriata.
- Centrifugare il tubo da 15 mL per 7 min a 20 °C a 250 × g. Rimuovere il surnatante e risuscivare i pellet alla concentrazione desiderata: hFB a 50.000 cellule/mL e hKCs a 5,× 106 celle/mL.
6. Preparazione pre-gel di fibrinogeno
- Attivare la trombina aggiungendo 1 mL di CaCl2 (1% p/v in NaCl) al flaconcino.
- Aggiungere i seguenti componenti per ottenere 1 mL di idrogel di fibrina ad una concentrazione finale di fibrina di 3,5 mg/mL: 59 μL di trombina attivata (10 unità NIH/mL), 59 μL di acido tranexamico (Tabella dei materiali,100 mg/mL), 764 μL di terreno di coltura contenente 50.000 hFB/mL, 118 μL di fibrinogeno (20 mg/mL in NaCl (0,9% p/v)).
NOTA: Il fibrinogeno deve essere aggiunto all'ultimo momento.
7. Protocollo a flusso parallelo
- Pompa 1x PBS con pompa 3 attraverso l'LCi a 50 μL/min durante l'intero processo.
- Pompa fluido sacrificale (1x PBS) con pompa 2 attraverso l'UCi2 a 100 μL/min.
- Caricare la siringa con il pre-gel, posizionarla rapidamente nella pompa 1 ed eseguirla a 200 μL/min (Figura 4A).
- Arrestare le pompe 1 e 2 una volta che il pre-gel esce dall'UCo.
- Lasciare il chip senza rimuovere il tubo a 37 °C per almeno 10 minuti per consentire la gelificazione.
- Mezzo di coltura della pompa a 50 μL/h con pompa da 3 a UCi2 durante la notte.
- Blocca UCi1 con un tappo.
8. Semina monostrato hKCs
- Controllare al microscopio che gli hFB siano distribuiti 24 ore dopo la generazione del compartimento dermico.
- Introdurre gli hKC con pompa da 2 a UCi2 a 5 ×·106 celle/mL a 40 μL/min per 1 min (Figura 4B).
- Lasciare il chip durante la notte a 37 °C in un incubatore saturo di umidità per il fissaggio della cella.
- Pompare il terreno di coltura fresco con pompa 3 solo attraverso LCi a 50 μL/min (Figura 4C).
Figura 4: Protocollo microfluidico per la generazione del costrutto dermo-epidermico. (A) Sezione trasversale che mostra il processo di flusso parallelo per generare il compartimento dermico. (B) Semina monostrato di cheratinociti 24 ore dopo la generazione del compartimento dermico. (C) Manutenzione della coltura cellulare all'interno del dispositivo microfluidico. (D) Ricreazione in sezione trasversale della pelle all'interno del chip. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
9. Saggio di vitalità cellulare
NOTA: il kit Live/Dead colora le cellule con fluorescenza verde o rossa a seconda del loro stato vivo o morto. Per una corretta differenziazione della redditività, in questa fase devono essere utilizzati hKC e hFB non fluorescenti. Tutte le fasi della procedura vengono eseguite tramite UCi2 con pompa 2.
- Lavare il canale superiore con 1x PBS per 5 min a 50 μL/min per rimuovere il terreno di coltura.
- Pompare aria per rimuovere il PBS 1x a 50 μL/min.
- Preparare la soluzione calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) seguendo le istruzioni del produttore.
- Pompare la soluzione Live/Dead a 50 μL/min per 2 min.
- Incubare 30 min a 37 °C al buio.
- Lavare il canale superiore pompando 1x PBS a 50 μL/min per 2 min per rimuovere il reagente rimanente.
- Osservare il campione al microscopio confocale. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 495/590 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 519/617 nm rispettivamente per le cellule vive e morte.
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Representative Results
Il chip progettato è composto da due camere fluidiche separate da una membrana PC di 5 μm di dimensioni dei pori che consente la crescita della cellula consentendo il passaggio di molecole che promuovono la crescita dalla camera inferiore. La camera superiore contiene il costrutto tissutale, in questo caso, un monostrato di hKCs su un idrogel di fibrina contenente hFB.
L'altezza dei canali è determinata dal numero di fogli adesivi aggiunti a ciascun canale. La camera inferiore è composta da 4 strati (380 μm) e quello superiore da 10 strati di nastro unilaterale e uno a doppia faccia (962 μm). Le dimensioni del chip sono 4 cm x 2 cm, il che migliora la sua manipolazione. I fogli adesivi in vinile forniscono tenuta all'acqua e trasparenza per l'ispezione visiva del dispositivo. Lo strato PDMS è stato utile per il corretto ancoraggio di llthe tubing per evitare eventuali perdite dai fori in cui sono stati fissati i tubi.
