Summary
Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.
Abstract
Dit werk presenteert een nieuw, kosteneffectief en betrouwbaar microfluïdisch platform met het potentieel om complexe meerlagige weefsels te genereren. Als proof of concept is een vereenvoudigde en ongedifferentieerde menselijke huid gemodelleerd met een dermale (stromale) en een epidermale (epitheliale) compartiment. Om dit te bereiken, is een veelzijdig en robuust, op vinyl gebaseerd apparaat ontwikkeld, verdeeld in twee kamers, waarbij enkele van de nadelen van microfluïdische apparaten op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor biomedische toepassingen, zoals het gebruik van dure en gespecialiseerde apparatuur of de absorptie van kleine, hydrofobe moleculen en eiwitten, worden overwonnen. Bovendien werd een nieuwe methode ontwikkeld op basis van parallelle stroming, die de in situ depositie van zowel de huid- als epidermale compartimenten mogelijk maakt. Het huidconstruct bestaat uit een fibrinematrix met menselijke primaire fibroblasten en een monolaag van onsterfelijke keratinocyten die bovenop zijn gezaaid, die vervolgens wordt onderhouden onder dynamische kweekomstandigheden. Dit nieuwe microfluïdische platform opent de mogelijkheid om menselijke huidziekten te modelleren en de methode te extrapoleren om andere complexe weefsels te genereren.
Introduction
Onlangs is vooruitgang geboekt in de richting van de ontwikkeling en productie van in vitro menselijke huidmodellen voor de analyse van de toxiciteit van cosmetische en farmaceutische producten1. Onderzoekers in de farmaceutische en huidverzorgingsindustrie hebben dieren gebruikt, muizen zijn de meest voorkomende, om hun producten te testen2,3,4,5. Het testen van producten op dieren is echter niet altijd voorspellend voor de respons bij mensen, wat vaak leidt tot falen van geneesmiddelen of nadelige effecten bij mensen en bijgevolg tot economische verliezen5,6. Het Verenigd Koninkrijk was in 1998 het eerste land dat het gebruik van dieren voor cosmetische tests verbood. Later, in 2013, verbood de EU het testen en toe-laten van cosmetica bij dieren (EU Cosmetics Regulation No. 1223/2009)7.
Dit verbod wordt ook door andere landen overwogen, zoals in 'The Humane Cosmetics Act' in de VS8. Naast ethische overwegingen maken de anatomische verschillen tussen dierlijke en menselijke huid dierproeven tijdrovend, duur en vaak ineffectief. Bovendien wordt verwacht dat de wereldwijde markt voor in vitro toxicologietests tegen 2025 USD 26,98 miljard zal bereiken9. Om deze redenen is het nodig om nieuwe methoden en alternatieven te ontwikkelen voor die in vitro studies, zoals bio-technische menselijke huidmodellen, die het testen op veiligheid en toxische effecten van cosmetica en geneesmiddelen mogelijk maken zonder het gebruik van dieren.
Er zijn twee verschillende soorten commercieel verkrijgbare, in vitro, menselijke huidmodellen. Het eerste type bestaat uit gestratificeerde epidermale equivalenten die meerdere lagen differentiërende keratinocyten bevatten die op verschillende materialen zijn gezaaid. Sommigen van hen zijn goedgekeurd door de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) en gevalideerd door het (European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) voor huidcorrosie- en irritatietests, zoals EpiDerm of SkinEthic10,11,12. Het tweede type zijn volledige huidequivalenten met een laag differentiërende menselijke keratinocyten gezaaid op een driedimensionale (3D) steiger die fibroblasten bevat, zoals T-Skin en EpiDerm-FT. Deze modellen worden echter gekweekt onder statische omstandigheden, waardoor ze niet in staat zijn om de menselijke fysiologische omstandigheden nauwkeurig weer te geven.
