Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rask antimikrobiell følsomhetstesting ved stimulert Raman-spredningsavbildning av Deuterium-inkorporering i en enkelt bakterie

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Denne protokollen presenterer rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) analyse innen 2,5 timer ved enkeltcellestimulert Raman-spredningsavbildning av D2O-metabolisme. Denne metoden gjelder bakterier i urin- eller fullblodsmiljøet, som er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.

Abstract

For å bremse og forhindre spredning av antimikrobielle resistente infeksjoner, er rask antimikrobiell følsomhetstesting (AST) i akutt behov for å kvantitativt bestemme antimikrobielle effekter på patogener. Det tar vanligvis dager å fullføre AST ved konvensjonelle metoder basert på langtidskulturen, og de fungerer ikke direkte for kliniske prøver. Her rapporterer vi en rask AST-metode aktivert ved stimulert Raman-spredning (SRS) avbildning av deuteriumoksid (D2O) metabolsk inkorporering. Metabolsk inkorporering av D2O i biomasse og metabolsk aktivitetshemming ved eksponering for antibiotika på enkeltbakterienivå overvåkes av SRS-avbildning. Enkeltcellemetabolismens inaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) av bakterier ved eksponering for antibiotika kan oppnås etter totalt 2,5 timer med prøvepreparering og deteksjon. Videre er denne raske AST-metoden direkte anvendelig for bakterieprøver i komplekse biologiske miljøer, som urin eller fullblod. SRS metabolsk avbildning av deuteriuminkorporering er transformativ for rask encellet fenotypisk AST i klinikken.

Introduction

Antibiotikaresistens (AMR) er en økende global trussel mot effektiv behandling av smittsomme sykdommer1. Det er spådd at AMR vil forårsake ytterligere 10 millioner dødsfall per år og $ 100 billioner globalt BNP-tap innen 2050 hvis detikke iverksettes tiltak for å bekjempe antibiotikaresistente bakterier 1,2. Dette understreker det presserende behovet for raske og innovative diagnostiske metoder for antibiotikafølsomhetstesting (AST) av smittsomme bakterier for å bremse fremveksten av antibiotikaresistente bakterier og redusere den relaterte dødeligheten3. For å sikre best mulig klinisk resultat er det avgjørende å innføre effektiv behandling innen 24 timer. Imidlertid krever den nåværende gullstandardmetoden, som diskdiffusjon eller buljongfortynningsmetode, vanligvis minst 24 timer for preinkubasjonsprosedyren for kliniske prøver og ytterligere 16-24 timer for å oppnå resultatene av minimal hemmende konsentrasjon (MIC). Samlet sett er disse metodene for tidkrevende til å veilede en umiddelbar beslutning om infeksjonssykdomsbehandling i klinikken, noe som fører til fremvekst og spredning av antimikrobiell resistens4.

Genotypiske AST-metoder, som polymerasekjedereaksjon (PCR)-baserte teknikker5, er utviklet for rask deteksjon. Slike teknikker måler de spesifikke resistensgenetiske sekvensene for å gi raske AST-resultater. De er ikke avhengige av tidkrevende cellekultur; Imidlertid testes bare spesifikke kjente genetiske sekvenser med resistens. Derfor er applikasjonen begrenset til forskjellige bakteriearter eller forskjellige resistensmekanismer. De kan heller ikke gi MIC-resultater for behandlingsbeslutninger 6,7. Dessuten er nye fenotypiske metoder for rask AST under utvikling for å overvinne disse begrensningene8, inkludert mikrofluidiske enheter 9,10,11,12,13, optiske enheter14,15,16, fenotypisk AST som kvantifiserer nukleinsyrekopien nummer17,18 og Raman-spektroskopiske metoder 19, 20,21,22,23,24. Disse metodene reduserer tiden for å veilede AST-resultater, men de fleste av dem gjelder bare for bakterielle isolater, ikke direkte til kliniske prøver, og krever fortsatt langvarig preinkubasjon.

