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Artigo de método

Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência

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DOI:

10.3791/62405

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16 de abril de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institutes of Brian Science, Fudan University, 4Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.

Resumo

A complexidade dos astrócitos humanos permanece mal definida no tecido humano primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização molecular. A triagem de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) pode ser usada para isolar e estudar com sucesso as populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) a partir de tecido arquivado congelado, evitando problemas associados ao manuseio de tecido fresco. No entanto, faltam esforços para isolar a astroglia da elemento não neuronal (NeuN-) Uma estratégia de imunotagging recentemente desenvolvida e validada usa três anticorpos fator de transcrição para isolar simultaneamente populações neuronais enriquecidas (NeuN+), astrócito (proteína de caixa emparelhada 6 (PAX6)+NeuN-), e progenitor de progenitor de oligodendrocite (OLIG2+NeuN-) populações de neocórtex temporal não-doente, fresco (não fixado)

Esta técnica mostrou-se útil para a caracterização de alterações transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Análises transcriômicas confirmaram que as populações classificadas por PAX6+NeuN são robustamente enriquecidas para marcadores pan-astrócitos e capturam astrócitos em condições de repouso e reativas. Este artigo descreve a metodologia FANS para o isolamento de populações de núcleos enriquecidos por astrócitos a partir de córtex humano congelado fresco, incluindo dissociação de tecido em suspensão de núcleo único (sn); imunotagging de núcleos com anticorpos anti-NeuN e anti-PAX6 fluorescentemente conjugados; Estratégias de gating do FANS e métricas de controle de qualidade para otimizar sensibilidade e especificidade durante a triagem e para confirmar o enriquecimento de astrócitos; e aquisição recomendada para sequenciamento de acessibilidade de transcriptome a jusante e cromatina em resolução a granel ou sn. Este protocolo é aplicável para amostras corticais não necróticas, congeladas e humanas com várias patologias e coleta recomendada de tecido pós-morte dentro de 24 h.

Introdução

A complexidade molecular dos astrócitos humanos permanece pouco definida no tecido primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização em alta resolução, tanto na saúde quanto na doença. A separação de neurônios humanos intactos e glia de seu nicho tem se mostrado difícil devido ao acesso limitado de amostras de tecido cerebral fresco, à natureza fortemente interconectada dos processos gliais e neuronais, e à inevitável ativação celular durante o processamento, tudo isso limitando a caracterização molecular desses tipos celulares ex vivo1 . A classificação de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) surgiu como uma alternativa à classificação de células vivas, permitindo a dissociação e o imunotagging das populações de núcleos a partir de tecido congelado. Na última década, o FANS tornou-se amplamente utilizado para isolar e caracterizar molecularmente populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) em uma variedade de espécimes cerebrais e regiões anatômicas 1,2,3,4.

No entanto, métodos semelhantes para isolar subpopulações específicas de núcleos gliais do córtex humano têm sido limitados, levando a uma relativa falta de sofisticação na compreensão da complexidade dos astrócitos em tecidos normais e doentes. Para isso, um protocolo publicado anteriormente foi adaptado para isolar populações neuronais humanas usando o FANS4, e um método foi validado para enriquecer para os astrócitos (e para progenitores oligodendroglial) usando uma combinação de anticorpos triplos, capturando astrócitos em condições de repouso e reativa5. Para enriquecer especificamente os astrócitos na fração de NeuN, anticorpos foram usados contra um dos dois fatores de transcrição conhecidos por serem expressos diferencialmente entre populações de astrócitos, pax6 ou fator de transcrição caixa de SRY 9 (SOX9)6,7. Pax6 é altamente expresso durante o desenvolvimento fetal precoce dentro de progenitores radiais semelhantes a glia em zonas germinais e contribui para neurogênese e gliogênese 8,9,10,11, bem como para especificação neuronal12. No adulto, pax6 é diferencialmente superexpresso em astrócitos humanosem repouso 6 e mostra co-expressão proteica com proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) em astrócitos de tecido de epilepsia humana13.