Recente interesse heeft zich gericht op het genereren van in vitro 3D-huidmodellen in celkweek-insert (CCI) formaten met dynamische perfusie13,14,15,16,17,18,19. Deze systemen kunnen echter niet worden beschouwd als stricto sensu als microfluïdische skin-on-chips volgens hun klassieke definitie in het veld. Ingber's definitie voor organen-op-een-chip stelt dat het orgaan in de microfluïdische kanalen moet worden geplaatst, wat een voorwaarde is dat slechts enkele apparaten voldoen aan20,21. Skin-on-chips hebben tot nu toe meestal eenvoudige epithelia gemodelleerd als eencellige lagen en / of dermale cellagen gescheiden door een poreusmembraan 22,23. Hoewel er enige vooruitgang is geboekt bij het modelleren van huid in microfluïdische systemen16,24, is er momenteel geen literatuur die een orgaan-op-een-chip-systeem laat zien dat voldoet aan de definitie van Ingber, in staat om een meerlagige huid in situ te produceren en zowel epitheliale als stromale componenten te bevatten.
In dit werk wordt een nieuw, kosteneffectief, robuust, op vinyl gebaseerd microfluïdisch platform voor skin-on-a-chip-toepassingen gepresenteerd. Dit platform werd geproduceerd door microbewerking, wat meer eenvoud in het fabricageproces biedt, evenals meer flexibiliteit en veelzijdigheid in de lay-out van het apparaat, waardoor enkele van de beperkingen van PDMS25worden overwonnen . Er werd ook een manier ontworpen om een vereenvoudigde huidconstructie te introduceren door middel van een parallelle stroom die wordt geregeld met spuitpompen. Parallelle stroming maakt het mogelijk om twee vloeistoffen met zeer verschillende viscositeiten (een buffer en fibrine pre-gel in dit geval) door een kanaal te laten doordringen zonder met elkaar te mengen. Als proof of concept werd een dermo-epidermaal construct met fibroblasten ingebed in een fibrinematrix die de dermis nabootst in het apparaat geïntroduceerd, waarop een monolaag van keratinocyten werd geladen om de ongedifferentieerde epidermis na te bootsen. De hoogte van het dermale compartiment kan worden gemoduleerd door de stroomsnelheden aan te passen. De belangrijkste nieuwigheid van dit werk, vergeleken met eerder beschreven modellen22,26,27,28,29,is de ontwikkeling van een 3D-constructie in een microkamer door middel van microfluïdica. Hoewel dit artikel een vereenvoudigde ongedifferentieerde huid presenteert, is het langetermijndoel om een volledig gedifferentieerd huidconstruct te genereren en te karakteriseren om de levensvatbaarheid en functionaliteit ervan voor medicijn- en cosmetische testdoeleinden aan te tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chipontwerp en microbewerkingsparameters
- Ontwerp de microfluïdische chiplagen met FreeCAD open-source ontwerpsoftware; zie tabel 1 voor de afmetingen van de kanalen. Neem vier gaten met een diameter van 2,54 mm op in het ontwerp om een op maat gemaakte aligner te gebruiken voor een juiste laagsuperpositie.
| Lengte (μm) | Breedte (μm) | |
| Tweede kamer | 28,400 | 800 |
| Bovenkamer | 31,000 | 800 |
Tabel 1: Afmetingen van de bovenste en onderste kanalen van het apparaat.
- Snijd 95 μm dikke, zelfklevende, transparante vinylplaten in vierkanten van 30 cm x 30 cm om goed in de plotter te passen.
- Gebruik de Brother CanvasWorkspace-software om een werkruimte van 30 cm x 30 cm te maken en deze te vullen met de ontworpen patronen voor de verschillende lagen van de chip(Figuur 1A). Sla het op in een .svg bestand.
- Knip de vinylplaten van 30 cm x 30 cm met de randplotter(figuur 1B-D).
- Plak het vinylvel op een kleefmat met lage kleefkracht en verwijder indien nodig alle luchtbellen.
- Upload het .svg bestand naar de plotter en stel de snijparameters in: snijmes: niveau 3; snijdruk: niveau 0; snijsnelheid: niveau 1. Plaats de lijmmat met het vinyl in de plotter en start het snijproces.
- Knip het bovenste kanaalpatroon op 12 μm dik dubbelzijdig tapevinyl door de vorige stappen te volgen.