I dette arbeidet presenterer vi en metode for rask bestemmelse av følsomheten til bakterier i urin og fullblod via overvåking av den cellulære metabolske aktiviteten ved SRS-avbildning. Vann (H2O) deltar i de aller fleste essensielle biomolekylære synteseprosesser i levende celler. Som en isotopolog av vann, gjennom enzymkatalysert H / D-utvekslingsreaksjon mellom det redoksaktive hydrogenatomet i NADPH og D-atomet i D2O, kan deuterium inkorporeres i biomasse inne i en celle25,26. En deuterert fettsyresyntesereaksjon er mediert av deuterium merket NADPH. D2O-inkorporering i reaksjoner av aminosyrer (AA) resulterer i deuterert proteinproduksjon26 (figur 1). På denne måten kan de nylig syntetiserte C-D-bindingsholdige biomolekylene i enkeltmikrobielle celler brukes som en generell metabolsk aktivitetsmarkør som skal detekteres. For å lese ut de novo syntetiserte C-D-bindinger, er Raman-spektroskopi, et allsidig analytisk verktøy som gir spesifikk og kvantitativ kjemisk informasjon om biomolekyler, mye brukt til å bestemme antimikrobiell følsomhet og redusere testtiden betydelig til noen få timer27,28,29,30 . På grunn av den iboende lave effektiviteten til Raman-spredningsprosessen har den spontane Raman-spektroskopien imidlertid lav deteksjonsfølsomhet. Derfor er det utfordrende å oppnå bilderesultater i sanntid ved hjelp av spontan Raman-spektroskopi. Koherent Raman-spredning (CRS), inkludert sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimulert Raman-spredning (SRS), har nådd høy deteksjonsfølsomhet på grunn av det sammenhengende lysfeltet for å generere størrelsesordener større enn for spontan Raman-spektroskopi, og derved gjengir høyhastighets, spesifikk og kvantitativ kjemisk avbildning på enkeltcellenivå 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Her, basert på vårt siste arbeid40, presenterer vi en protokoll for rask bestemmelse av metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet ved femtosekund SRS C-D-avbildning av D2O-inkorporering av bakterier i normalt medium, urin og fullblodsmiljø på enkeltcellenivå. Femtosekund SRS-avbildning gjør det mulig å overvåke enkeltcellemetabolismeinaktiveringskonsentrasjon (SC-MIC) mot antibiotika på enkeltbakterienivå innen 2,5 timer. SC-MIC-resultatene valideres ved standard MIC-test via buljongmikrodilusjon. Vår metode er anvendelig for å bestemme antimikrobiell følsomhet for bakterier urinveisinfeksjon (UTI) og blodbaneinfeksjon (BSI) patogener med mye redusert analysetid sammenlignet med konvensjonell metode, noe som åpner muligheten for rask fenotypisk ASAT i klinikken på enkeltcellenivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av humane blodprøver er i samsvar med retningslinjene fra IRB ved Boston University og National Institutes of Health (NIH). Spesielt er prøvene fra en bank og er fullstendig deidentifisert. Disse prøvene anses ikke for å være mennesker av institutional review board (IRB) kontor ved Boston University.

1. Fremstilling av bakterier og antibiotika stamløsning

  1. Klargjør stamløsningen av antibiotika (gentamicinsulfat eller amoksicillin) i en konsentrasjon på 1 mg/ml oppløst i sterilt1x fosfatbufret saltvann (PBS) eller dimetylsulfoksid (DMSO) løsningsmiddel i 1,5 ml mikrorør. Oppløs gentamicinsulfat i steril PBS-løsning og amoksicillin i sterilt DMSO-løsningsmiddel. Deretter oppbevares antibiotikaoppløsningen ved 2-8 °C som foreslått.
  2. For å lage D 2O som inneholder kationjustert Mueller-Hinton Broth (MHB) media, tilsett 220 mg MHB-buljongbase til 10 ml D 2 O for å lage 100% D2O-inneholdende medium. Steriliser løsningen ved å filtrere med filtre på 200 nm porestørrelse.
    MERK: Bruk denne protokollen alltid for å lage og sterilisere mediumløsninger i ytterligere trinn.
  3. For å forberede bakterieprøver for SRS-avbildning, tilsett 2 ml normale MHB-medier, som ikke inneholder deuterium, til et sterilt rundbunnskulturrør, og forvarm det deretter ved 37 ° C.
  4. Bruk en steril sløyfe for å velge en bakteriekoloni (Escherichia coli BW 25113 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) fra den friske kulturen på en tryptisk soya agarplate. Deretter suspenderes det i det forvarmede kulturmediet og forsiktig vortex for å forberede bakteriesuspensjonen.
  5. Inkuber bakterier ved 37 °C i en shaker ved 200 omdreininger per minutt (o/min) til den når den logaritmiske fasen.

