Method Article

Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma

DOI:

10.3791/62416

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

In This Article

Summary

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Este artigo introduz o método de desenvolver, caracterizar e rastrear em tempo real a metástase tumoral no modelo de zebrafish de neuroblastoma, especificamente na linha de zebrafish transgênico com superexpressão de MYCN e LMO1, que desenvolve metástase espontaneamente.

Abstract

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O zebrafish emergiu como um importante modelo animal para estudar doenças humanas, especialmente o câncer. Juntamente com as robustas tecnologias transgênicas e de edição de genomas aplicadas na modelagem de zebrafish, a facilidade de manutenção, produtividade de alto rendimento e poderosa imagem ao vivo fazem do zebrafish um valioso sistema modelo para estudar metástase e bases celulares e moleculares subjacentes a esse processo in vivo. O primeiro modelo de metástase do neuroblastoma de zebrafish (NB) foi desenvolvido superexpressando dois oncogenes, MYCN e LMO1, sob controle do promotor de dopamina-beta-hidroxilase (dβh). O MYCN e o LMO1 co-superexpressos levaram à redução da latência e ao aumento da penetração da neuroblastomagênese, bem como à metástase distante acelerada das células tumorais. Este novo modelo reitera de forma confiável muitas características-chave da NB metastática humana, incluindo o envolvimento de alterações genéticas clinicamente relevantes e associadas à metástase; desenvolvimento natural e espontâneo da metástase in vivo; e locais conservados de metástases. Portanto, o modelo de zebrafish possui vantagens únicas para dissecar o complexo processo de metástase tumoral in vivo.

Introduction

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O zebrafish tem sido amplamente utilizado e aplicado em diversas áreas de pesquisa, especialmente no câncer. Este modelo oferece muitas vantagens - como sua reprodução robusta, manutenção econômica e visualização versátil do crescimento tumoral e metástase- tudo isso faz do zebrafish uma ferramenta poderosa para estudar e investigar as bases celulares e moleculares de tumorigênese e metástase. Novas técnicas para mapeamento de genomas em larga escala, transgênese, superexpressão ou nocaute de genes, transplante de células e telas químicas aumentaram imensamente o poder do modelo de zebrafish1. Nos últimos anos, muitas linhas de zebrafish foram desenvolvidas para estudar tumorigênese e metástase de uma variedade de cânceres humanos, incluindo, mas não se limitando à leucemia, melanoma, rabdomiossarcoma e carcinoma hepatocelular2,3,4,5. Além disso, o primeiro modelo de zebrafish de neuroblastoma (NB) foi gerado pela superexpressão mycn, um oncogene, no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob controle do promotor dopamina-beta-hidroxilase (dβh). Com este modelo, foi demonstrado ainda que a ALK ativada pode sinergizar com MYCN para acelerar o aparecimento do tumor e aumentar a penetração do tumor no vivo6.

NB é derivado da linhagem simpática das células da crista neural, e é um câncer altamente metastático em crianças7. É responsável por 10% das mortes relacionadas ao câncer pediátrico8. Amplamente metástase no diagnóstico, a NB pode ser clinicamente apresentada como tumores originários principalmente ao longo da cadeia da gânglio simpático e da medula adrenal de PSNS9,10. A amplificação do MYCN está comumente associada a desfechos ruins em pacientes com NB11,12. Além disso, o LMO1 foi identificado como um gene crítico de suscetibilidade de NB em casos de alto risco13,14. Estudos descobriram que a coexpressão transgênica de MYCN e LMO1 no PSNS do modelo de zebrafish não só promove o início precoce do RN, mas também induz metástase generalizada aos tecidos e órgãos semelhantes aos locais comumente vistos em pacientes com NB13 de alto risco. Muito recentemente, outro fenótipo metastático de NB também foi observado em um modelo mais recente de zebrafish de NB, no qual tanto MYCN quanto Lin28B, codificando uma proteína de ligação de RNA, são superexpressos sob controle do promotor dβh16.