Figuur 1: Chipontwerp en microbewerkingsproces. (A) Software-indeling met de werkruimte gevuld met zowel de bovenste als de onderste patronen die voor de chip zijn ontworpen. (B) Kantenplotter tijdens het snijproces; snijmes, hele vinylplaat en kleefmat worden getoond. (C) Vinyl met een patroon dat van de gesneden plaat wordt losgemaakt. (D) Monster van een zelfklevende vinyllaag met een patroon van het bovenste kanaalontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. PDMS laag fabricage
- Meng het PDMS en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 (v/v) en plaats het mengsel gedurende 15 minuten onder vacuüm om luchtbellen te verwijderen. Giet 55 ml van het mengsel in een 55 cm2 vierkante kweekschaal om een laag van 2 mm dik te verkrijgen. Verwijder bubbels met een naald.
- Laat het mengsel (stap 2.1) 1 uur in een oven op 80 °C uitharden. Ontsmolt het PDMS en snijd het in rechthoeken met de spaanafmetingen. Maak gaten voor de slang met een 18 G spuitnaald.
3. Chip assemblage
OPMERKING: Voor een beter begrip, zie figuur 2.
- Monteer het hele apparaat met behulp van een aligner om kanalen, inlaten en stopcontacten correct aan te passen. Stapel vier vinyllagen op (met de bijbehorende onderste micropattern) voor het monteren van het onderste kanaal, waarbij de afdektape van de onderste laag wordt behouden om te voorkomen dat deze aan de aligner blijft plakken.
- Snijd en plaats het polycarbonaat (PC) poreuze membraan bovenop het onderste kanaal om het van het bovenste kanaal te scheiden. Zorg ervoor dat u de inlaten van het onderste kanaal niet bedekt.
- Voeg tien vinyllagen toe met het ontwerp van de bovenste kamer. Plak een dubbelzijdige tape vinyllaag met daarop het bovenste kanaalpatroon. Verwijder de chip uit de aligner en plak deze op de glasplaat.
- Plaats een 2 mm dikke PDMS-plaat bovenop de dubbelzijdige tape vinyllaag om de slang op de juiste manier te verankeren en lekkage te voorkomen. Laat een gewicht een nacht op de chip liggen om ervoor te zorgen dat de chip volledig waterdicht is. Steriliseer de chip door 70% v/v ethanol gedurende 5 minuten te spoelen en vervolgens te wassen met gedestilleerd H2O.
Figuur 2: Microfluïdische chipassemblage. (A) Algemeen schema van de montage van het hulpmiddel. De onderste en bovenste kamers bestaan uit respectievelijk vier en elf boven elkaar geplaatste vinylplaten. (B) Bovenaan- en zijdelingse weergaven van de microfluïdische chip. Bovenste en onderste kanalen worden respectievelijk in roze en blauw weergegeven. (C) Afbeelding van de chipassemblage met behulp van een op maat gemaakte aligner. (D) Chipafbeelding na volledige montage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Pompaansluitingen
OPMERKING: De grafische weergave van pompaansluitingen is weergegeven in figuur 3.
- Sluit pomp 1 aan op de inlaat van de bovenste kamer 1 (UCi1).
- Sluit pomp 2 aan op de inlaat van de bovenkamer 2 (UCi2).
- Sluit pomp 3 aan op de inlaat van de onderste kamer (LCi).
- Sluit de bovenste kameruitlaat (UCo) en de onderste kameruitlaat (LCo) aan op een afvoerbuis.
- Sluit de spuiten aan op elke inlaat met behulp van buizen van polytetrafluorethyleen (PTFE) en roestvrijstalen connectoren van 18 G.
Figuur 3: Plaats van de pompaansluitingen en inlaten/uitlaatopeningen. (A) Schema met de aansluiting van de drie verschillende pompen op hun respectieve inlaten. Stopcontacten sluiten aan op een afvalcontainer. (B) Chipafbeelding met gelabelde in- en uitgangen. Afkortingen: LCi = inlaat van de onderste kamer; LCo = onderste kameruitlaat; UCi1 = bovenste kamerinlaat 1; UCi2 = bovenste kamerinlaat 2; UCo = uitlaat van de bovenste kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Celkweek
OPMERKING: De HaCaT cellijn heeft een commerciële oorsprong. Menselijke primaire fibroblasten zijn afkomstig van gezonde donoren en werden verkregen uit de verzameling biologische monsters van menselijke oorsprong geregistreerd in "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".