2. D2O inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika (figur 2a)

  1. Kontroller bakteriekonsentrasjonen ved å måle den optiske tettheten (OD) med et fotometer ved en bølgelengde på 600 nm.
  2. Fortynn bakterieoppløsningen ved å bruke det normale MHB-mediet, som ikke inneholder deuterium, for å oppnå en endelig cellekonsentrasjon på 8 x 105 CFU / ml. Vortex forsiktig for å blande bakteriecellene.
  3. Forbered 300 μL aliquots av bakterieoppløsningen i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquots av bakterieoppløsningen i ett 1,5 ml mikrorør.
  4. Tilsett 4,8 μL antibiotika (gentamicin eller amoksicillin) stamløsning (1 mg / ml) i mikrorøret som inneholder 600 μL av bakterieoppløsningen, for å lage den endelige antibiotikakonsentrasjonen til 8 μg / ml.
  5. Ta 300 μL oppløsning ut av 8 μg / ml antibiotikaholdig bakterieoppløsning, og tilsett til en annen 300 μL bakteriell løsning, for å lage to ganger fortynnet antibiotika- (4 μg / ml) inneholdende bakterieoppløsning.
  6. Gjenta den to ganger serielle fortynningen av testantibiotika, gentamicin eller amoksicillin, til mikrorøret med den laveste konsentrasjonen (0,25 μg / ml) er nådd, og kast 300 μL fra røret. For både gentamicin og amoksicillin varierer seriekonsentrasjonene fra 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
    1. La ett rør uten antibiotika for tom kontroll. Dette vil være den positive kontrollen for å inspisere bakteriell metabolsk aktivitet uten antibiotikabehandling, men med D2O-behandling.
    2. La ett rør uten antibiotika og ingen D2O for negativ kontroll.
  7. Inkuber bakteriell aliquot med det visse antibiotikumet (gentamicin eller amoksicillin) som inneholder MHB-medium i 1 time.
  8. Under inkubasjon, lag en seriell fortynning av antibiotika med 100% D 2 O-inneholdende medium med samme konsentrasjonsgradient av antibiotika fremstilt i trinn2.6. For både gentamicin og amoksicillin varierer seriekonsentrasjonene fra 0,25 μg / ml - 8 μg / ml.
  9. Etter 1 times antibiotikabehandling tilsettes henholdsvis 700 μL seriefortynnet antibiotika og 100 % D 2 O-inneholdende MHB-medium til 300 μL antibiotikaforbehandlede bakterier i samme antibiotikakonsentrasjon (fremstilt i trinn2.6).
    1. For eksempel tilsett 700 μL 100% D2O-holdig MHB-medium (inneholdende 8 μg / ml antibiotika) til 300 μL av 8 μg / ml antibiotika-forbehandlede bakterier. På samme måte, overfør til de tilsvarende rørene i neste konsentrasjon, og homogeniser ved pipettering opp og ned flere ganger.
    2. Tilsett 700 μL antibiotikafritt 100 % D 2 O-holdig MHB-medium til 300 μL antibiotikafrie bakterier (fremstilt i trinn 2.6.1) som en tom kontroll.
    3. Inkuber ved 37 °C i en inkubasjonsshaker ved 200 o/min i ytterligere 30 minutter.
      MERK: I dette trinnet er den endelige konsentrasjonen av D2O i mediet for testen 70%.
  10. Sentrifuger først 1 ml antibiotika og D2O-behandlet bakterieprøve ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C, og vask deretter to ganger med renset vann. Til slutt, fest prøver i 10% formalinløsning og lagre dem ved 4 ° C.

3. Tilberedning av bakterier i urinmiljøet (figur 2b)

  1. For å forberede E. coli BW 25113 i den logaritmiske fasen, følg trinnene ved 1,4 og 1,5.
  2. Kontroller bakteriekonsentrasjonen ved å måle OD med et fotometer ved en bølgelengde på 600 nm.
  3. For å etterligne de kliniske UTI-prøvene 14,18,41, spike E. coli-løsningen i 10 ml avidentifisert urin for å nå en endelig cellekonsentrasjon på 10 6 CFU / ml.
  4. Filtrer E. coli-pigget urin ved hjelp av et 5 μm filter, og del deretter bakterieoppløsningen i 300 μL aliquots i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquots av bakterieoppløsningen i ett 1,5 ml mikrorør.
  5. Utfør D 2O inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika og prøveinnsamling som beskrevet i de foregående trinnene fra 2,4 til 2,10.

4. Fremstilling av bakterier i blodmiljø (figur 2c)

  1. For å forberede Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 i den logaritmiske fasen, følg trinnene på 1,4 og 1,5.
  2. For å etterligne de kliniske blodbaneinfeksjonsprøvene42,43, spike P. aeruginosa i 1 ml avidentifisert humant blod for å nå en konsentrasjon på 107 CFU / ml.
  3. Tilsett 9 ml sterilt renset vann for å lyse blodet.
  4. Filtrer P. aeruginosa pigget blod ved hjelp av et 5 μm filter. Høst deretter bakterier til 1 ml volum ved sentrifugering ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C.  Tilsett 9 ml forvarmet normal MHB i bakterieoppløsningen og forsiktig virvel. Den endelige konsentrasjonen av bakterier er 106 CFU / ml
  5. Del P. aeruginosa pigget blodløsning i 300 μL aliquots i syv 1,5 ml mikrorør og 600 μL aliquots av bakterieoppløsningen i ett 1,5 ml mikrorør.
  6. Utfør D 2O inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika og prøveinnsamling som beskrevet i de foregående trinnene fra 2,4 til 2,10.

