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Biology

Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.

Abstract

La spectroscopie ultrarapide de pince de force (UFFCS) est une technique à molécule unique basée sur des pinces laser qui permet d’étudier la chimiomécanique des myosines conventionnelles et non conventionnelles sous charge avec une résolution temporelle sans précédent. En particulier, la possibilité de sonder les moteurs de myosine sous force constante juste après la formation de la liaison actine-myosine, ainsi que le taux élevé de retour de force (200 kHz), ont montré que l’UFFCS est un outil précieux pour étudier la dépendance de charge de dynamiques rapides telles que la course de travail de la myosine. De plus, UFFCS permet d’étudier comment les interactions processives et non processives myosine-actine sont influencées par l’intensité et la direction de la force appliquée.

En suivant ce protocole, il sera possible d’effectuer des expériences de serrage de force ultrarapides sur des moteurs de myosine-5 processive et sur une variété de myosines non conventionnelles. Par quelques ajustements, le protocole pourrait également être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs tels que les kinésines et les dynéines. Le protocole comprend toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par les procédures d’étalonnage, l’acquisition et l’analyse des données.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les pinces optiques ont été un outil précieux pour élucider la mécanochimie des interactions protéiques au niveau de la molécule unique, en raison de la possibilité frappante de manipulation et de mesure simultanées des changements conformationnels et de la cinétique enzymatique 1,2. En particulier, la capacité d’appliquer et de mesurer des forces dans la gamme de celles exercées par les moteurs moléculaires dans la cellule, ainsi que la capacité de mesurer les changements conformationnels subnanométriques, ont fait des pincettes optiques un outil unique à molécule unique pour démêler les propriétés chimiomécaniques des protéines motrices et leur régulation mécanique.

La spectroscopie ultrarapide de serrage de force (UFFCS) est une technique de spectroscopie de force à molécule unique basée sur des pinces optiques, développée pour étudier la cinétique rapide des moteurs moléculaires sous charge dans une géométrie à trois billes (Figure 1a)3,4. L’UFFCS réduit le délai d’application de la force à la protéine motrice à la limite physique des pincettes optiques, c’est-à-dire le temps de relaxation mécanique du système, permettant ainsi l’application de la force rapidement après le début d’une poussée de myosine (quelques dizaines de microsecondes)3. Cette capacité a été exploitée pour étudier les premiers événements mécaniques de la myosine musculaire rapide squelettique 3 et cardiaque5 afin de révéler la dépendance de charge du coup de puissance, les états de liaison faible et forte, ainsi que l’ordre des événements biochimiques (Pi) et mécaniques (coup de puissance).

La géométrie à trois billes est généralement utilisée pour étudier les moteurs non processifs, une géométrie à une seule bille avec une pince de force a été couramment utilisée pour étudier les myosines non conventionnelles processives telles que la myosine Va6. Cependant, il y a plusieurs raisons de préférer un test UFFCS à trois billes également pour les myosines processives. Tout d’abord, l’application rapide de la charge juste après la liaison actine-myosine permet de mesurer les événements précoces dans le développement de la force comme dans les moteurs non processifs. En outre, dans le cas des moteurs processifs, il permet également une mesure précise des longueurs de course du moteur et de leurs durées de fonctionnement à force constante tout au long de leur progression (Figure 1b). De plus, en raison du taux élevé de retour de force, le système peut maintenir la force constante lors de changements rapides de position, tels que la course de travail de myosine, garantissant ainsi une charge constante pendant le pas moteur. La résolution temporelle élevée du système permet la détection des interactions sub-ms, ouvrant la possibilité d’étudier la faible liaison de la myosine à l’actine. Enfin, la géométrie du dosage garantit que la force est appliquée le long du filament d’actine, avec des composantes transversales et verticales négligeables de la force. Ce point est d’autant plus important que la composante de force verticale influence de manière significative la dépendance à la charge de la cinétique du moteur 7,8. En utilisant cette technique, nous avons pu appliquer une gamme de charges assistives et résistives à la myosine-5B processive et mesurer directement la dépendance de charge de sa processivité pour une large gamme de forces4.