- Werk in een celkweekkap, eerder gesteriliseerd onder ultraviolet licht en afgeveegd met ethanol.
- Ontdooi H2B-GFP-HaCaT-cellen (menselijke vereeuwigde huidkeratinocyten, hKCs) en GFP-humane primaire fibroblasten (hFBs) bij 37 °C, voeg 2 ml kweekmedium toe en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 20 °C bij 250 × g.
OPMERKING: H2B-GFP-HaCaT-cellen zijn door de mens vereeuwigde keratinocyten die zijn gemodificeerd om een hybride histon H2B-groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie te brengen, waardoor hun kernen groene fluorescentie krijgen. GFP-hFBs zijn menselijke primaire fibroblasten die zijn getransformeerd met de vector pLZRS-IRES-EGFP om cytoplasmatische groene fluorescentie tot expressie te brengen. Deze cellen zijn gewijzigd volgens eerder gepubliceerde protocollen30,31 - Kweek zowel hKCs als hFBs in 1x DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum/antimycotische oplossing. Verwarm het kweekmedium voor gebruik bij 37 °C.
- Maak de cellen los door ze te wassen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 2 ml trypsine/ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) toe en incubeer ze gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Inactiveer trypsine door 4 ml kweekmedium toe te voegen. Resuspend de cellen en breng ze over naar een buis van 15 ml. Verwijder 10 μL om cellen op een Neubauer-kamer te tellen en bepaal de juiste concentratie.
- Centrifugeer de buis van 15 ml gedurende 7 minuten bij 20 °C bij 250 × g. Verwijder het supernatant en resuspend de pellets in de gewenste concentratie: hFBs bij 50.000 cellen/ml en hKCs bij 5·× 106 cellen/ml.
6. Fibrinogeen pre-gel voorbereiding
- Activeer trombine door 1 ml CaCl2 (1% w/v in NaCl) aan de injectieflacon toe te voegen.
- Voeg de volgende componenten toe om 1 ml fibrinehydrogel te verkrijgen bij een eindconcentratie fibrine van 3,5 mg/ml: 59 μl geactiveerd trombine (10 NIH-eenheden/ml), 59 μl tranexaminezuur (Materialentabel, 100 mg/ml), 764 μL kweekmedium met 50.000 hFBs/ml, 118 μL fibrinogeen (20 mg/ml NaCl (0,9% m/v)).
OPMERKING: Fibrinogeen moet op het laatste moment worden toegevoegd.
7. Parallel flow protocol
- Pomp 1x PBS met pomp 3 door de LCi bij 50 μL/min gedurende het hele proces.
- Pomp opofferingsvloeistof (1x PBS) met pomp 2 door de UCi2 bij 100 μL/min.
- Laad de spuit met de voorgel, plaats deze snel in pomp 1 en laat hem op 200 μL/min draaien(figuur 4A).
- Stop pompen 1 en 2 zodra de pre-gel de UCo verlaat.
- Laat de chip zonder de slang te verwijderen minstens 10 minuten bij 37 °C om gelation mogelijk te maken.
- Pompkweekmedium bij 50 μL/h met pomp 3 tot en met UCi2 's nachts.
- Blokkeer UCi1 met een pet.
8. hKCs monolayer seeding
- Controleer onder de microscoop of hFB's 24 uur na het genereren van het dermale compartiment worden verspreid.
- Introduceer de hKCs met pomp 2 tot en met UCi2 op 5 ×·106 cellen/ml bij 40 μL/min gedurende 1 min (Figuur 4B).
- Laat de chip een nacht op 37 °C in een met vochtigheid verzadigde incubator voor celaanhechting.
- Pomp vers kweekmedium met pomp 3 alleen door LCi bij 50 μL/min(figuur 4C).