5. SRS-avbildning av D2O metabolsk inkorporering i en enkelt bakterie

  1. Vask 1 ml fast bakterieoppløsning med renset vann og sentrifuger deretter ved 6200 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten. Berik bakterieoppløsningen til ca. 20 μL.
  2. Sett bakterieløsningen på et poly-L-lysinbelagt dekselglass. Sandwich og forsegle prøven for SRS-bildebehandling.
  3. Bildebakterier ved C-D vibrasjonsfrekvens ved 2168 cm-1 ved hjelp av et SRS-mikroskop.
    1. Skriv inn og still inn pumpens bølgelengde til 852 nm ved hjelp av kontrollprogramvaren på en datamaskin.
    2. Mål lasereffekten ved hjelp av en effektmåler. Sett effekten av pumpelaseren ved prøven til ~ 8 mW og effekten av Stokes laser ved prøven til ~ 40 mW ved å justere halvbølgeplaten foran laserutgangen.
      MERK: I SRS-mikroskopet gir en justerbar femtosekundlaser med en 80 MHz repetisjonshastighet pumpen (680 til 1300 nm) og Stokes (1045 nm) eksitasjonslasere.
  4. Ved å justere skruene på refleksjonsspeilene, juster pumpen og Stokes-strålene romlig og rett de to strålene inn i et oppreist mikroskop utstyrt med 2D galvo-speilsystem for laserskanning.
    1. Bruk et 60x vanndypingsmål for å fokusere pumpen og Stokes-lasere på prøven.
    2. Bruk en oljekondensator til å samle signalene fra prøven i fremoverretningen.
    3. Bruk et båndpassfilter for å filtrere ut Stokes-laseren før du leder den inn i en fotodiode.
    4. Trekk ut det stimulerte Raman-signalet med en låseforsterker og oppdag signalene fra fotodioden.
  5. Sett hvert SRS-bilde til å inneholde 200 x 200 piksler og pikseloppholdstiden for 30 μs i programvarens kontrollpanel. Den totale innsamlingstiden for ett bilde er ~ 1,2 s. Sett trinnstørrelsen til 150 nm, slik at bildestørrelsen er omtrent 30 x 30 μm2. Bilde minst tre synsfelt for hvert eksempel.

6. Bildebehandling og dataanalyse ( figur 3)

  1. For å oppnå gjennomsnittlig C-D-signalintensitet, åpne og behandle SRS-bilder med ImageJ-programvare.
  2. Først konverterer du SRS-bilder til 8-biters bilder med invertert farge ved å klikke Bilde | Type | 8-biters og deretter Rediger | Inverter knapper i ImageJ-programvaren.
  3. Filtrer deretter bildene med Gaussisk uskarphet ved å klikke Prosess | Filtre | Gaussiske uskarphetsknapper og sett Sigma (Radius) til 1.
  4. Bruk justering av bildeterskel til å velge bakterieområdet. Klikk på Bilde | Juster | Terskel for å sikre at de valgte bakteriestørrelsene samsvarer med de opprinnelige SRS-bildene. Eliminer små partikler ved å justere størrelsesgrensen for å bestemme partiklene. Klikk på Bruk.
  5. Bruk Analyser | Partikler Analyseknapper for å merke og bestemme bakterieområdet.
  6. Ved å klikke på Vis alle-knappen i ROI-forvalteren til det opprinnelige ubehandlede SRS-bildet, merk det samme bakterieområdet, bestem gjennomsnittsintensiteten til hvert datapunkt ved å klikke Mål-knappen i ROI-behandleren.
  7. Sett ring rundt bakgrunnsområdet i det opprinnelige SRS-bildet, og mål den gjennomsnittlige intensiteten til bakgrunnen. Den gjennomsnittlige C-D-intensiteten til hver bakterie oppnås ved å trekke bakgrunnssignalintensiteten.

7. Kvantifisering av antimikrobiell følsomhet via SC-MIC

MERK: Grenseverdien ved 0,60 for å bestemme SC-MIC er etablert i henhold til den statistiske analysen av SRS C-D-intensitetene av metabolismeaktive og metabolismehemmede forhold for bakterier ved forskjellige konsentrasjoner av legemiddeleksponering40. C-D-intensiteten for de antibiotikafølsomme og antibiotikaresistente gruppene ble tilpasset normalfordeling.