Secondo la letteratura pubblicata, l'iniettabilità di idrogel contenenti cellule in camere microfluidiche utilizzando pompe a siringa non è stata riportata fino ad oggi. Per questo motivo, è stato necessario valutare l'iniettabilità del pre-gel di fibrina. Abbiamo osservato che sotto un flusso di 50 μL/min, la siringa era bloccata. Tuttavia, portate superiori a 200 μL/min potrebbero danneggiare le cellule. Sono stati condotti studi reologici per testare il comportamento di assottigliamento al taglio del pre-gel di fibrina, ottenendo viscosità da 10 a 50 cP all'interno dell'intervallo di portata selezionato (50-200 μL/min). Questi risultati hanno contribuito a stabilire le condizioni di lavoro di questo sistema.
In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di flusso parallelo basato sulla generazione di due flussi laminari sovrapposti, quello inferiore è il pre-gel, mentre quello superiore era liquido sacrificale (PBS). Risolvendo numericamente le equazioni di Navier-Stokes e imponendo le condizioni al contorno appropriate, abbiamo scoperto che c'erano più soluzioni possibili per ottenere l'altezza desiderata. Considerando i limiti di velocità di taglio stabiliti in precedenza, per ottenere un idrogel di circa 500 μm di altezza, le portate erano rispettivamente di 104 e 222 μL/min per il PBS sacrificale e il pre-gel. In pratica, microflussi di 100 e 200 μL/min sono stati utilizzati per semplicità. Quando sono stati reinsediati nel modello, questi valori hanno portato a un'altezza del gel di 576 μm, molto simile ai valori attesi (Figura 5B). Per verificare sperimentalmente il funzionamento del metodo proposto, è stata misurata l'altezza dell'idrogel lungo la camera superiore. È stata osservata un'altezza media di 550 μm (Figura 5A), abbastanza simile alla previsione del nostro modello matematico.
Figura 5: Soluzioni matematiche a flusso parallelo per scegliere i flussi appropriati di pre-gel e fluido sacrificale per ottenere l'altezza dermica desiderata. (A) Vista frontale dell'immagine confocale di hKC seminati sopra il gel di fibrina per valutarne l'altezza. (B) Soluzione matematica per diverse altezze a seconda delle portate pre-gel e PBS. Abbreviazioni: hKCs = cheratinociti cutanei immortalizzati umani; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Quando si stabilisce il protocollo all'inizio, PBS non è stato lavato attraverso il canale inferiore, portando a discrepanze tra l'altezza teorica del gel e quella misurata. Questa differenza di altezza è stata di circa il 40% rispetto a quella stimata (Figura 6). Una volta ottimizzato il protocollo e pompato PBS attraverso la camera inferiore, questa perdita di altezza è stata risolta (Figura 5).
Figura 6: Vista confocale degli hKC seminati sopra l'idrogel per misurarne l'altezza quando pbs non è stato pompato attraverso la camera inferiore. Abbreviazioni: hKCs = cheratinociti cutanei immortalizzati umani; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La Figura 7A mostra un'immagine fluorescente della camera superiore contenente un idrogel di fibrina con GFP-hFB incorporati, dimostrando che 24 ore dopo il caricamento, le celle sono uniformemente distribuite lungo la camera e ben distribuite. La Figura 7B mostra GFP-hKC confluenti seminati sopra l'idrogel.
Figura 7: Immagini di fluorescenza del canale superiore che mostrano diverse cellule seminate nel dispositivo. (A) Vista dall'alto della camera superiore 24 ore dopo il protocollo a flusso parallelo che mostra gli hFB incorporati nel gel di fibrina. B)GFP-hCC confluenti seminati sopra l'idrogel 24 ore dopo la generazione di idrogel. La linea rossa tratteggiata indica le pareti del canale. Barre di scala: 400 μm. Abbreviazioni: hFB = fibroblasti primari umani; GFP-hKCs = cheratinociti cutanei immortalizzati umani che esprimono proteine fluorescenti verdi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
È importante mantenere il sistema chiuso durante la notte fino a quando gli hKC non si sedimentano e si attaccano alla superficie dell'idrogel. Quando il tubo viene rimosso prima dell'attacco della cella, le bolle d'aria entrano nel canale e spostano le celle, portando a un monostrato confluente non uniforme, come mostrato nella Figura 8.