Figuur 4: Microfluïdisch protocol voor het genereren van de dermo-epidermale constructie. (A) Dwarsdoorsnede die het parallelle stromingsproces toont om het dermale compartiment te genereren. (B) Keratinocyten monolaag zaaien 24 uur na het genereren van de huidcompartimenten. (C) Celkweekonderhoud in het microfluïdische apparaat. (D) Dwarsdoorsnederecreatie van de huid in de chip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
9. Test van de levensvatbaarheid van cellen
OPMERKING: Live /Dead kit kleurt cellen met groene of rode fluorescentie, afhankelijk van hun levende of dode toestand. Voor een goede differentiatie van de levensvatbaarheid moeten in deze stap niet-fluorescerende hKCs en hFB's worden gebruikt. Alle stappen in de procedure worden uitgevoerd via UCi2 met pomp 2.
- Was het bovenste kanaal met 1x PBS gedurende 5 minuten op 50 μL/min om kweekmedium te verwijderen.
- Pomp lucht om de 1x PBS bij 50 μL/min te verwijderen.
- Bereid Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) oplossing voor door de instructies van de fabrikant te volgen.
- Pomp Live/Dead oplossing bij 50 μL/min gedurende 2 min.
- Incubeer 30 min bij 37 °C in het donker.
- Was het bovenste kanaal door 1x PBS gedurende 2 minuten op 50 μL/min te pompen om het resterende reagens te verwijderen.
- Observeer het monster onder de confocale microscoop. Gebruik een excitatiegolflengte van 495/590 nm en een emissiegolflengte van 519/617 nm voor respectievelijk levende en dode cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ontworpen chip bestaat uit twee vloeibare kamers gescheiden door een 5 μm poriegrootte PC-membraan dat de groei van de cel mogelijk maakt door de doorgang van groeibevorderende moleculen uit de onderste kamer mogelijk te maken. De bovenste kamer bevat het weefselconstruct, in dit geval een monolaag van hKCs op een fibrinehydrogel die hFBs bevat.
De hoogte van de kanalen wordt bepaald door het aantal lijmplaten dat aan elk kanaal wordt toegevoegd. De onderste kamer bestaat uit 4 lagen (380 μm) en de bovenste uit 10 eenzijdige tapelagen en een dubbelzijdige (962 μm). De afmetingen van de chip zijn 4 cm x 2 cm, wat de manipulatie ervan verbetert. De zelfklevende vinylplaten bieden waterdichtheid en transparantie voor visuele inspectie van het apparaat. De PDMS-laag was nuttig voor de juiste verankering van de slang om lekkage uit de gaten waar de buizen waren bevestigd te voorkomen.
Volgens gepubliceerde literatuur is de injecteerbaarheid van celbevattende hydrogels in microfluïdische kamers met behulp van spuitpompen tot op heden niet gemeld. Om deze reden moest de injecteerbaarheid van de fibrine pre-gel worden beoordeeld. We zagen dat bij een stroom van 50 μL/min de spuit geblokkeerd was. Stroomsnelheden hoger dan 200 μL / min kunnen de cellen echter beschadigen. Reologische studies werden uitgevoerd om het schuifverdunningsgedrag van de fibrine pre-gel te testen, waardoor viscositeiten van 10 tot 50 cP binnen het geselecteerde stroomsnelheidsbereik (50-200 μL / min) werden verkregen. Deze resultaten hebben bijgedragen tot de vaststelling van de arbeidsomstandigheden van dit systeem.
In dit werk is een parallelle stromingsmethode ontwikkeld op basis van de generatie van twee boven elkaar geplaatste laminaire stromen, waarvan de onderste de voorgel is, terwijl de bovenste offervloeistof (PBS) was. Numeriek oplossend Navier-Stokes vergelijkingen en het opleggen van de juiste randvoorwaarden, ontdekten we dat er meerdere mogelijke oplossingen waren om de gewenste hoogte te verkrijgen. Rekening houdend met de eerder vastgestelde afschuifsnelheidslimieten om een hydrogel van ongeveer 500 μm hoogte te bereiken, waren de stroomsnelheden respectievelijk 104 en 222 μL / min voor de opofferende PBS en de pre-gel. In de praktijk werden microflowsnelheden van 100 en 200 μL/min gebruikt voor de eenvoud. Bij herintroducatie in het model bleken deze waarden te resulteren in een gelhoogte van 576 μm, zeer vergelijkbaar met de verwachte waarden(figuur 5B). Om de werking van de voorgestelde methode experimenteel te controleren, werd de hoogte van de hydrogel langs de bovenste kamer gemeten. Er werd een gemiddelde hoogte van 550 μm waargenomen(figuur 5A),vergelijkbaar met de voorspelling van ons wiskundig model.