Comme le montre la figure 1a, dans ce système, un seul filament d’actine est suspendu entre deux billes de polystyrène piégées dans le foyer d’une pince optique double (l'« haltère »). Une force nette déséquilibrée F= F1-F 2 est imposée au filament, grâce à un système de rétroaction rapide, qui fait que le filament se déplace à vitesse constante dans une direction jusqu’à ce qu’il atteigne un point d’inversion défini par l’utilisateur où la force nette est inversée dans la direction opposée. Lorsque la protéine motrice n’interagit pas avec le filament, l’haltère est libre de se déplacer d’avant en arrière en forme d’onde triangulaire (Figure 1b, panneau inférieur) couvrant le cordon du piédestal sur lequel une seule protéine motrice est fixée. Une fois l’interaction établie, la force portée par l’haltère est très rapidement transférée à la protéine motrice et le moteur commence à déplacer le filament en passant sous l’intensité et la direction de la force appliquée par le système de rétroaction au moment de l’interaction, jusqu’à ce que la myosine se détache de l’actine. Étant le déplacement produit par le pas du moteur dépendant de la polarité du filament d’actine piégé, selon la direction de la force appliquée, la charge peut être soit assistée, c’est-à-dire poussée dans la même direction que le déplacement du moteur (poussée dans le panneau supérieur de la figure 1b), soit résistive, c’est-à-dire tirant dans la direction opposée par rapport au déplacement du moteur (traction à la figure 1b panneau supérieur) permettant d’étudier la régulation chimiomécanique de la processivité motrice tant par l’intensité que par la directionnalité de la charge appliquée.

Dans les sections suivantes, toutes les étapes pour mesurer les interactions actine-myosine-5B sous différentes charges avec une configuration de spectroscopie à pince de force ultrarapide sont entièrement décrites, y compris 1) la mise en place de la configuration optique, l’alignement des pièges optiques et les procédures d’étalonnage, 2) la préparation de tous les composants et leur assemblage dans la chambre d’échantillonnage, 3) la procédure de mesure, 4) des données représentatives et une analyse des données pour extraire des paramètres physiques importants, tels que la longueur de la course, la taille du pas et la vitesse de la protéine motrice.

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Protocol

1. Configuration optique

REMARQUE: La configuration expérimentale est composée de pincettes optiques doubles avec une stabilité de pointage nanométrique et < fluctuations d’intensité laser de 1%. Dans ces conditions, la stabilité de l’haltère au niveau nanométrique est garantie sous la rigidité typique du piège (0,1 pN/nm) et la tension (1 pN - quelques dizaines de pN). La figure 2 montre un schéma détaillé de la configuration optique.