A abordagem transgênica estável no zebrafish é frequentemente usada para estudar se a superexpressão de um gene de interesse poderia contribuir para o desenvolvimento normal e a patogênese da doença14,15. Esta técnica tem sido usada com sucesso para demonstrar a importância de múltiplos genes e caminhos para a tumorigênese do RN6,16,17,18,19,20. Este artigo introduzirá como a linha de peixes transgênicos que sobreexpressa tanto o MYCN quanto o LMO1 no PSNS foi criada e como foi demonstrado que a cooperação desses dois oncogenes acelera o surgimento da tumorigênese e metástase do NB13. Primeiro, a linha transgênica que sobreexpressa o EGFP-MYCN sob controle do promotor dβh (linha MYCN designada) foi desenvolvida injetando a construção dβh-EGFP-MYCN em um estágio de uma célula de embriões AB do tipo selvagem (WT), como descrito anteriormente6,17. Uma linha transgênica separada que sobreexpressa lMO1 na linha PSNS (designada LMO1) foi desenvolvida por cunhar duas construções de DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, em embriões WT no estágio de uma célula13. Foi demonstrado anteriormente que construções de DNA duplo coinjetados podem ser cunhadas no genoma do peixe; portanto, LMO1 e mCherry são coexpressos nas células PSNS dos animais transgênicos. Uma vez que os embriões F0 injetados atingiram a maturidade sexual, eles foram então superados com peixes WT para a identificação de peixes positivos com integração transgene(s). Resumidamente, a prole F1 foi examinada pela primeira vez por microscopia fluorescente para expressão mCherry nas células PSNS. A integração germinal de LMO1 em peixes mCherry-positivo foi confirmada ainda por PCR genômico e sequenciamento. Após a identificação bem sucedida de cada linha transgênica, a prole de peixes transgênicos HEterozigous MYCN e LMO1 foram interladas para gerar uma linha de peixes compostos expressando tanto MYCN quanto LMO1 (denominada MYCN; Linha LMO1). MYCN portador de tumor; Os peixes LMO1 foram monitorados por microscopia fluorescente quinzenalmente para a evidência de tumores metastáticos nas regiões distantes do local primário, região da glândula interrenal (IRG, zebrafish equivalente à glândula adrenal humana)13. Confirmar a metástase dos tumores no MYCN; Foram aplicadas análises histológicas e imunohistoquímicas de peixes LMO1, histológicas e imunohistoquímicas.

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Protocol

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Todos os métodos de pesquisa utilizando zebrafish e cuidados/manutenção animal foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Clínica Mayo.

1. Preparação e microinjeção de construções transgênicas para o desenvolvimento da linha de zebrafish transgênico LMO1 com superexpressão em PSNS

  1. Para desenvolver o clone de entrada LMO1-pDONR221 , amplie a região de codificação do LMO1 humano a partir de cDNA obtido a partir da linha celular humana usando PCR.
    1. Faça uma reação de 25 μL conforme detalhado aqui: 2,5 μL de 10x padrão Taq Reaction Buffer, 0,125 μL de Taq DNA Polymerase, 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 2 μL de modelo cDNA, 0,5 μL de 10 μM para frente LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL de 10 μM reverso LMO1 ATTB2 primer e 18,875 μL de água.
      NOTA: Use o primer LMO1 ATTB1 para a frente: 5'-GGGGGGACAAGTGTACAAAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGAGGA-3' e primer LMO1 ATTB2 reverso: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. Amplie usando o seguinte programa: 1 ciclo de 94 °C, 2 min; seguido por 30 ciclos de (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) e 72 °C, 7 min.
  2. Clone LMO1 PRODUTO PCR no vetor doador pDONR221 gateway por reação recombinase BP6,13 (fragmento PCR + Vetor doador = Clone de Entrada).
    1. Para uma reação de 10 μL, misture 1 μL de produto pcr LMO1 purificado (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 vetor doador, e 6 μL de tampão TE (pH 8.0) com 2 μL de mistura de enzima BP, incubar por 1h a 25 °C e transformar-se em TOP10 competente E. coli usando o protocolo do fabricante.
    2. Em seguida, espalhe 50-200 μL do frasco de transformação em uma placa de ágar Luria Broth (LB) contendo 50 μg/mL kanamicina e incubar a 37 °C durante a noite.
    3. Selecione clones inoculando uma única colônia em 2-5 mL de LB com kanamycina de 50 μg/mL e culminando durante a noite (16-18 h) a 37 °C.
    4. Use 2 mL de cultura bacteriana durante a noite para isolamento plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Para verificar o plasmídeo LMO1, envie amostra de plasmídeo para sequenciamento com primer M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. Para gerar um clone de entrada dβh-pDONRP4-P1R, obtenha o produto Dβh PCR6,13 amplificando a região promotor de 5,2 kb usando o clone CH211-270H11 BAC como modelo para preparar uma reação de 20 μL como descrito anteriormente na etapa 1.1.1. Utilize os seguintes parâmetros do programa PCR: 94 °C, 2 min; 10 ciclos de 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 ciclos de 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (com primer dianteiro 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' e primer reverso 5'-GGGGACTGCTTTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTTGTTGTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    NOTA: Devido aos modelos de DNA longos nesta etapa, garanta o uso de um sistema PCR apropriado para amplificação PCR precisa.
  4. Clone o produto PCR dβh no vetor doador do gateway pDONRP4-P1R por reação de recombinase da BP6,13 (fragmento pcr + vetor doador = Clone de entrada).
    1. Misture 1 μL de produto pcr dβh purificado (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) de vetor doador pDONRP4-P1R, e 6 μL de tampão te (pH 8.0) com 2 μL de mistura de enzima BP em um total de 10 μL de reação, incubar por 1 h a 25 °C.
    2. Transforme-se em TOP10 competente E. coli de acordo com o protocolo do fabricante. Isole o plasmídeo conforme descrito nas etapas 1.2.2.2-1.2.4 e verifique plasmídeos sequenciando com primers M13-F (5'-GTAAACGACGGCCAG-3') e M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Gerar a construção de expressão dβh:LMO1 .
    1. Combine 1 μL de cada clone de entrada (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 e p3E-polyA11) (20 fmole cada), 1 μL (60 ng/μL) de vetor de destino modificado com locais de reconhecimento I-SceI e 4 μL de tampão de TE (pH 8.0) contendo 2 μL do mix de enzimas de recombinase LR. Incubar esta mistura por 1h a 25 °C.
    2. Seguindo o protocolo do fabricante, transforme bactérias em TOP10 E. coli quimicamente competente. Isole plasmid conforme descrito nas etapas 1.2.2.2-1.2.4 e verifique plasmid sequenciamento com primers DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3') e LMO1 (5'-GGCATTGGAGAGTACTGGCA-3').
  6. Gere a construção de DNA dβh:mCherry com um sistema de gateway combinando clones de entrada de um promotor dβh de 5,2 kb, pME-mCherry e p3E-polyA no vetor de destino modificado contendo locais de reconhecimento I-SceI mencionados anteriormente na etapa 1.5.16. Isole plasmídeos conforme descrito nas etapas 1.2.2-1.2.4 e verifique plasmid sequenciando com o primer DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3').
  7. Linearize a construção de DNA dβh:LMO1 e a construção de DNA dβh:mCherry (a uma proporção de 3:1, respectivamente) em um volume de reação de 15 μL com 1 μL de enzima I-SceI (5 U/μL) e 0,75 μL de tampão (10x), e incubar à temperatura ambiente por um mínimo de 4 h ou durante a noite. Certifique-se de que a concentração de DNA não exceda 750 ng em reação.
  8. No dia seguinte e após a linearização dos construtos, adicione 0,5 μL de enzima I-SceI fresca (5 U/μL) e 0,5 μL de 0,5% de vermelho fenol em 5 μL de mistura total de DNA da etapa anterior de 1,7. Microinjete a solução total (de 50-80 pg de DNA linearizado) em embriões AB de um estágio celular (e até 500 embriões) usando agulha de micropipette de vidro de 1,0 mm de diâmetro como descrito anteriormente17. Armazene a mistura de DNA restante a -20 °C para futuras injeções.