Este protocolo descreve o isolamento simultâneo das populações de núcleos neocorticais e enriquecidos por astrócitos pelo FANS. O tecido pós-morte fresco (não fixado) (ou seja, congelado fresco) coletado do córtex adulto é primeiro dissociado mecanicamente e quimicamente. Após a lise e a ultracentrifugação em um gradiente de sacarose, os componentes citoplasmados e extracelulares são descartados enquanto os núcleos são retidos. Os núcleos são então rotulados com anticorpos nucleares fluorescentes conjugados correspondentes às linhagens alvo desejadas e classificados usando VENTILADORES. Após essa abordagem, o enriquecimento dos astrócitos é demonstrado nas populações PAX6+NeuN coletadas, validadas tanto por um painel qPCR direcionado quanto pelo sequenciamento nuclear de RNA a jusante.

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Protocolo

NOTA: O Programa de Proteção de Sujeitos Humanos da Faculdade de Medicina Icahn do Monte Sinai (ISMMS) e seu Conselho de Revisão Institucional (IRB) assegura a conduta ética da pesquisa e do cumprimento das regulamentações federais, estaduais e institucionais. Neste estudo, todos os espécimes pós-morte utilizados foram desidentifitados, obtidos sob o consentimento adequado através do biorepositório, e foram isentos da designação de "pesquisa humana" pelo IRB do ISMMS (HS#14-01007).

1. Preparação do buffer

NOTA: Se realizar o sequenciamento do RNA a jusante, trate minuciosamente todos os espaços de trabalho e ferramentas com a Solução de Descontaminação RNase para evitar a degradação do mRNA.

  1. Prepare o tampão de lise.
    1. Dissolver o seguinte em H2O destilado até 50 mL: 5,47 g de sacarose (final de 0,32 M), 250 μL de 1 M CaCl2 (final de 5 mM), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (final de 3 mM), 10 μL de 500 mM ácido triacético (EDTA) (final de 0,1 mM), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (final de 10 mM), 50 μL de Triton X-100 (0,1% final), e 17 μL de 3 M dithiothiothreitol (DTT, final de 1 mM, adicionar fresco) (ver a Tabela de Materiais).
  2. Prepare o tampão de sacarose
    1. Dissolver o seguinte em H2O destilado até 50 mL: 30,78 g de sacarose (final de 1,8 M), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)0 2 (final de 3 mM), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (final de 10 mM), 17 μL de 3 M DTT (final de 1 mM, adicionar fresco).

2. Dissociação de tecido congelado em suspensão de núcleo único

  1. Adicione 4 mL de tampão de lise gelada a um douncer de tecido de vidro de 7 mL (moedor) e mantenha no gelo. Dissecar aproximadamente 200-400 mg de córtex adulto humano congelado fresco, dounce aproximadamente 50x, e transfira o tecido homogeneizar para um tubo de polipropileno ultracentrifuuge de 12 mL.
  2. Usando uma pipeta de 5 mL, adicione 6,5 mL de tampão de sacarose gelada ao fundo do tubo ultracentrífuga, tomando cuidado para não perturbar a camada entre a sacarose e o tecido homogeneizar.
    NOTA: Se processar amostras adicionais, equilibre cuidadosamente os tubos em peso adicionando tampão de lise adicional à amostra mais leve. O equilíbrio preciso dos tubos ultracentrifuus é essencial para evitar danos ao rotor e garantir a rotação na velocidade adequada.

3. Ultracentrifugação

  1. Ultracentrizar o lysate a 24.400 rpm (101.814 × g) por 1h a 4 °C. Aspire cuidadosamente o supernatante e os detritos sem perturbar a pelota.
    NOTA: Uma pelota pode não ser visível se começar com menos de 200 mg de tecido.
  2. Adicione 600 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ livre) à pelota dos núcleos e incubar no gelo por 10 minutos antes de reutilizar.
  3. Pipeta para cima e para baixo 50 vezes para resuspensar a pelota dos núcleos no gelo.
  4. Use um hemótmetro para visualizar os núcleos intactos sob um microscópio e para garantir que a concentração da resuspensão esteja acima de 105 núcleos/mL antes de prosseguir para o próximo passo (combine 10 μL dos núcleos resuspended com 10 μL de azul trypan).