  1. Conception et construction de pinces optiques 9,10,11.
    1. Placez tous les composants de la configuration sur une table optique selon le schéma de la figure 2. Notez que le tableau optique comprend des isolateurs actifs pour minimiser les vibrations mécaniques. De plus, la structure du microscope est montée sur des isolateurs élastomères pour absorber le bruit acoustique et les résonances mécaniques.
    2. Insérez un isolateur optique à proximité de la source laser (« OI » de la figure 2), afin d’éviter les fluctuations d’amplitude aléatoires dues à la rétroaction optique.
    3. Scellez l’ensemble du trajet dans une boîte fermée pour réduire le courant d’air et les turbulences qui pourraient avoir un impact sur la stabilité du pointage laser.
    4. Créez les pincettes optiques doubles en divisant la source laser principale (laser Nd:YAG, longueur d’onde de 1 064 nm sur la figure 2) en deux branches avec des polarisations orthogonales à l’aide de séparateurs de faisceau polarisant (PBS). Les pièges à temps partagé sont à éviter car ils induisent une oscillation de l’haltère sous tension12.
    5. Utilisez deux déflecteurs acousto-optiques (AOD sur la Figure 2) pilotés par des synthétiseurs numériques directs (DDS) pour permettre des mouvements fins et rapides des deux pièges et une régulation précise de la tension de l’actine en pilotant directement les DDS à travers les sorties numériques de la carte FPGA Gate Array programmable sur le terrain (voir Figure 2).
      REMARQUE: Le temps de réponse global de rétroaction doit être de <10 μs pour corriger rapidement et maintenir une force constante sur les deux pièges pendant les mesures, y compris l’état non lié, l’interaction de la myosine et le mouvement. À cette fin, les détecteurs de position doivent avoir une largeur de bande de >= 100 kHz et les données doivent être acquises à >= fréquence d’échantillonnage de 200 kHz. Pour chaque point de données acquis (temps d’acquisition de 5 μs), les corrections proportionnelles des deux traps sont calculées par le FPGA et envoyées aux deux DDS pilotant les AOD. Le temps de réponse AOD doit être inférieur à 5 μs pour satisfaire au temps de réponse de rétroaction requis.
    6. Pour la détection nm de la position des billes piégées, placez deux détecteurs de photodiodes quadrants (QPD sur la figure 2) dans le plan focal arrière du condensateur. L’alignement précis des QPD dans un plan conjugué au plan focal arrière du condensateur, ainsi que des AOD dans un plan conjugué au plan focal arrière de l’objectif, garantira que les signaux QPD seront indépendants de la fréquence AOD.
    7. Montez l’AOD sur un traducteur linéaire avec lecteur micrométrique et déplacez-le jusqu’à ce que le bord cristallin se rapproche du faisceau laser. Ensuite, remplacez l’objectif par un iris, centré sur le boîtier fileté de l’objectif, et réglez son ouverture pour s’adapter à la taille de l’ouverture arrière de l’objectif.
    8. Déplacez le traducteur vers le faisceau laser jusqu’à ce que la partie du faisceau bloquée par le cristal piézoélectrique soit visible après l’iris, tournez le traducteur légèrement vers l’arrière pour que le faisceau remplisse à nouveau complètement l’ouverture de l’iris.
    9. Répétez les étapes 1.1.7 à 1.1.8 pour le deuxième AOD. Vérifiez le temps de réponse de la boucle de rétroaction en mesurant le décalage par rapport aux QPD tout en déplaçant rapidement une poutre sur un cordon collé à la surface de la lamellede couverture 13.
      NOTE: Les trois étapes ci-dessus (1.1.7-1-1-9) conduisent à l’alignement minutieux des cristaux AOD. Ces étapes sont importantes pour optimiser la réponse temporelle de la déviation du faisceau et de la rétroaction13.
  2. Au moyen d’une photodiode, mesurez les fluctuations d’intensité du laser de piégeage à l’entrée du microscope qui doivent être inférieures à 1%. Notez que la largeur de bande de la photodiode doit être supérieure à la fréquence d’imagerie.
  3. Vérifiez la stabilité de pointage des deux pièges.
    1. Préparer les billes de silice dans un tampon phosphate (PB) en diluant 20 μL de billes de silice (1,2 μm, 10 % de solides) dans 1 mL d’acétone, soniquer pendant 30 s, vortex brièvement et centrifuger pendant 2 min à 19 000 x g.
    2. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 mL d’acétone et répéter le lavage. Resuspendre dans 1 mL de 50 mM PB, laver 2 fois. Enfin, remettre en suspension dans 100 μL de 50 mM PB.
    3. Effectuez l’étalonnage des pinces optiques avec des billes de silice en collant une lame de couverture sur une lame de microscope avec un ruban adhésif double face (environ 60 μm d’épaisseur) pour construire une chambre d’écoulement. Remplissez la chambre avec un BSA (protéine d’albumine sérique bovine) de 1 mg/mL et attendez 3 min.
    4. Écouler une dilution 1:1000 de billes de silice dans PB dans la chambre. Utilisez une seringue remplie de graisse de silicone pour sceller soigneusement la chambre. Pièger un seul cordon dans chaque piège et appliquer la méthode du spectre de puissance14 pour les étalonner.