Figuur 5: Parallelle stroming wiskundige oplossingen om de juiste pre-gel- en opofferingsvloeistofstromen te kiezen om de gewenste huidhoogte te verkrijgen. (A) Vooraanzicht van het confocale beeld van hKCs die bovenop de fibrinegel zijn gezaaid om de hoogte ervan te beoordelen. (B) Wiskundige oplossing voor verschillende hoogtes, afhankelijk van de pre-gel en PBS-stroomsnelheden. Afkortingen: hKCs = human immortalized skin keratinocytes; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bij het opstellen van het protocol aan het begin werd PBS niet door het onderste kanaal gespoeld, wat leidde tot discrepanties tussen de theoretische hoogte van de gel en de gemeten. Dit hoogteverschil was ~40% ten opzichte van het geschatte(figuur 6). Nadat het protocol was geoptimaliseerd en PBS door de onderste kamer was gepompt, was dit hoogteverlies opgelost(figuur 5).
Figuur 6: Confocale weergave van hKCs die bovenop de hydrogel zijn gezaaid om de hoogte ervan te meten wanneer PBS niet door de onderste kamer werd gepompt. Afkortingen: hKCs = human immortalized skin keratinocytes; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7A toont een fluorescerend bovenaanzicht van de bovenkamer met een fibrinehydrogel met ingebedde GFP-hFBs, waaruit blijkt dat cellen 24 uur na het laden gelijkmatig over de kamer zijn verdeeld en goed verspreid. Figuur 7B toont confluente GFP-hKCs gezaaid op de top van de hydrogel.
Figuur 7: Fluorescentiebeelden van het bovenste kanaal met verschillende cellen die in het apparaat zijn gezaaid. (A) Bovenaanzicht van de bovenste kamer 24 uur na parallel stroomprotocol met de hFB's ingebed in de fibrinegel. B) Confluent GFP-hKCs gezaaid op de top van de hydrogel 24 uur na hydrogelgeneratie. Onderbroken rode lijn geeft kanaalwanden aan. Schaalbalken: 400 μm. Afkortingen: hFBs = humane primaire fibroblasten; GFP-hKCs = groene fluorescerende eiwit-tot expressie brengende menselijke vereeuwigde huid keratinocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het is belangrijk om het systeem 's nachts gesloten te houden totdat het hKCs-sediment zich hecht aan het hydrogeloppervlak. Wanneer de slang wordt verwijderd voordat de cel wordt gehecht, komen luchtbellen het kanaal binnen en verplaatsen cellen, wat leidt tot een niet-eenvormige confluent monolaag, zoals weergegeven in figuur 8.
Figuur 8: Bovenaanzicht van het hydrogeloppervlak bij het verwijderen van slangen onmiddellijk na het zaaien van hKCs. Onderbroken rode lijn geeft kanaalwanden aan. Schaalbalk: 400 μm. Afkortingen: hKCs = human immortalized skin keratinocytes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De cel levensvatbaarheidstest uitgevoerd op hFB's ingebed in de hydrogel werd 24 uur na het laden uitgevoerd met behulp van de parallelle stroommethode, met een cel levensvatbaarheid van ~ 95%. Dezelfde test uitgevoerd op hKCs-cellen 24 uur na het zaaien op de fibrinehydrogel toonde vergelijkbare resultaten. De volgende stap was het genereren van een dermo-epidermaal construct en het bestuderen van de structuur ervan met behulp van confocale microscopie na 24 uur(figuur 9).