2. Tela e verifique linha de peixes transgênicos LMO1 para transmissão germinal de LMO1 e mCherry

  1. Aos 3-4 dias após a fertilização (dpf), anestesia embriões injetados com 0,02% de tricaine e trie-os para a expressão fluorescente mCherry, que se apresenta em qualquer lugar do corpo de peixe devido à transgênese do mosaico. Transfira embriões mCherry positivos em uma placa de Petri com água de ovo fresco e crie embriões para a maturidade sexual de acordo com o livro de zebrafish21.
    NOTA: Espera-se que a proporção de peixes positivos varie dependendo da experiência e experiência do pessoal da pesquisa. Por exemplo, amadores iniciantes podem ter uma baixa taxa de integração de 10%, em comparação com os de um especialista de ≥50%.
  2. Para determinar o peixe fundador com dβh:LMO1 e dβh:mCherry transgenes integrados em células germinativas, supere os pares únicos de peixes F0 sexualmente maduros mCherry-positivos da etapa anterior (2.1) com peixe WT AB. Trie a geração F1 para embriões mCherry positivos em 3-4 dpf.
  3. Para confirmar que os peixes mCherry-positivos carregam transgene LMO1 , isolar o gDNA de F1 mCherry-positivo embrião único usando o tampão de extração gDNA, que contém: 12,5 μL de tampão de 4x lysis (500 μL de 1 M Tris com pH de 8,4, 2,5 mL de cloreto de potássio de 1 M e 47 mL de água purificada), 35 μL de água purificada, água purificada, 47 mL de água purificada, 35 μL de água purificada, água purificada, 47 mL de água purificada, 35 μL de água purificada, água purificada, água purificada e 2,5 μL de proteinase K a 10 mg/mL. Incubar a amostra por 16 h a 55 °C, seguido por 10 min a 98 °C.
  4. Use o gDNA extraído (2 μL) como modelo para o PCR genotipante com primers: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGAGAGTACTGGCA -3' e LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', e o seguinte programa PCR: 1 ciclo de 94 °C, 10 min; 35 ciclos de (94 °C para 30 s, 60 °C para 30 s; 68 °C, 30 s); e 68 °C por 7 min. Confirme o fragmento amplificado de 182 bp por sequenciamento.
  5. Após a confirmação do genótipo, eleve os demais embriões mCherry-positivos F1 até a maturidade de acordo com as diretrizes padrão do livro de zebrafish21. Clipe de barbatana e genótipo-los aos 2-3 meses de idade usando as etapas 2.3-2.4 do protocolo acima para confirmar ainda mais a integração do transgênico LMO1 no peixe.
    NOTA: O peixe F1 LMO1 positivo será o peixe transgênico estável [Tg(dβh:LMO1), Tg(dβh:mCherry)] (designado como linha LMO1 ).
  6. Reproduza F1 LMO1 peixe transgênico estável com peixe WT e repita conforme necessário para propagar esta linha.