    5. Préparer les billes de silice dans de l’acétate de pentyle (à température ambiante) en dissolvant 20 μL de billes de silice (1,2 μm de diamètre, 10 % solide) dans 1-1,5 mL d’acétone, de vortex et de sonicate pendant 30 s.
    6. Centrifuger à 18 500 x g pendant 2 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL d’acétone, puis répéter le lavage. Resuspendre dans 1 mL d’acétate de pentyle et répéter le lavage (centrifugeuse et remise en suspension) dans l’acétate de pentyle 2 fois. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL de nitrocellulose à 1 % et 900 μL d’acétate de pentyle. Conserver à 4 °C pendant 2 mois.
    7. Prenez un couvercle en verre de 24 x 24 mm et nettoyez-le soigneusement avec du papier imbibé d’éthanol pur. Ensuite, tout en le tenant avec une pince à épiler propre, rincez-le une deuxième fois en le lavant directement avec de l’éthanol pur. Laissez-le sécher sous un léger flux d’azote. Si nécessaire, répétez cette opération pour éliminer tous les résidus visibles sur la surface du verre.
    8. Prenez le stock de billes de silice, tourbillonnez-le et sonicez-le brièvement pendant ~30 s.
    9. Après avoir nettoyé une deuxième lamelle de couverture (24 x 60 mm), utilisez-la pour étaler 2 μL de solution de billes de silice sur une surface de la lamelle de couverture et attendez qu’elle sèche.
    10. Nettoyez soigneusement une lame de microscope (26 x 76 mm) qui sera utilisée pour créer la chambre d’écoulement.
    11. Découpez deux lignes de ruban adhésif double (~3 mm de large, 60-100 μm d’épaisseur) et fixez-les sur un côté de la lame de microscope, comme illustré à la figure 3.
    12. À l’aide d’une pince à épiler propre, fermer la chambre (volume final d’environ 20 μL) en mettant la couche de recouvrement (1.3.9) en contact avec les lignes de ruban adhésif, la couche nitrocellulose + billes faisant face à l’intérieur de la chambre, comme le montre la figure 3a. Remplissez la chambre d’écoulement avec un tampon phosphate de 50 mM et scellez-la avec de la graisse de silicium.
    13. Imagez une seule bille de silice en microscopie à fond clair à un grossissement de >200x à l’aide d’un dispositif à couplage de charge (CCD) ou d’une caméra complémentaire à semi-conducteur à oxyde métallique (CMOS) de >1,4 mégapixels. Utilisez un logiciel de rétroaction pour déplacer l’étage piézoélectrique (avec une précision nanométrique ou supérieure) afin de compenser les dérives thermiques10.
    14. Chevauchez le centre du piège gauche avec le centre du cordon (les niveaux de signal x-y du QPD doivent correspondre à ceux de l’étalonnage). Mesurez ensuite le bruit de position et l’écart-type des signaux de position pour ce piège.
    15. Répétez l’étape précédente pour le piège droit15.
  4. Calibrage de la position du piège : MHz à nm
    1. Préparer une chambre d’écoulement avec des billes de silice fixées sur la surface de la lamelle de couverture (1.3.5-1.3.12) et des billes flottantes de polystyrène (utiliser des billes conjuguées à la α-actinine préparées comme dans la section suivante 2.1).
    2. Concentrez une bille de silice sur la surface de la lamelle de couverture légèrement décentrée (~5 μm) du centre du champ de vision (FOV) et obtenez une image du FOV. Déplacez la perle de 10 μm vers le centre de champ de vision à l’aide de l’étage piézoélectrique et obtenez une deuxième image. Calculez le centre de la perle dans les deux images à l’aide d’un algorithme centroïde ou similaire et calculez la distance en pixels entre les deux perles pour obtenir l’étalonnage nm/pixel de la caméra en fond clair.
    3. Piège une seule particule flottante dans un piège. Ensuite, déplacez le piège à l’aide de l’AOD par petites étapes (0,2 MHz) et obtenez une image de la particule et la fréquence correspondante de l’AOD pour chaque étape. Calculez la position de la particule dans le champ de vision en utilisant l’algorithme centroïde comme précédemment et convertissez-la en nm en utilisant l’étalonnage nm/pixel obtenu à l’étape précédente.
    4. Effectuez un ajustement linéaire des données de position en fréquence et calculez la constante d’étalonnage en nm/MHz.
    5. Répéter l’étalonnage pour le deuxième piège
  5. Calibrage de la puissance et de la rigidité du piège (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Préparer une chambre d’écoulement avec des billes de silice fixées sur la surface de la lamelle de couverture (1.3.5-1.3.12) et des billes flottantes de polystyrène (utiliser des billes conjuguées à la α-actinine préparées comme dans la section suivante 2.1) et piéger une seule particule dans un piège. Ensuite, déplacez les deux pièges à travers les AOD par petites étapes (0,2 MHz) et enregistrez un mouvement brownien de la particule dans les deux pièges avec QPD et la fréquence correspondante des AOD.
    2. Calculer une puissance moyenne sur les détecteurs à chaque position et obtenir la rigidité du piège et la constante d’étalonnage QPD bêta en ajustant une fonction lorentzienne à un spectre de puissance du mouvement brownien enregistré13.