4. Incubação de anticorpos

  1. Para imunoterreta a amostra para FANS, adicione 500 μL da pelota amostra resuspended, 490 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ grátis), 10 μL de 10% BSA (0,1% final), 1 μL de anticorpo anti-NeuN conjugado a AF555 (NeuN-AF5555, NeuN-AF5555, 1:1000 concentração final), e 1 μL de anticorpo anti-PAX6 conjugado à alofilia (PAX6-APC, 1:1000 concentração final).
    NOTA: Anticorpos alternativos conjugados a outros fluoroforos podem ser adicionados (ver discussão). Aqui, o camundongo anti-OLIG2 conjugado ao AF488 (concentração de 1:1000) foi utilizado com resultados favoráveis.
  2. Realize 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) somente e controles de cor única para configurar parâmetros de gating, utilizando uma pequena quantidade da amostra conforme necessário.
    1. Para realizar o controle de cor única AF555, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ grátis), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo NeuN-AF555 (1:10000 de concentração).
    2. Para realizar o controle de cor única APC, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ livre), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo PAX6-APC (1:1000 de concentração).
    3. Para realizar o controle somente da DAPI, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ livre) e 10 μL de 10% BSA (0,1% final) (DAPI será adicionado mais tarde, ver 4,4).
      NOTA: Se forem utilizados mais de dois anticorpos, recomenda-se a realização do controle de fluorescência-menos-um (FMO), além dos controles de cor única.
  3. Incubar as amostras e os controles com rotação no escuro por 1h a 4 °C.
  4. Adicione DAPI em 1:1000 a todas as amostras e controles, e proceda com a classificação.

5. Classificação de núcleos ativados por fluorescência (VENTILADOR)

NOTA: Recomenda-se o uso de uma instalação de citometria de fluxo institucional com assistência de pessoal treinado, a menos que já seja proficiente em técnicas de citometria/classificação de fluxo.

  1. Portão como mostrado abaixo.
    1. Primeiro, e para cada amostra, portão por dispersão para a frente (FSC-A) vs. dispersão lateral (SSC-A) para incluir partículas na faixa de tamanho apropriada para núcleos, excluindo assim glóbulos vermelhos e detritos (Figura 1A).
      NOTA: Uma preparação de núcleos muito limpos pode distinguir entre um aglomerado de detritos menor e um aglomerado de núcleos.
    2. Em seguida, e para cada amostra, gate por FSC-A vs. FSC-W (ou FSC-A vs. FSC-H) e SSC-A vs. SSC-W (ou SSC-A vs. SSC-H) para incluir apenas núcleos singlet (Figura 1B).
    3. Em seguida, e para cada amostra, portão da DAPI para incluir núcleos intactos singlets (população fechada da DAPI), excluindo detritos (DAPI-baixo, à esquerda da população fechada) e dobras (à direita da população fechada) (Figura 1C).
    4. Defina mais gating com base em controles de fluorescência, determinados visualmente como clusters distintos em parcelas FACS.
      1. Execute o controle somente da DAPI para determinar a coloração de fundo das populações, na ausência de anticorpos (Figura 1D e Figura 2A).
      2. Execute o controle somente neun-AF555 para determinar o corte de manchas de NeuN+ no canal para AF555 (Figura 2B).
      3. Execute o controle somente PAX6-APC para determinar o corte para coloração PAX6+ no canal APC (Figura 2C).
      4. Execute controles adicionais de cor única se usar mais anticorpos (Figura 2D,E).
        NOTA: Se usar mais de dois anticorpos, recomenda-se um controle FMO para visualizar quaisquer mudanças nas populações.
    5. Uma vez executados todos os controles, desenhe os portões para coleções NeuN+ e PAX6+ acima dos limites estabelecidos.
      1. Portão da população NeuN+ para coletar neurônios (Figura 1E e Figura 2F).
      2. Portão a população PAX6+ da população neun para coletar astrócitos (Figura 1E,F e Figura 2F).
      3. Portão e coletar populações gliais adicionais (como células progenitoras oligodendrocyte, como mostrado aqui pelo OLIG2+) da população NeuN-PAX6 (Figura 1F).
        NOTA: Caso a determinação de cortes adequados de gating seja difícil com o software de citometria de fluxo devido a populações indistintas, pode ser útil modificar o número de eventos que estão sendo visualizados (aumentando ou reduzindo o número de eventos na trama do FANS).
  2. Colete amostras adequadamente com base na análise a jusante pretendida.