Figura 8: Vista dall'alto della superficie dell'idrogel quando si rimuovono i tubi immediatamente dopo la semina di hKCs. La linea rossa tratteggiata indica le pareti del canale. Barra di scala: 400 μm. Abbreviazioni: hKCs = cheratinociti cutanei immortalizzati umani. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il test di vitalità cellulare eseguito su hFB incorporati nell'idrogel è stato effettuato 24 ore dopo il caricamento utilizzando il metodo a flusso parallelo, mostrando una vitalità cellulare di ~ 95%. Lo stesso test eseguito su cellule hKCs 24 ore dopo averle seminate sull'idrogel di fibrina ha mostrato risultati simili. Il passo successivo è stato quello di generare un costrutto dermo-epidermico e studiarne la struttura utilizzando la microscopia confocale dopo 24 ore (Figura 9).
Figura 9: Immagine confocale 3D ricostruita del modello di pelle indifferenziata nel chip microfluidico. La linea tratteggiata gialla indica la superficie dell'idrogel che separa gli hKCs (in alto) dagli hFB incorporati nel gel (in basso). Abbreviazioni: hFB = fibroblasti primari umani; hKCs = cheratinociti cutanei immortalati dall'uomo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
È fondamentale trovare un equilibrio tra il comportamento di diradamento al taglio del gel di fibrinogeno e il suo tempo di gelificazione: se ci vuole troppo tempo per stabilire il flusso parallelo, coagula e blocca il sistema; se il processo di gelificazione è troppo lento, gli hFB nell'idrogel si sedimentano come mostrato nella Figura 10. Il comportamento di questo stato transitorio può essere regolato variando la concentrazione di trombina.
Figura 10: Immagine confocale di un idrogel di fibrina che mostra hFB sedimentati (in rosso) a causa di un tempo di gelificazione lenta della fibrina. Un monostrato hKCs (in blu) è mostrato sopra il gel. Abbreviazioni: hFB = fibroblasti primari umani; hKCs = cheratinociti cutanei immortalati dall'uomo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Durante la planificazione del dispositivo e le pratiche sperimentali posteriori, sono sorte alcune complicazioni che dovevano essere risolte per ottenere un dispositivo funzionante in modo ottimale e un tessuto ben strutturato. Questi problemi sono mostrati nella Tabella 2, insieme alle soluzioni per la risoluzione dei problemi.
| Problematica | Soluzioni |
| Introduzione di un idrogel 3D nella camera superiore, lasciando spazio libero sopra per seminare i cheratinociti in cima dopo la generazione dermica | Applicare un flusso parallelo di due fluidi (PBS e pre-gel) con viscosità diverse per creare un compartimento dermico ad altezza controllata. |
| Disallineamento del canale durante l'impilamento dei fogli vinilici | Utilizzo di un allineatore su misura per accumulare tutti i fogli nel posto giusto |
| Ottenere un monostrato di cheratinociti confluente sulla parte superiore del gel di fibrina per simulare l'epidermide | Consentire l'attacco cellulare al gel prima di rimuovere i tubi dal chip, impedendo alle bolle d'aria di entrare nel canale e spostando le cellule. |
| Perdita di altezza dell'idrogel lungo il canale a causa della perdita di pre-gel al canale inferiore durante il protocollo di flusso parallelo attraverso la membrana porosa. | Pompa PBS attraverso il canale inferiore durante la creazione di flussi paralleli. |
| Sedimentazione dei fibroblasti all'interno del gel | La concentrazione di trombina è stata leggermente aumentata per accelerare la gelificazione della fibrina |
Tabella 2: Problemi riscontrati durante lo sviluppo del lavoro in corso e soluzioni applicate.
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Discussion
La motivazione per sviluppare questo metodo è stato il desiderio di modellare le malattie della pelle e studiare gli effetti di terapie nuove e innovative in una piattaforma ad alto rendimento. Ad oggi, questo laboratorio produce questi equivalenti dermo-epidermici colando - manualmente o con l'aiuto della tecnologia di bioprinting 3D - il gel di fibrina con fibroblasti in una piastra di inserto per colture cellulari e seminando i cheratinociti sopra di esso. Una volta che i cheratinociti raggiungono la confluenza, la coltura 3D viene esposta all'interfaccia aria-liquido, che induce la differenziazione dei cheratinociti, generando un'epidermide stratificata e, di conseguenza, una pelle umana interfollicolare completamente sviluppata32,33,34. Tuttavia, queste colture 3D, sebbene molto rilevanti dal punto di fatto dal punto di partenza dal punto di partenza dal punto di partenza, sono costose e non imitano le condizioni fisiologiche.