  1. Plott kurven for mottakerens driftskarakteristikk (ROC) og evaluer avskjæringsterskelen på 0,60. Basert på denne grenseverdien kan SC-MIC som en indikator på effekten av antibiotika defineres for å bestemme den metabolsk inaktive og metabolsk aktive gruppen.
  2. For å kvantitativt analysere SRS-bildedataene, plott histogrammene av C-D-signalintensiteter for hver bakteriegruppe behandlet med den serielt fortynnede antibiotikakonsentrasjonen. De fargede datapunktene står for forskjellige individuelle bakterier.
  3. Normaliser C-D-intensitetene til antibiotikabehandlet gruppe til gjennomsnittlig intensitet av kontrollgruppen uten antibiotikabehandling. Bestem SC-MIC-resultatene av forskjellige bakterier og antibiotikakombinasjoner ved å kvantifisere SRS-signalintensitetene ved C-D-regionen versus ulike konsentrasjoner av antibiotika ved bruk av grenseverdien ved 0,60.
  4. Valider og sammenlign SC-MIC-avlesningen med MIC bestemt ved bruk av konvensjonell buljongmikrodilusjonsanalyse.
  5. Ifølge Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tolkes følsomhetskategorien basert på SRS metabolske bilderesultater for hver testet bakteriestamme som "mottakelig", "resistent" eller "mellomliggende".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekten av inkubasjonstid på deuteriuminkorporering måles ved spontan Raman-mikroskopi ved C-D (2070 til 2250 cm-1) og C-H (2 800 til 3 100 cm-1) område (figur 4a). Time-lapse enkeltcellede Raman-spektra av P. aeruginosa dyrket i 70% D 2 O-inneholdende medium viser økende CD / CH-intensitet over inkubasjonstid fra 0 til 180 min. (Figur 4b) Den økende C-D-overfloden i enkeltmikrobielle celler avslører at D2O er innlemmet ideutererte biomolekyler inne i cellen.

D2O-merking over 50% påvirker bakteriell metabolisme betydelig i løpet av en 23-timers inkubasjonsperiode27. Vi observerte bakterieveksthemming når D2O merkingskonsentrasjon er over 70 % i løpet av en inkubasjonsperiode på 25 timer (figur S1). Vi har utført MIC ved gullstandard buljongfortynning og oppnådd SC-MIC-resultater i to P. aeruginosa-stammer (P. aeruginosa ATCC 47085 og P. aeruginosa 1133) (tabell S1). Våre nåværende resultater viser at 70% D2O ikke påvirker ytelsen til metoden vår i P. aeruginosa. Kategoriavtalen for vår SC-MIC-metode med den konvensjonelle kulturbaserte metoden er 100% for alle testede P. aeruginosa og antibiotikakombinasjoner, som vist i tabell S1. Vi tilskriver denne gode avtalen til den minimale toksisiteten på 70% D2O på P. aeruginosa i løpet av 30 minutters inkubasjonsperiode i SC-MIC-bestemmelse.

Etter protokollen ble P. aeruginosa inkubert med seriefortynnet gentamicin i 1 time og deretter 70 % D2O i ytterligere 30 minutter. SRS metabolsk avbildning ved ~2168 cm-1 (figur 5a) ble utført. C-D-intensiteten ved antibiotikabehandling deles på gjennomsnittsverdien til kontrollgruppen, som er uten antibiotikabehandling. Den kvantitative statistiske analysen (figur 5b) viste at C-D-signaler av P. aeruginosa var signifikant lavere ved 2 μg/ml eller høyere gentamicinkonsentrasjon enn uten gentamicinbehandling (0 μg/ml). Ved bruk av grenseverdien på 0,60 ble P. aeruginosa metabolsk hemmet ved 2 μg/ml og høyere konsentrasjoner av gentamicin. Den stiplede linjen viser den definerte grenseverdien på 0,60 i figur 5b. På denne måten ble SC-MIC for P. aeruginosa mot gentamicin i normalt MHB-medium bestemt til å være 2 μg/ml. Denne SC-MIC-verdien er verifisert å være innenfor det dobbelte differanseområdet med MIC (4 μg / ml) bestemt av buljongmikrodilusjonsmetoden (figur 5c). Samlet sett muliggjør SC-MIC bestemt av vår teknologi kvantifisering av antimikrobiell følsomhet.

For å utforske potensialet for rask AST ved SRS-avbildning av deuterium metabolsk inkorporering for kliniske applikasjoner, spesielt for den mest utbredte UTI-infeksjonen, testet vi bakterie-spiked urinprøve ved bruk av E. coli, det vanligste patogenet for å forårsake UTI-infeksjon44. For å etterligne de kliniske UVI-prøvene ved en relavent bakteriekonsentrasjon, tilsettes E. coli til den avidentifiserte urinen til en endelig konsentrasjon på 106 CFU / ml. Etter prøverensing ble urinprøvene inkubert med amoksicillin og D2O. Den rene bakgrunnen i SRS-bildene viste at prøveprepareringsprotokollen var anvendelig for rask AST-måling (figur 5d). SC-MIC for E. coli-spiked urinprøve mot amoksicillin ble bestemt til å være 4 μg / ml (figur 5e), som har samme følsomhetsavlesning med MIC (8 μg / ml) ved konvensjonell buljongfortynningsmetode for ren E. coli i normalt MHB-medium (figur 5f). Disse resultatene viste samlet at rask AST ved SRS-avbildning av deuteriummetabolsk inkorporering har stort potensial for klinisk diagnose til UTI-smittsomme patogener.