Figuur 9: Gereconstrueerd 3D confocale beeld van het ongedifferentieerde huidmodel in de microfluïdische chip. Gele stippellijn geeft het oppervlak aan van de hydrogel die hKCs (boven) scheidt van de hFB's die in de gel zijn ingebed (onder). Afkortingen: hFBs = humane primaire fibroblasten; hKCs = menselijke vereeuwigde huid keratinocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het is cruciaal om een evenwicht te vinden tussen het afschuifverdunningsgedrag van de fibrinogeengel en de gelationtijd: als het te lang duurt om de parallelle stroom tot stand te brengen, stolt en blokkeert het het systeem; als het gelationproces te langzaam verloopt, zullen hFBs in de hydrogel sediment veroorzaken zoals weergegeven in figuur 10. Het gedrag van deze voorbijgaande toestand kan worden gereguleerd door de trombineconcentratie te variëren.
Figuur 10: Confocale afbeelding van een fibrinehydrogel met gesedimenteerde hFBs (in rood) als gevolg van een langzame fibrinegeeltijd. Een hKCs monolaag (in blauw) wordt weergegeven op de bovenkant van de gel. Afkortingen: hFBs = humane primaire fibroblasten; hKCs = menselijke vereeuwigde huid keratinocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tijdens de apparaatplanificatie en posterieure experimentele praktijken deden zich enkele complicaties voor die moesten worden opgelost om een optimaal functionerend apparaat en goed gestructureerd weefsel te verkrijgen. Deze problemen worden weergegeven in tabel 2,samen met de oplossingen voor het oplossen van problemen.
| Problemen | Oplossingen |
| Introductie van een 3D-hydrogel in de bovenste kamer, waardoor er vrije ruimte boven overblijft om keratinocyten bovenop te zaaien na dermale generatie | Breng een parallelle stroom van twee vloeistoffen (PBS en pre-gel) met verschillende viscositeiten aan om een huidcompartiment met een gecontroleerde hoogte te creëren. |
| Verkeerde uitlijning van het kanaal tijdens het stapelen van vinylplaten | Gebruik van een op maat gemaakte aligner om alle vellen op de juiste plaats op te stapelen |
| Bereik een confluente keratinocyten monolaag bovenop de fibrinegel om de opperhuid te simuleren | Laat de cel zich aan de gel hechten voordat u de buizen van de chip verwijdert, zodat wordt voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen en de cellen verdringen. |
| Hydrogelhoogteverlies langs het kanaal als gevolg van pre-gel lekkage naar het onderste kanaal tijdens parallel stromingsprotocol door het poreuze membraan. | Pomp PBS door het onderste kanaal tijdens het tot stand brengen van parallelle stroming. |
| Fibroblast sedimentatie in de gel | De trombineconcentratie werd licht verhoogd om de fibrinegelatatie te versnellen |
Tabel 2: Problemen gevonden tijdens de ontwikkeling van het huidige werk en de toegepaste oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De motivatie om deze methode te ontwikkelen was de wens om huidziekten te modelleren en de effecten van nieuwe en innovatieve therapieën te bestuderen in een high-throughput platform. Tot op heden produceert dit laboratorium deze dermo-epidermale equivalenten door handmatig of met behulp van de 3D-bioprinttechnologie de fibrinegel met fibroblasten in een celkweekinbrengplaat te gieten en de keratinocyten er bovenop te zaaien. Zodra de keratinocyten samenvloeiing bereiken, wordt de 3D-cultuur blootgesteld aan de lucht-vloeistofinterface, die keratinocytendifferentiatie induceert, een gestratificeerde epidermis genereert en bijgevolg een volledig ontwikkelde interfolliculaire menselijke huid32,33,34. Deze 3D-culturen, hoewel klinisch zeer relevant, zijn echter duur, tijdrovend en bootsen geen fysiologische omstandigheden na.
Tissue-on-a-chip-technologie biedt een platform om fysiologische omstandigheden in celkweek na te bootsen, waardoor een beter begrip mogelijk wordt van de toxiciteit, werkzaamheid en afgifte van kandidaat-geneesmiddelen13,14,15,16,17,18,19,35. De meeste weefsels gemodelleerd naar microfluïdische "klassieke" chips zijn samengesteld uit enkele lagen cellen, meestal epitheelcellen22,26,42,27,28,36,37,38,39,40,41 . Het modelleren van complexere, meerlagige weefsels werd belemmerd door de moeilijkheid om homogene en gesuperponeerde weefsellagen te genereren.