2. Préparation des échantillons

  1. Préparer des billes fluorescentes conjuguées à la α-actinine
    1. Effectuer la conjugaison16 : Prendre des billes de polystyrène amino-fonctionnalisées (1 μm de diamètre, 2,5 % de solides), les laver deux fois dans de l’eau distillée de 500 μL et les remettre en suspension dans 500 μL de PBS (pH 7,0). Ajouter 1 mM de ligand HaloTag ester de succinimidylO2 et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver trois fois avec 500 μL de PBS et remettre en suspension avec 100-200 μM HaloTag α-actinine. Incuber pendant 1 h à 37 °C et laver trois fois dans 500 μL de PBS (utiliser des billes dans les 1,5 semaine ou surgeler dans de l’azote liquide et conserver à −80 °C).
    2. Marquage : Incuber 200 μL de solution de billes avec de la rhodamine-BSA à une concentration finale de 5 μg/mL pendant 10 min. Laver trois fois avec 50 mM PB et remettre en suspension dans 500 μL de PB 50 mM. Celui-ci peut être conservé dans des aliquotes à - 80 °C pendant des mois).
  2. Exprimer et purifier la myosine-5B biotinylée comme décrit précédemment 4,17.
  3. Polymériser et étiqueter F-actine13 :
    1. Polymérisation F-actine : Mélanger 69 μL d’eau ultrapure, 10 μL de tampon de polymérisation d’actine 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonate de guanidine pH7,5), 20 μL de G-actine 10 mg/mL et 1 μL de DL-Dithiothréitol (DTT) 1 M. Laissez-le sur la glace pendant plus de 1 h.
    2. Marquage F-actine avec rhodamine (Ex/Em: 546/575 nm): Prendre 25 μL de F-actine polymérisée et ajouter 19,5 μL d’eau ultrapure, 2,5 μL de tampon de polymérisation d’actine 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM de carbonate de guanidine pH 7,5), 1 μL de 1 M DTT et2 μL de 250 μM de rhodamine phalloïdine. Laissez-le sur la glace pendant la nuit. Pour les expériences de piégeage, la rhodamine F-actine peut être stockée sur de la glace et utilisée dans un délai d’une semaine.
  4. Exemple d’assemblage
    1. Prendre la chambre d’écoulement (1.3.5-1.3.12) et incuber 1 mg/mL de BSA biotinylé pendant 5 min. Après lavage avec un tampon AB (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7,2), incuber 1 mg/mL de streptavidine pendant 5 min et laver à nouveau avec un tampon AB. Incuber la myosine-5B biotinylée de la méromyosine lourde à une concentration de 3 nM dans le tampon M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mMNaN3) avec 2 μM de calmoduline (CaM) pendant 5 min. Laver avec trois volumes de 1 mg/mL de BSA biotinylé complété par 2 μM CaM en AB et incuber pendant 3 min.
    2. Pendant l’incubation, préparer le mélange réactionnel (RM): billes fonctionnalisées à la α-actinine à 0,005% (section 2.1), 1 nM de rhodamine F-actine (section 2.3) dans un tampon d’imagerie (IB: tampon AB avec 1,2 μM de glucose-oxydase, 0,2 μM de catalase, 17 mM de glucose, 20 mM de DTT, 2 μM CaM et ATP à la concentration nécessaire à l’expérience).
    3. Laver avec RM et sceller la chambre avec de la graisse de silicone. L’échantillon est maintenant prêt à être observé au microscope.