Sammenlignet med UTI-infeksjon er rask AST for BSI-patogener mye mer utfordrende for in situ-studier av bakteriell metabolsk aktivitet, da mange blodceller presenterer seg i blod. For å undersøke anvendeligheten av rask AST ved SRS-avbildning av D2O metabolsk inkorporering for kliniske BSI-prøver, ble det påvist P. aeruginosa spiked i avidentifisert humant blod. Som vist i figur 5g, ble C-D-intensiteten til SRS-bildet ved 2168 cm-1 dominert av bakterielle signaler. Siden de røde blodcellene ikke har metabolsk aktivitet for å ta opp D2O for videre biosyntese, ble C-D-signalene stammer fra metabolsk deuteriuminkorporering av levende bakterier. Kryssfasemodulasjonen eller fototermisk signal av rusk eller røde blodlegemer bidro til de svake bakgrunnssignalene, uten å påvirke den kvantitative analysen av SC-MIC. SC-MIC-resultatet for P. aeruginosa i blod ble bestemt til å være 2 μg/ml (figur 5h), noe som stemte godt overens med det konvensjonelle standard MIC-resultatet for P. aeruginosa i normalt vekstmedium (figur 5i). Samlet sett viste disse resultatene at SRS metabolsk avbildning av deuterium metabolsk inkorporering kan være en rask AST-metode for å bestemme SC-MIC for bakterier i BIS-infeksjoner.

Figure 1
Figur 1: Skjema for D2O-inkorporering i deuterert lipid og protein25,26. Deuterium kan inkorporeres i biomasse inne i en celle gjennom enzymkatalysert H / D-utvekslingsreaksjon mellom det redoksaktive hydrogenatomet i NADPH og D-atomet i D2O. Deuterert fettsyresyntesereaksjon er mediert av deuterium merket NADPH. D2O-innlemmelsen i reaksjoner av aminosyrer resulterer i deuterert proteinproduksjon. Dette tallet er endret fra ref.40. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for rask AST ved SRS metabolsk avbildning av deuteriuminkorporering. (a) D2O inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika i MHB-medium, og følgende SRS-avbildningsprosedyrer. (b) Fremstilling av bakterier i urinmiljø. (c) Fremstilling av bakterier i blodmiljøet. Dette tallet er endret fra ref.40. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Automatisert bildebehandling og tolkning av data. (a) Rå SRS-bilde. (b) Bilde etter intensitetsgrensejustering for å bestemme arealet av bakterieceller. (c) Datapunkter valgt etter partikkelanalysetrinn. (d) De tilsvarende datapunktene velges i råbildet. (e) Resultater av de tilsvarende datapunktene i råbildet. f) Statistiske resultater av datapunktenes gjennomsnittlige intensitet etter subtraksjon av bakgrunn. Skala bar: 10 μm. Dette tallet er endret fra ref.40. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Effekt av inkubasjonstid på deuteriuminkorporering i bakterier. (a) Time-lapse måling ved C-D (2070 til 2250 cm-1) og C-H (2,800 til 3,100 cm-1) region ved spontan Raman mikroskopi (gjennomsnitt fra 20 spektra). (b) Histogramplott av CD / CH-intensitetsforholdsplott over D2O-inkubasjonstid for bakterier i (a). Hvert farget punkt står for en måling fra en enkelt bakterie. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. SC-MIC-bestemmelse ved bruk av SRS-avbildning av bakteriell metabolsk inkorporering av D2O mot antibiotika i normalt medium, urin og blodmiljø. (a) SRS-avbildning ved C-D-vibrasjon (2168 cm-1) og tilsvarende overføringsbilder av P. aeruginosa i nærvær av D2O med tilsetning av seriefortynnet gentamicin i normalt MHB-medium. (b) Kvantitativ analyse av SRS C-D intensitet av P. aeruginosa i (a). De fargede datapunktene i histogrammet står for de forskjellige individuelle bakteriene. Den stiplede linjen angir grenseverdien på 0,60. (c) Sammenligningen av SC-MIC-avlesningen med MIC ved buljongmikrofortynningsmetode, og følsomhetskategori for P. aeruginosa i henhold til CLSI. (d) SRS-avbildning ved C-D-vibrasjon (2168 cm-1) og tilsvarende overføringsbilder av E. coli i urin etter inkubering i D2O med seriefortynnet amoksicillin. (e) Kvantitativ analyse av SRS C-D intensitet i (d). (f) Sammenligning av SC-MIC-avlesning og følsomhetskategori for E. coli ved normal MHB og i urin. (g) SRS-avbildning ved C-D-vibrasjon (2168 cm-1) og tilsvarende overføringsbilder av P. aeruginosa i blod etter inkubasjon i D2O med seriefortynnet gentamicin. (h) Kvantitativ analyse av SRS C-D intensitet i (g). (i) Sammenligningen av SC-MIC-avlesnings- og følsomhetskategorien for P. aeruginosa i normal MHB og i blod. S: følsom. Antall celler N ≥ 10 per gruppe. Feilfelt representerer SEM. Skalalinje: 10 μm. Dette tallet er endret fra ref.40. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Problem Mulig årsak Løsning
Lite eller ingen bakteriecelletall i avbildningsfelt Bakteriell tetthet i løsningen er for lav Sentrifuge i lengre tid for å ytterligere berike bakterier
Fotodamage av bakteriecellene under SRS-avbildning Lasereffekten som brukes er for høy Still lasereffekten til en passende verdi
Ingen SRS-signaler kan oppdages Den romlige og tidsmessige overlappingen av pumpen og Stokes-strålen er ikke optimalisert Juster pumpen og Stokes-strålene ved hjelp av en standard prøve deuterert dimetylsulfoksid