6. Coleção de populações de FÃS para análises moleculares a jusante

  1. Para sequenciamento de RNA a granel, colete 50.000-500.000 núcleos em PBS (ver também a seção 7.1).
    1. Adicione 2 mL de solução de sacarose, 50 μL de 1 M CaCl2 e 30 μL de 1 M Mg(CH3COO)2, e encha com PBS até 10 mL.
    2. Inverta e incuba no gelo por 15 minutos, depois centrífuga a 900 × g por 10-15 min a 4 °C.
    3. Aspire o supernaspe, resuspend em 1 mL de reagente extrato de RNA, vórtice, congele em gelo seco e armazene a -80 °C.
    4. Alternativamente, colecione as amostras diretamente em 200 μL do reagente extrato de RNA. Adicione o reagente extrator de RNA até 1 mL após a classificação, mantendo uma razão de 1:1 do reagente à amostra classificada. Vórtice, congele em gelo seco e armazene a -80 °C.
  2. Para ensaio em massa para cromatina acessível à transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), colete 50.000-75.000 núcleos em PBS em um tubo de microcentrifuge revestido com 5% de albumina de soro bovino (BSA). Congele os núcleos em gelo seco/-80 °C ou utilize-os imediatamente para a preparação do ATAC.
  3. Para sn RNA-seq ou ATAC-seq, coletar núcleos em 0,04% BSA na PBS (ver também seção 7.2).

7. Dicas de preparação para pré-biblioteca

  1. Preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA nuclear a granel
    1. Após a coleta no reagente de extração de RNA, realize a extração padrão de RNA fenol/clorofórmio adicionando fenol/clorofórmio e precipitando RNA da camada aquosa superior com etanol, seguido pela digestão DNase no tubo (15 min).
    2. Realize a limpeza e o concentrado de RNA em um volume final de 15 μL de água.
      NOTA: Usando este método, a recuperação representativa de 300 mg de amostra de córtex adulto é de ~300.000 núcleos NeuN+ (15-20 ng/μL total de RNA após limpeza e concentração) e ~250.000 núcleos PAX6+ (10-12 ng/μL total RNA após limpeza e concentração). Esse rendimento representativo pode variar muito de acordo com a qualidade da amostra, a stringency gating e a recuperação do RNA.
    3. Realizar reação quantitativa em cadeia de polimerase (qPCR) antes do sequenciamento para confirmar o enriquecimento de astrócitos com base na alta expressão diferencial de marcadores astrócitos canônicos (GFAP, SOX9), desidrogenase de 10 formiltetrahidrofola (ALDH1L1)) e esgotamento de marcadores de linhagem neuronal e outras células (Figura 1G).
      NOTA: A coleta da população duplamente negativa (NeuN-PAX6-) permite uma análise de controle de qualidade qPCR mais precisa e multicamadas para o enriquecimento relativo dos astrócitos (Figura 2H).
    4. Gere bibliotecas RNA-seq usando um kit recomendado para baixos valores de número de integridade de RNA, como esperado a partir de amostras pós-morte.
  2. Preparação da biblioteca de sequenciamento de núcleo único
    1. Realize o sequenciamento de sn através de um núcleo de sequenciamento institucional.
    2. Para processamento e sequenciamento baseados em nanofluidos, usar a concentração recomendada de 1 × 106 células/mL em pelo menos 60 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e 3 × 106 células/mL em pelo menos 20 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível usando sequenciamento (snATAC-seq).