3. Mesure

  1. Assemblez l’haltère.
    1. Recherchez les billes flottantes de α-actinine en déplaçant l’échantillon à l’aide de traducteurs à longue portée, allumez un piège et piègez une perle.
    2. Une fois le premier piège occupé, déplacez le traducteur pour positionner le cordon piégé près de la surface de la glissière de couverture afin d’éviter le piégeage de plusieurs perles et piéger une autre perle dans le deuxième piège.
    3. Ajustez les deux pièges à des rigidités égales en ajustant la puissance des ondes acoustiques AODs. Les rigidités sont généralement fixées entre 0,03 et 0,14 pN/nm. Plus la rigidité est faible, plus le bruit de force est faible, en particulier à faible force.
    4. Retournez ensuite le miroir motorisé M (Figure 2) pour passer à la microscopie à fluorescence, et recherchez un filament d’actine flottant en solution en déplaçant l’échantillon à travers des traducteurs longue portée13. Préférez les filaments longs (>5 μm) car la myosine processive va la déplacer et la déplacer sur quelques microns avant de se détacher.
    5. Déplacez l’échantillon pour laisser l’une des billes piégées s’approcher d’une extrémité du filament jusqu’à ce qu’elles se fixent les unes aux autres. Ensuite, ajustez la distance des perles à la longueur approximative du filament et créez un écoulement dans la direction de la deuxième perle non liée en déplaçant la scène dans sa direction. Le filament sera étiré par l’écoulement et il finira par s’y lier13. Le complexe perle-actine-perle est appelé « haltère ».
  2. Établir un contact actine-myosine.
    1. Séparez doucement les deux pièges loin l’un de l’autre pour pré-tendre le filament jusqu’à environ 3 pN et sonder la rigidité de l’haltère en faisant osciller un piège dans une onde triangulaire en changeant la fréquence de l’un des deux AOD et en vérifiant la transmission conséquente du mouvement à la perle de fuite par son signal de position.
    2. Déplacez la scène pour placer l’haltère à proximité d’une bille de silice sur piédestal et permettre le contact entre le filament et la protéine attachée à la surface de la bille en ajustant la hauteur des centres de billes piégées légèrement en dessous du diamètre de la bille de silice. Placez ensuite le centre de la bille de silice entre les billes piégées.
  3. Pince de force et retour de stabilisation nm :
    1. Allumez la pince de force ultrarapide avec une force de 2-3 pN et une oscillation de 200 nm et balayez le cordon du piédestal par pas discrets d’environ 20-30 nm dans la direction perpendiculaire au filament d’actine. Attendez que les interactions se produisent à chaque position (quelques secondes), puis avancez si aucune interaction n’est observée. Au fur et à mesure que l’interaction protéine-filament est établie, recherchez la position où les interactions sont plus fréquentes.
    2. Assurez-vous que lorsque la myosine processive se déplace vers une extrémité du filament d’actine (généralement l’extrémité +), la bille piégée attachée à l’extrémité + se déplace vers la bille de silice. Déplacez l’étape vers l’extrémité du filament de sorte que la bille de silice se trouve aussi près que possible de la bille piégée attachée à l’extrémité du filament lorsque la myosine n’est pas liée et démarrez la rétroaction de stabilisation nanométrique. Ce faisant, la probabilité que la bille piégée attachée à l’extrémité + du filament s’écrase dans la bille de silice est minimisée.
  4. Enregistrer les données.

4. Analyse des données4

REMARQUE: La méthode d’analyse décrite permet la détection et la mesure des cycles processifs et des événements de pas rapides en fonction des changements de vitesse de l’haltère, causés par le pas de myosine. L’analyse des cycles de procédé est effectuée sur la base d’une méthode d’analyse de données pour les moteurs non transformés décrite dans les références 3,4,13.

  1. Définissez un seuil pour les changements de vitesse afin de permettre la détection d’événements pas à pas. Étant donné que, dans ce cas, des pas en avant et en arrière sont attendus, le franchissement du seuil est accepté dans les deux sens.
  2. Assignez chaque pas à l’exécution correspondante : si l’intervalle de temps entre deux pas consécutifs est inférieur à 3 ms et que l’amplitude des pas est < 90 nm, les pas sont affectés à la même exécution, sinon les pas sont affectés à des exécutions différentes4.
  3. Durée d’exécution correcte pour les forces d’assistance4.
    1. Corrigez les longueurs d’exécution sous les forces d’assistance en calculant la valeur réelle de longueur d’exécution RL à partir de la valeur de longueur moyenne mesurée <RLm> à partir de l’équation suivante, où D est la plage d’oscillation:
      Equation 1
      REMARQUE : Des détails sur la dérivation de cette équation se trouvent à la référence4.