Tabell 1: Feilsøkingstabell.

Figur S1: Testing av D 2 O-toksisitet på P. aeruginosa dyrket i Lauria-Bertani (LB) medium med forskjellige D2O-konsentrasjoner. Feilfelt angir standardavviksverdier (antall målinger = 5). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Tabell S1. Sammenligning av SC-MICs og MICs i normal MHB av P. aeruginosa ved antibiotikabehandling. S: følsom; R: motstandsdyktig; I: Mellomliggende. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapid AST kan oppnås ved å vurdere responsen av bakteriell metabolsk aktivitet til antibiotikabehandling ved bruk av enkeltcellet SRS metabolsk avbildning innen 2,5 timer fra prøven til SC-MIC resultater. Responsen av bakteriell metabolsk aktivitet og antimikrobiell følsomhet kan detekteres ved å overvåke metabolsk inkorporering av D2O for biomolekylsyntese ved bruk av SRS-avbildning av C-D-bindinger. Siden vann er allestedsnærværende brukt i levende celler, gir SRS metabolsk avbildning en universell metode for rask AST. Den raske AST-metoden er anvendelig for å oppdage bakterier i komplekse biologiske miljøer, for eksempel urin eller fullblod på et enkelt bakterienivå. SC-MIC kan bestemmes etter 1,5 timers kultur av bakterier i urin og blod, noe som anses transformativt for å skifte paradigmet for UVI og BSI-diagnose fra en tidkrevende kulturavhengig prosedyre til en kulturuavhengig in situ-tilnærming . Derfor betyr det en enorm reduksjon i diagnosetiden sammenlignet med den konvensjonelle buljongmikrodilusjonsmetoden, som baner vei mot klinisk oversettelse som muliggjør identifisering av passende antimikrobielle midler i tide for presis behandling.

Protokollene for antibiotikabehandling beskrevet her følger retningslinjene fra CLSI, der det foreslåtte MHB-mediet generelt kan brukes til dyrking av et bredt spekter av mikroorganismer. En nøkkelparameter er at bakteriecellenummeret som brukes til antimikrobiell følsomhetstesting holdes på ca. 5 x 105 CFU/ml som anbefalt i CLSI. Dette er av avgjørende betydning for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. I antibiotikabehandlingsforsøk settes bakteriekonsentrasjonen til 8 x 105 CFU/ml. Høyere bakteriekonsentrasjon kan føre til en økning i MIC-resultatene. Når bakteriesuspensjonen er justert, må den brukes innen 30 minutter for å unngå endringer i bakteriecellekonsentrasjonen.

For følsomhetstesting av et antibiotikum som daptomycin, anbefales det å supplere 50 mg / L kalsium i media. Kationjustert MHB-medium inneholder 20-25 mg/L Ca2+. Sørg derfor for at mediet suppleres ytterligere med Ca2+ (oppløselig i vann og filter sterilisert) i konsentrasjonen på 30 mg/L.

Et annet kritisk skritt i den presenterte metoden er inkubasjonstiden for bakterier ved antibiotikaeksponering og D2O-innlemmelse. Fordi generasjonstiden for bakteriens livssyklus er omtrent 30 til 60 minutter, er det viktig å påvirke bakteriell metabolsk aktivitet ved antibiotikaeksponering i en viss tid. Denne testen har blitt evaluert for en rekke bakterie-antibiotikakombinasjoner til antibiotikaeksponering i 1 time før 0,5 timer D2O-behandling. Det første 1 time antibiotikabehandlingstrinnet er viktig for å påvirke bakteriell metabolsk aktivitet. Deretter inkuberes bakterier med D2O-holdig og antibiotikaholdig medium i ytterligere 30 minutter. De endelige antibiotikakonsentrasjonene opprettholdes på samme nivå, og den endelige konsentrasjonen av D2O justeres til 70%. Samlet sett, etter 1 time antibiotikaprekultur og etter 0,5 timer D2O og antibiotikainkorporering, bestemmes SC-MIC-resultatene deretter av SRS metabolsk avbildning av bakteriell metabolsk aktivitet. Denne utformingen minimerer virkningen av D2O-påvirkning av antimikrobiell aktivitet til bakterier og fører også til en sammenlignbar avlesning av SC-MIC-resultater med MICs ved konvensjonell metode.