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Resultados

Os núcleos foram coletados de tecido neocórtex temporal fresco (não fixado) com um tempo de coleta pós-morte de 12 h. Após a dissociação do tecido em suspensão de núcleos, as amostras foram incubadas com anticorpos contra NeuN, PAX6 e OLIG2, e classificadas de acordo com o gating mostrado na Figura 1 e Figura 2. Os núcleos foram coletados de populações classificadas por NeuN+, PAX6+NeuN e OLIG2+NeuN (Figura 1E,F e <...

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Discussão

O desenho experimental seguindo o protocolo delineado deve ser finalizado após considerar vários fatores biológicos e técnicos. As amostras de tecido inicial são congeladas frescas, sem terem sido fixadas, e de preferência têm um curto intervalo de coleta pós-morte para maximizar a recuperação dos núcleos. Com base na experiência, um PMI de até 24 horas permite a recuperação adequada dos núcleos; no entanto, um PMI de 12 h ou menos é preferível para otimizar a recuperação de núcleos intactos. Fatores adicionais além do P...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostamos de agradecer aos membros da Patologia e Neurocirurgia da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai pela ajuda na aquisição de tecido cerebral desidentifitado e no CORE de Citometria de Fluxo do ISMMS para aconselhamento especializado. O estudo foi parcialmente financiado pelo NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (para N.M.T.) e R61DA048207 (para S.A.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x PBS pH 7.2Invitrogen70013073
ANTI-NEUN ANTICORPO CLONE A60MilliporeMAB377A5MIcamundongo anti-NeuN conjugado a um composto fluorescente AF555 (excitação, 553 nm; emissão, 568 nm)
ANTICORPO ANTI-OLIG2 ANTI-OLIG2MilliporeMABN50A4MIcamundongo anti-OLIG2 conjugado a um composto fluorescente AF488 (excitação, 499 nm; emissão, 520 nm)
Bovino Albumina deSoro FisherBP9704-100
Câmara de Contagem de Linha BrilhanteHausser Scientific3110V
Cloreto de Cálcio AnidroFisherC614-3
Filtros de Pilha, 40 µ MSP Scienceware136800040
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)InvitrogenD1306
DL-DithiothreitolSigma43815-1G
DNA Library KitIllumina, NexteraFC-121– 1030
DNAse IWorthingtonLS002139
Dounce Moedor de TecidosWHEATON357542
FACS ClassificadorBD BiosciencesBD FACSAria III
Acetato de Magnésio TetrahidratadoFisherM13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTESNovusNBP234705J
RNA Clean & ConcentradorZymo ResearchR1013
RNaseZap Solução de Descontaminação de RNaseInvitrogenAM9780
SMARTer Kit de RNA-Seq Total Encalhado Pico Input MammalianClontech Laboratories635005Tempo de fragmentação de 2,5 minutos, conforme recomendado para baixos valores de RNA RIN.
Sacarose, certificado para cristal, ACS, 500 mgFisherS5500
SW 41 TiBeckman Coulter331362
Tris-HCl, solução 1M, pH 8,0, grau de biologia molecular, ultrapuroThermo ScientificJ22638AE
TritonX-100FisherBP151-500em tampão de lise
ReagenteTRIzol LSReagente Invitrogen10296028
TRIzolde 15596026Invitrogenpara isolamento de solução de RNA
Trypan Blue, 0,4%Gibco15250061
UltracentrifugeBeckman Coulter Optima XE-100A94516
Tubos de ultracentrífuga PP 9/16 X 3-1 / 2Beckman Coulter331372
Água Destilada UltraPure ( Livre de RNAse, DNAse)Invitrogen10977023referido como água destilada
EDTA ultrapuroLife Technologies15576-028
Rotor de caçamba oscilante Surfactante não iônico Reagente

Referências

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  3. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
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  14. Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
  15. Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).

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