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Representative Results

Les données représentatives consistent en des enregistrements de position au fil du temps, comme le montre la figure 4. Dans l’enregistrement de position, deux types de déplacement sont visibles. Tout d’abord, lorsque le moteur de myosine n’interagit pas avec le filament d’actine, les billes piégées se déplacent à vitesse constante contre la force de traînée visqueuse de la solution montrant un déplacement linéaire oscillant dans la plage d’oscillation définie par l’opérateur dans une onde triangulaire3 (non visible sur la figure 4 en raison de la longue échelle temporelle). Deuxièmement, une fois que le moteur de myosine interagit avec le filament, la force transportée par le filament en mouvement est très rapidement transférée à la protéine, la vitesse du système tombe à zéro (lignes rouges sur la figure 4) et les événements de pas se produisent sous force constante jusqu’à la fin de la course. Comme le montre la figure 5, la force est commutée de la direction positive à la direction négative (et vice versa) par le système de rétroaction, qui commute la direction de la force lorsque la bille atteint le bord de la plage d’oscillation définie par l’utilisateur. Dans certains cas, il peut arriver que, lorsque la myosine se lie et déplace le filament vers la direction positive, elle pousse le cordon vers le bord (supérieur) de la plage d’oscillation. Si cela se produit sous force d’assistance (c’est-à-dire dirigée vers un déplacement positif, poussée, dans la figure 5), la course de la myosine sera interrompue par l’inversion de la direction de la force au bord de l’oscillation (flèches de la figure 5), limitant ainsi la durée de la course à l’amplitude de l’oscillation de l’haltère D. Cela nécessite une correction de la longueur de course en cas de force d’assistance (4.3.1).

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l’UFFCS appliqué à un moteur processif myosine-5B. (a) Une seule molécule de myosine-5B est fixée à un piédestal de billes de verre par une liaison streptavidine-biotine. Un seul filament d’actine est piégé en le suspendant entre des billes enrobées de α-actinine (la géométrie dite « à trois billes »). Les flèches noires représentent la force serrée à droite (F1) et à gauche (F2), la flèche rouge représente la force nette (F) sur l’haltère. F est alterné d’avant en arrière pour maintenir l’haltère dans une plage d’oscillation limitée lorsque la myosine n’est pas liée à l’actine. (b) Exemple de trace montrant le déplacement et la force pendant les phases correspondantes d’oscillation des haltères, de fixation de la myosine-5B et de parcours processifs sous des charges d’assistance (poussée) et de résistance (traction). Ce chiffre a été modifié par rapport à4. Les données brutes acquises à une fréquence d’échantillonnage de 200 kHz sont tracées. La force est d’environ 0,27 pN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma optique de la configuration expérimentale. Le microscope optique se compose de: lampe halogène (H), condensateur (C), échantillon (S), traducteurs piézoélectriques (x-y et z), objectif (O), une caméra à faible grossissement (CCD 200X) et une caméra à fort grossissement (CCD 2000X) utilisée pour la rétroaction de stabilisation nm. Les pincettes optiques doubles sont insérées et extraites de l’axe optique du microscope à travers des miroirs dichroïques (D2 et D3) et comprennent: laser Nd: YAG (1064 nm), isolateur optique (OI), plaques d’onde λ / 2, cubes séparateurs de faisceau polarisant (PBS), déflecteurs acousto-optiques (AOD), filtres interférentiels 1064 nm (F1 et F2), photodiodes à détecteur de quadrant (QDP). Les signaux des QDP ont été élaborés avec un FPGA, envoyé à deux synthétiseurs numériques directs (DDS) personnalisés pilotant les AOD (retour de force). L’excitation par fluorescence a été fournie par un laser Nd:YAG dupliqué (532 nm) et l’image projetée sur une caméra multipliée par électrons (EMCCD). M est un miroir mobile, F3 un filtre d’émission. Ce chiffre a été modifié par rapport à 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Assemblage de la chambre d’écoulement. (a) Préparation de la chambre. Une lame de verre, enduite de billes de silice, est fixée sur une lame de microscope à travers deux bandes collantes pour former une cellule d’écoulement d’environ 20 μL de volume. b) Vue de dessus de la cellule d’écoulement. Les solutions sont pilotées d’un côté de la chambre avec une pipette et aspirées de l’autre côté à travers un papier filtre pour créer un écoulement le long de la direction de la flèche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Enregistrement de la position représentative. Enregistrement de position montrant les exécutions processives de myosine-5B et l’algorithme de détection des étapes et des courses. Le début et la fin de chaque exécution détectés sont indiqués respectivement par des lignes verticales vertes et cyan. Des lignes horizontales rouges indiquent les étapes détectées. Ce chiffre a été modifié par rapport à4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Inversion de force pendant les périodes de myosine. Lorsque la myosine se lie et déplace le filament dans la direction positive sous la force d’assistance (poussée), il peut arriver qu’il atteigne le bord de la plage d’oscillation où la force est inversée (indiquée par les flèches), de sorte que la myosine coulée sous la force d’assistance est interrompue. Au contraire, sous force résistive (traction), le pas processif de myosine empêche l’haltère d’atteindre le point d’inversion de force. Par conséquent, dans ce dernier cas, les longueurs d’exécution ne sont pas limitées par la plage d’oscillation des forces résistives. Ce chiffre a été modifié par rapport à4. Les données brutes acquises à une fréquence d’échantillonnage de 200 kHz sont tracées. La force est d’environ 0,27 pN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Bien que les techniques à molécule unique, telles que le test à trois billes, soient techniquement difficiles et à faible débit, UFFCS améliore la détection des interactions moléculaires grâce au rapport signal sur bruit élevé des données. UFFCS permet l’étude de la dépendance à la charge des protéines motrices, avec les principaux avantages d’appliquer la force très rapidement lors de la liaison du moteur au filament pour sonder les événements précoces et très rapides dans la production de force et les états de liaison faibles sous force contrôlée; maintenir la force constante tout au long de la course et sonder la dépendance du moteur avec un contrôle total sur la directionnalité de la force. En ce qui concerne le dernier point, la géométrie à trois cordes que nous utilisons ici est très efficace pour appliquer et mesurer les forces le long de la direction du filament, minimisant ainsi les contributions des composants transversaux ou verticaux. Cependant, lorsque l’on s’attend à ce que la protéine motrice produise activement des forces transversales ou verticales, voire des couples, d’autres configurations telles que la géométrie à une seule bille sont plus appropriées 2,7,18. De plus, grâce à sa résolution spatiale et temporelle, UFFCS représente un outil unique pour la compréhension des bases des interactions moléculaires qui seraient autrement entravées par les techniques conventionnelles à molécule unique. En fait, UFFCS a permis d’étudier comment les forces d’assistance et de résistance régulent la réponse mécanique de la myosine-5B, donnant ainsi un nouvel aperçu de son comportement collectif au sein du maillage d’actine de la cellule4.

Cependant, le succès de ces expériences repose sur le respect de certaines exigences importantes qui doivent être abordées très soigneusement en suivant toutes les instructions trouvées dans ce protocole: l’alignement et l’isolation précis de la configuration optique sont fondamentaux pour atteindre une résolution spatiale optimale; Un étalonnage minutieux du système optique est nécessaire pour déterminer les valeurs des forces appliquées avec une grande précision; la mise en place d’un système de rétroaction rapide est nécessaire pour atteindre la haute résolution temporelle; Enfin, tous les composants assemblés dans la chambre d’échantillonnage doivent être préparés dans un environnement contrôlé, en les gardant aussi stériles que possible, car toute impureté dans la chambre d’échantillonnage pourrait compromettre l’expérience, et toutes les indications sur leur stockage et leur manipulation optimaux doivent être strictement respectées pour le succès du protocole expérimental. Il est important de noter que l’analyse des données doit être soigneusement adaptée aux différents types d’interactions moteur-filament afin d’interpréter correctement les résultats et d’éviter les artefacts.

Dans ce protocole sont incluses toutes les étapes pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, de la configuration d’appareils expérimentaux à la préparation des échantillons, à la mesure et à l’analyse des données, qui pourraient être facilement adaptées pour étudier une variété de myosines non conventionnelles et d’autres classes de moteurs processifs tels que les kinésines et les dynéines.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 871124 Laserlab-Europe, par le ministère italien de l’Université et de la Recherche (FIRB « Futuro in Ricerca » 2013 Grant No. RBFR13V4M2), et par Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk a été soutenu par la bourse interdisciplinaire LT008/2020-C du Human Frontier Science Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

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References

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Biologie numéro 173 spectroscopie ultrarapide à pince de force pince optique essai à trois billes moteurs moléculaires myosine

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Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force
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Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

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