Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Resumo

A anotação digital com dissecção automatizada de tecidos fornece uma abordagem inovadora para enriquecer tumores em casos de baixo teor de tumor e é adaptável tanto parafina quanto para tipos de tecido congelado. O fluxo de trabalho descrito melhora a precisão, a reprodutibilidade e o throughput e pode ser aplicado tanto em pesquisas quanto em configurações clínicas.

Resumo

O enriquecimento tumoral em tecidos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20% do conteúdo tumoral dependendo do método, é necessário para gerar dados de qualidade reprodutivelmente com muitos ensaios a jusante, como o sequenciamento de próxima geração. A dissecção automatizada de tecidos é uma nova metodologia que automatiza e melhora o enriquecimento tumoral nesses tecidos comuns e de baixo teor de conteúdo tumoral, diminuindo a imprecisão dependente do usuário das limitações tradicionais de macrodiscção e tempo, custo e experiência da microdisseção de captura a laser usando sobreposição de anotação de imagem digital em slides não manchados. Aqui, as anotações de hematoxilina digital e eosina (H&E) são usadas para atingir pequenas áreas tumorais usando uma lâmina de 250 μm^{de diâmetro} em parafina fixa de formalina não manchada incorporada (FFPE) ou seções congeladas frescas de até 20 μm de espessura para enriquecimento automatizado de tumores antes da extração de ácido nucleico e sequenciamento de exomatos inteiro (WES). A dissecção automatizada pode colher regiões anotadas em tecidos de baixo teor de tumores de seções únicas ou múltiplas para extração de ácido nucleico. Ele também permite a captura de extensas métricas de coleta pré e pós-colheita, melhorando a precisão, a reprodutibilidade e aumentando o throughput com a utilização de menos slides. O protocolo descrito permite a anotação digital com dissecção automatizada em FFPE animal e/ou humano ou tecidos congelados frescos com baixo teor de tumor e também pode ser usado para qualquer região de enriquecimento de interesse para aumentar a adequação para aplicações de sequenciamento a jusante em fluxos de trabalho clínicos ou de pesquisa.

Introdução

O sequenciamento da próxima geração (NGS) é cada vez mais utilizado tanto para o cuidado do paciente quanto para a pesquisa sobre câncer para ajudar a orientar os tratamentos e facilitar a descoberta científica. O tecido é muitas vezes limitado e pequenos espécimes com conteúdo tumoral variável são usados rotineiramente. A adequação e integridade tumorais, portanto, continuam a ser uma barreira para a obtenção de dados significativos. Amostras com menores percentuais tumorais podem causar dificuldade em distinguir variantes verdadeiras de artefatos sequenciamento e são muitas vezes inelegíveis para NGS¹. O enriquecimento tumoral de casos de bai....

Protocolo

Antes da iniciação, obtenha amostras de tecido adequadas de acordo com os protocolos do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Genentech, Inc.

1. Preparação de tecidos e slides

1. Selecione FFPE ou blocos de tecido congelados frescos e utilize o método de processamento correspondente abaixo.
2. Corte as seções do bloco de tecido em lâminas de vidro carregadas positivamente na espessura desejada. Seção serial em série o tecido FFPE em fitas com a primeira seção de referência cortada em uma espessura apropriada par....

Resultados

Foram selecionadas seções de fígado de camundongos FFPE e FF contendo câncer colorretal metastático em xenoenxertos. As seções foram manchadas de H&E (Figura 1A,E,I) e digitalizadas em um imager de slides inteiro a ampliação de 20x. Um patologista anotou digitalmente regiões tumorais de interesse e uma máscara foi gerada usando software comercial e formatada como uma imagem de referência png digital (Figura 1B,F,J). Slides d.......

Discussão

Apresentado aqui é um protocolo para a aplicação de anotação digital e dissecção automatizada para dissecar regiões tumorais a partir de baixo teor de tumor FFPE ou tecidos congelados frescos para enriquecimento tumoral e uso em WES. A combinação de anotação digital e criação de máscaras com dissecção automatizada reduz significativamente o tempo prático e a experiência necessárias comuns aos métodos clássicos de enriquecimento tumoral, incluindo a macrodisseção manual e lCM. O protocolo demonstra uma opção potencialment.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Millisect Fill Station	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Head	Roche	8106550001
AVENIO Millisect Milling Tips Small	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Microcentrífuga
Tampão de incubação	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Corante automatizado
Óleo mineral de grau molecular	Sigma	M5904-500ML
Proteinase K	Promega	V302B	Tampão de digestão
Qiagen AllPrep DNA / RNA Mini Kit	Qiagen	80284
RLT Plus buffer	Qiagen	80204
Superfrost Plus lâminas de microscópio carregadas positivamente	Thermo Scientific	6776214