I SC-MIC-målingene forbereder vi parallelt 40 prøver, inkludert 5 forskjellige antibiotika, hver med 8 konsentrasjoner samtidig. Men fordi det er mange manuelle operasjonsprosedyrer, er den totale analysetiden for å oppdage AST for fem forskjellige bakterie-antibiotikakombinasjoner lengre enn 2,5 timer. I vår metode ble hvert SRS-bilde som inneholdt ~ 20 individuelle bakterieceller oppnådd innen ~ 1,0 s i ett enkelt skudd ved 30 μs piksel oppholdstid. Vi anslår at den totale AST-analysetiden for å studere 10 antibiotika for en bakteriestamme vil være mindre enn 2,5 timer fra prøve til SC-MIC-avlesning, som har enorm mulighet til å utføre høy gjennomstrømningsmåling. I fremtidig arbeid vil en automatisert prøvepreparering og avbildningsdatainnsamlingsmetode bli brukt for å forbedre gjennomstrømningen ytterligere. Feilsøkingsdetaljene er gitt i tabell 1.

I konvensjonelle kulturbaserte AST-metoder, for å oppnå bakterielle isolater for ytterligere målinger, er det nødvendig å pre-inkubere kliniske prøver i flere timer. Avanserte AST-metoder for klinisk UTI-prøve, som Raman-spektroskopi29, nanoliter array6 og digital nukleinsyrekvantifisering18, er utviklet for å kvitte seg med langvarig preinkubasjon. Sammenlignet med UTI-infeksjon er BSI eller sepsis mye mer livstruende18,45, hvor rask AST er presserende nødvendig for presis diagnostikk i klinikken. En mikroskopisk avbildningsmetode for å måle dannelse av bakteriekolonier fra positive blodkulturer er rapportert å gi MIC-resultater46. Det tar imidlertid minst 6 timer å dyrke bakterier for å utføre AST-analysen. Videre kan kommersielle automatiske systemer47 og massespektrometri48,49 strategier gi AST-avlesning fra positive blodkulturer. MIC-resultatene for den kliniske beslutningen kan imidlertid ikke gis. AST-resultatene og MIC-avlesningen er signifikante for å unngå overflødig dosering av antibiotika til pasienter for å forårsake potensielle bivirkninger i klinikker, for å bremse og forhindre spredning av antimikrobielle resistente infeksjoner50,51. Sammenlignet med de eksisterende spontane Raman-mikroskopibaserte AST-metodene, reduserer teknologien vår datainnsamlingstiden enormt (ca. 600 ganger mindre) på grunn av signalforbedring. I dette arbeidet demonstrerer vi rask AST ved SRS-avbildning av deuteriummetabolisme i enkeltbakterier ved en klinisk relevant bakteriekonsentrasjon (105 ~ 106 CFU / ml) i enten urin eller fullblodsmiljø. Som vist i tidligere resultater, bestemmes MIC-resultatene etter 1 time antibiotikabehandling og 30 min blanding av D2O og antibiotikainkubasjon i bakterier i urin og blod. Vår metode kan gi MICs og følsomhetsklassifisering for hver stamme-antibiotikakombinasjon innen 2,5 timer, og åpner derfor en ny vei til klinisk oversettelse. For å oppsummere, uten behov for prekulturering og bakteriell deling, har vår metode et enormt potensial innen rask og høy gjennomstrømning AST i smittsomme sykdommer.

Vår SC-MIC-metode ved SRS metabolsk avbildning er anvendelig for å oppdage MICs og gi følsomhetsklassifisering for smittsomme patogener når det gjelder rikelig med varianter av stamme-antibiotikakombinasjoner for klinisk bruk. SC-MIC bestemmes etter 30 minutter med D2O-inkorporering i bakterier i urin og blod, noe som betyr en enorm reduksjon i diagnosetiden sammenlignet med den konvensjonelle buljongfortynningsmetoden som koster 16 til 24 timer for preinkubasjon. For å levere patogenidentifikasjonsinformasjon for klinisk beslutningstaking, kan SRS metabolsk bildebehandlingsteknologi integreres ytterligere med diagnostiske plattformer som er i stand til rask patogenidentifikasjon, for eksempel matriseassistert laserdesorpsjonionisering-tid-av-flymassespektrometri 49,52,53. Å kombinere in situ patogenidentifikasjon og rask AST-diagnose kan ha stort potensial for oversettelse til klinikk som muliggjør identifisering av passende antimikrobielle midler i tide for presis behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI141439 til J.-X.C og M.S, og R35GM136223 til J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Biologi utgave 180
Rask antimikrobiell følsomhetstesting ved stimulert Raman-spredningsavbildning av Deuterium-inkorporering i en enkelt bakterie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter