Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.
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Artigo de método
15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms
Neste artigo
Resumo
Resumo
A dinâmica conformacional proteica desempenha papéis fundamentais na regulação da catálise enzimática, ligação de ligantes, aosteria e sinalização, que são importantes processos biológicos. Entender como o equilíbrio entre estrutura e dinâmica rege a função biológica é uma nova fronteira na biologia estrutural moderna e tem inflamado diversos desenvolvimentos técnicos e metodológicos. Entre estes, os métodos NMR da solução de relaxamento cpmg fornecem informações únicas de resolução atômica sobre a estrutura, cinética e termodinâmica do equilíbrio conformacional proteico que ocorre na escala de tempo μs-ms. Aqui, o estudo apresenta protocolos detalhados para aquisição e análise de um experimento de dispersão de relaxamento de 15N. Como exemplo, o pipeline para a análise da dinâmica μs-ms no domínio terminal C da bactéria Enzima I é mostrado.
Introdução
Os experimentos de dispersão de relaxamento (RD) Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) são usados em uma base de rotina para caracterizar o equilíbrio conformacional que ocorre na escala de tempo μs-ms por solução espectroscopia NMR1,2,3,4,5. Em comparação com outros métodos de investigação da dinâmica conformacional, as técnicas de CPMG são relativamente fáceis de implementar em espectrômetros de RN modernos, não exigem etapas especializadas de preparação de amostras (ou s....
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Protocolo
1. Preparação da amostra de RMN
- Expresse e purifique uma amostra de 2H,15N-labled da proteína de interesse.
NOTA: Enquanto uma amostra de proteína de 15N pode ser usada para aquisição do experimento CPMG RD, a perdateração (quando possível) aumenta drasticamente a qualidade dos dados obtidos. Protocolos para a produção de proteínas perdidos estão disponíveis na literatura13. - Tampão troque a amostra de proteína purificada em um tampão de RMR desgaseado.
- Transfira a amostra de RMN para o tubo NMR.
NOTA: A concentração da amostra de RMN precisa ser cuidadosamente otimizada para m....
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Resultados
O protocolo descrito aqui resulta na aquisição de perfis RD para cada pico no espectro 1H-15N TROSY(Figura 3A). A partir dos perfis de RD adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de 15N de cada grupo backbone amide(Figura 3A,3B). Ao traçar oR ex na estrutura 3D da proteína sob investigação, é possível identificar as regiões estruturais submetidas à troca conf.......
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Discussão
Este manuscrito descreve o protocolo implementado em laboratório para aquisição e análise de dados de 15N RD sobre proteínas. Em particular, são abordadas as etapas cruciais para a preparação da amostra de RMN, medição dos dados de RMN e análise dos perfis rd. Abaixo alguns aspectos importantes sobre a aquisição e análise de experimentos de RD são discutidos. No entanto, para uma descrição mais aprofundada do experimento e análise de dados, o estudo cuidadoso da literatura original é altamente recomendado
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Divulgações
Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito. Não declaramos conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos da NIGMS R35GM133488 e do Roy J. Carver Charitable Trust para V.V.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Melhorar a sensibilidade |
| Óxido de deutério | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8% puro, utilizado na preparação de amostras de RMN e culturas deuteradas |
| Centrífuga acionada à mão | CENTFG1 | de fornecimento da United Scientific | Usado para remover quaisquer bolhas de ar ou líquido residual preso nas paredes do tubo de RMN. |
| Espectrômetro de RMN de alto campo | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Aquisição dos dados de RMN |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modelagem dos dados de RMN |
| Pipeta de pasteur de RMN Corning | Incorporation | 7095D-NMR | Pipeta de pasto de vidro Pyrex para transferir amostra líquida em tubo |
| RMN Tubo de RMN | Willmad Precision | 535-PP-7 | Tubo de vidro cilíndrico de parede fina de 5 mm 7 '' |
| NMRPipe | Instituto de Pesquisa em Biociências e Biotecnologia | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | processamento de dados de RMN |
| SPARKY | Universidade da Califórnia, São Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Análise dos dados de RMN |
| Tospin 3.2 (ou mais recente) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Software de Aquisição |
Referências
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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Reimpressões e permissões
