Detecção e Análise Automatizada de Exocistose

Resumo

Desenvolvemos um software automatizado de visão computacional para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensíveis ao pH. Aqui, demonstramos o uso de uma interface gráfica de usuário e RStudio para detectar eventos de fusão, analisar e exibir parâmetros espátulais de fusão e classificar eventos em modos de fusão distintos.

Resumo

A microscopia timelapse TIRF de GFP sensível ao pH (pHluorin) anexada às proteínas SNARE vesículas é um método eficaz para visualizar eventos exocióticos vesículas únicos na cultura celular. Para realizar uma identificação e análise imparcial e eficiente de tais eventos, uma abordagem baseada em visão computacional foi desenvolvida e implementada no MATLAB. O pipeline de análise consiste em um algoritmo de segmentação celular e identificação de eventos exocióticos. A abordagem da visão computacional inclui ferramentas para investigar múltiplos parâmetros de eventos únicos, incluindo a meia-vida da decadência da fluorescência e do pico ΔF/F, bem como a análise de células inteiras da frequência da exocitese. Estes e outros parâmetros de fusão são usados em uma abordagem de classificação para distinguir modos de fusão distintos. Aqui uma GUI recém-construída realiza o pipeline de análise do início ao fim. Uma adaptação adicional da função K de Ripley no R Studio é usada para distinguir entre eventos de fusão agrupados, dispersos ou aleatórios no espaço e no tempo.

Introdução

Construções VAMP-pHluorin ou receptor de transferrina (TfR)-pHuji construções são excelentes marcadores de eventos exocióticos, pois estes fluoroforos sensíveis ao pH são extintos dentro do lúmen vesícula ácido e fluoresce imediatamente após a abertura do poro de fusão entre a vesícula e a membrana plasmática¹. Após a abertura dos poros de fusão, a fluorescência decai exponencialmente, com alguma heterogeneidade que revela informações sobre o evento de fusão. Aqui, um aplicativo de interface de usuário gráfico (GUI) é descrito que detecta e analisa automaticamente eventos exocióticos. Este aplicativo permite que o usuário detecte automaticament....

Protocolo

1. Escolha conjuntos de dados e diretórios

1. Para selecionar conjuntos de dados para análise, clique no botão Encontrar Conjuntos de dados (Figura 2A, caixa vermelha 1) para navegar até a pasta onde os dados são depositados (por exemplo, pasta RawData). Os datafiles preencherão automaticamente os Arquivos de Dados como uma lista. Pode haver mais de um conjunto de dados na pasta.
2. Clique no botão Escolher Diretório e selecione o diretório (por exemplo, Teste) onde os arquivos analisados serão depositados(Figura 2A, caixa vermelha 2

Resultados

Aqui a GUI (Figura 2A) foi utilizada para analisar eventos exocióticos de três neurônios vamp2-pHluorin expressando neurônios a 3 DIV utilizando microscopia DE TIRF (fluorescência de reflexão interna total). Os neurônios corticais E15,5 foram isolados, seguidos de transfecção com VAMP2-pHluorin e chapeamento utilizando os protocolos descritos em Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 2011^11,12. A metodologia dos parâmetros de imag.......

Discussão

Ao usar o software de detecção e análise exocítico, considere que o programa só aceita compactação sem perdas .tif arquivos como entrada. Os arquivos de imagem .tif podem ser imagens de 8 bits, 16 bits ou 32 bits em escala de cinza (canal único). Outros formatos de imagem devem ser convertidos em um desses tipos antes da entrada. Para referência, exemplos usados aqui são imagens em escala de cinza de 16 bits.

Inerentes ao processo de detecção automatizada, os conjuntos de imagens timelapse são.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	Equipe
do MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/

principal RR https://www.r-project.org/