La tecnologia Tissue-on-a-chip fornisce una piattaforma per emulare le condizioni fisiologiche in coltura cellulare, consentendo così una migliore comprensione della tossicità, dell'efficacia e della somministrazione dei farmaci candidati13,14, 15,16, 17,18,19,35. La maggior parte dei tessuti modellati su chip microfluidici "classici" sono composti da singoli strati di cellule, per lo più cellule epiteliali22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . La modellazione di tessuti più complessi e multistrato è stata ostacolata dalla difficoltà di generare strati di tessuto omogenei e sovrapposti.
La principale novità di questo lavoro, rispetto ai precedenti dispositivi22,43, è lo sviluppo di un metodo per generare un costrutto cutaneo indifferenziato e semplificato per mezzo della microfluidica. Inoltre, un'altra importante innovazione rispetto ad altre tecnologie pubblicate44 è la progettazione di un sistema di chip monouso relativamente semplice, economico e facile da usare realizzato con fogli di vinile biocompatibili che consentono la fabbricazione ad hoc. Questo sistema evita l'uso di wafer di silicio e complicate procedure di incollaggio al plasma necessarie con PDMS25. I chip basati su questo materiale richiedono la generazione di wafer specifici per ogni diverso design di chip, il che aumenta il prezzo del processo di prototipazione. Tutto ciò rende l'attuale tecnologia "classica" costosa, complessa e poco flessibile.
Per superare queste limitazioni, utilizzando la pelle come modello di tessuto, presentiamo una piattaforma microfluidica molto flessibile, economica e robusta basata su strati di vinile, prodotti mediante microlavorazione. Presentiamo anche una nuova metodologia basata sul flusso parallelo di fluidi laminari che consente la generazione in situ di un costrutto cutaneo a doppio strato con un compartimento dermico inferiore contenente hFB e un compartimento epidermico superiore composto da un monostrato di hKCs. Il chip è costituito da due camere separate da una membrana PC porosa. Il canale superiore contiene il costrutto cutaneo e lascia spazio libero per consentire la differenziazione e la stratificazione hKC e / o la perfusione di terreno di coltura, aria o persino farmaci in futuro. La camera inferiore è continuamente perfusa con terreno di coltura per promuovere la crescita cellulare. L'uso di una membrana porosa può portare alla perdita di una parte del pre-gel dalla camera superiore a quella inferiore quando sottoposta ad alta pressione a causa della forza di pompaggio. L'introduzione di un flusso PBS nella camera inferiore compensa questa differenza di pressione ed evita questa perdita.
La distribuzione di hKCs sulla superficie dell'idrogel è un aspetto importante quando si genera un modello di pelle. Quando non sono distribuiti in modo omogeneo, la generazione di un monostrato uniforme e, quindi, la differenziazione epidermica potrebbe essere ostacolata. Allo stesso modo, gli hFB devono essere equamente distribuiti all'interno dell'idrogel per assomigliare alla loro posizione naturale in cui si trovano nella pelle reale. Per evitare la sedimentazione cellulare o il blocco dei tubi, la composizione dell'idrogel (in particolare la concentrazione di trombina) deve essere attentamente studiata per controllare i tempi di gelificazione e il comportamento di assottigliamento del taglio.
Nonostante questi risultati incoraggianti, è necessario un lavoro futuro per dimostrare il funzionamento a lungo termine del sistema necessario per promuovere la corretta proliferazione e differenziazione del monostrato hKC per formare una pelle umana ben differenziata tra cui uno strato corneo. Oltre alla pelle, questo sistema consentirebbe la generazione di altri complessi costrutti tissutali multistrato.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo sinceramente il Dr. Javier Rodríguez, la Dott.ssa María Luisa López, Carlos Matellán e Juan Francisco Rodríguez per suggerimenti, discussioni e/o dati preliminari molto utili. Ringraziamo anche i contributi di Sergio Férnandez, Pedro Herreros e Lara Stolzenburg a questo progetto. Un ringraziamento speciale va alla dottoressa Marta García per gli hFB e gli hCC con etichetta GFP. Infine, riconosciamo l'eccellente assistenza tecnica di Guillermo Vizcaíno e Angélica Corral. Questo lavoro è stato sostenuto dal "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Progetto S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Questo lavoro è stato sostenuto anche dal "Programa de excelencia", Progetto EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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