De belangrijkste nieuwigheid van dit werk, in vergelijking met eerdere apparaten22,43, is de ontwikkeling van een methode om een ongedifferentieerde en vereenvoudigde huidconstructie te genereren door middel van microfluïdica. Bovendien is een andere belangrijke innovatie met betrekking tot andere gepubliceerde technologieën44 het ontwerp van een relatief eenvoudig, kosteneffectief, gebruiksvriendelijk wegwerpchipsysteem gemaakt van biocompatibele vinylplaten die ad hoc fabricage mogelijk maken. Dit systeem vermijdt het gebruik van siliciumwafers en gecompliceerde plasmabindingsprocedures die nodig zijn met PDMS25. Chips op basis van dit materiaal vereisen de generatie van wafers die specifiek zijn voor elk ander chipontwerp, wat de prijs van het prototyping-proces verhoogt. Dit alles maakt de huidige "klassieke" technologie duur, complex en niet erg flexibel.
Om deze beperkingen te overwinnen, met behulp van huid als weefselmodel, presenteren we een zeer flexibel, goedkoop en robuust microfluïdisch platform op basis van vinyllagen, geproduceerd door micromachining. We presenteren ook een nieuwe methodologie op basis van de parallelle stroom van laminaire vloeistoffen die de in situ generatie van een dubbellaags huidconstruct mogelijk maakt met een onderste dermale compartiment met hFBs en een bovenste epidermaal compartiment bestaande uit een monolaag van hKCs. De chip bestaat uit twee kamers gescheiden door een poreus PC-membraan. Het bovenste kanaal bevat de huidconstructie en laat vrije ruimte om hKC-differentiatie en stratificatie en / of perfusie van kweekmedium, lucht of zelfs drugs in de toekomst mogelijk te maken. De onderste kamer is continu doordrenkt met kweekmedium om de celgroei te bevorderen. Het gebruik van een poreus membraan kan leiden tot het verlies van een deel van de pre-gel van de bovenste kamer naar de onderste bij hoge druk als gevolg van pompkracht. Het introduceren van een PBS-debiet in de onderste kamer compenseert dit drukverschil en voorkomt deze lekkage.
De verdeling van hKCs op het hydrogeloppervlak is een belangrijk aspect bij het genereren van een huidmodel. Wanneer ze niet homogeen verspreid zijn, kan de generatie van een uniforme monolaag en dus de epidermale differentiatie worden belemmerd. Op dezelfde manier moeten hFB's gelijk verdeeld zijn in de hydrogel om te lijken op hun natuurlijke locatie waar ze in de echte huid worden aangetroffen. Om celbezinking of verstumming van slangen te voorkomen, moet de samenstelling van hydrogel (met name trombineconcentratie) zorgvuldig worden bestudeerd om de gelationtijden en het dunner wordende gedrag van de afschuif te beheersen.
Ondanks deze bemoedigende bevindingen is toekomstig werk nodig om de werking op lange termijn van het systeem aan te tonen dat nodig is om de juiste proliferatie en differentiatie van de hKC-monolaag te bevorderen om een goed gedifferentieerde menselijke huid te vormen, inclusief een stratum corneum. Naast huid zou dit systeem het genereren van andere complexe, meerlagige weefselconstructies mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán en Juan Francisco Rodríguez oprecht voor zeer nuttige suggesties, discussies en/of voorlopige gegevens. We bedanken ook de bijdragen van Sergio Férnandez, Pedro Herreros en Lara Stolzenburg aan dit project. Speciale dank gaat uit naar Dr. Marta García voor GFP-gelabelde hFBs en hKCs. Tot slot erkennen we de uitstekende technische assistentie van Guillermo Vizcaíno en Angélica Corral. Dit werk werd ondersteund door het "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Dit werk werd ook ondersteund door het "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | - | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
References
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
- Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
- Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A.
- H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
- Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
- Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B.
- OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
- Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
- vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
- Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
- Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526 (2015).
- Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43 (2018).
- Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
- Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471 (2016).
- Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
- Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898 (2020).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
- Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
- Poceviciute, R., Ismagilov, R. F.
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
- Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
- Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
- Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006 (2016).
- Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535 (2016).
- Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
- Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).