3. Outcross de linhas transgênicas LMO1 e MYCN para criar modelo metastático

  1. Uma vez gerada a linha de zebrafish transgênicos LMO1, entrelaçada com a linha MYCN6,17 para desenvolver linha de peixes transgênicos heterozigosos, superexpressando tanto MYCN quanto LMO1.
  2. Em 1 dpf, classifique a prole de outcross para expressão EGFP com microscópio de fluorescência estereoscópica, que apresenta como pontos positivos de EGFP na região do cérebro traseiro.
    NOTA: Alternativamente, se nem todos os embriões forem classificados para o MYCN em 1 dpf, eleve os embriões até a idade adulta e o genótipo por recorte de barbatanas e usando diretrizes previamente declaradas das etapas 2.3-2.4 para isolamento gDNA e genotipagem pcr, com primers: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', e o seguinte programa com polimerase Taq padrão: 1 ciclo de 94 °C para 3 min, 35 ciclos de (94 °C para 30 s, 60 °C para 30 s e 68 °C para 3 min), e 68 °C para 7 min com tamanho de amplicon esperado de 145 bp.
  3. Após a classificação para EGFP em 1 dpf, isole embriões selecionados em pratos petri separados e rotule pratos como: MYCN+ (EGFP-positivo) ou MYCN- (EGFP-negativo).
  4. Em 3-4 dpf, visualize e classifique embriões de ambos os grupos (passo 3.3) para expressão LMO1 com um microscópio de fluorescência estereoscópica. Procure a expressão de proteína fluorescente vermelha como manchas tanto no gânglio cervical superior quanto nas células neuronais não-PSNS dopaminérgicas na região da cabeça, especialmente na oblongata medulla do cérebro traseiro6,13.
    NOTA: Tela para mCherry/LMO1 antes que os embriões atinjam 5 dpf, pois as bexigas de natação cheias de ar se desenvolvem totalmente até lá e farão com que os embriões flutuem, resultando em difícil focalizar as células PSNS durante o processo de triagem.
  5. Uma vez concluída a classificação, isole os peixes classificados em quatro grupos de genótipos diferentes e rotule como abaixo. Levante os peixes classificados em condições idênticas de acordo com os protocolos padrão do livro de zebrafish21.
    1. SOMENTE MYCN (EGFP-positivo),
    2. Somente LMO1 (mCherry-positivo),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP e mCherry double positivo),
    4. WT (EGFP e mCherry double negativo).

4. Visualizando a carga tumoral em linhas transgênicas de zebrafish

  1. Com 4 semanas após a fertilização (wpf), anesthetize peixe classificado a partir do passo 3,5 com 0,02% de tricaine em uma placa de petri.
  2. Visualize tumores com um microscópio de fluorescência estereoscópica lançando peixes suavemente com uma espátula metálica em ambos os lados laterais para ver o tumor. Espere que os tumores apresentem-se como massas únicas EGFP-, mCherry-, ou duplas massas EGFP-e-mCherry-positive que surgem da região da glândula interrenal (perto da cabeça e do rim).
    NOTA: É possível que o início inicial do tumor seja tipicamente apresentado com uma massa positiva de fluorescência mais brilhante e maior em um lado da glândula interrenal, razão pela qual é crucial visualizar ambos os lados dos peixes para evitar o aparecimento precoce do tumor.
  3. Após a identificação do possível peixe portador de tumor, isole os peixes em um tanque separado com rótulos apropriados, o que inclui data de nascimento, data em que o tumor foi examinado e genótipo.
  4. Aos 6 wpf, repita os passos anteriores 4.1-4.3 para testar peixes portadores de tumores e peixes com rolamento não tumorais novamente para confirmar a presença de tumores para peixes com tumores previamente examinados ou identificar novos possíveis peixes portadores de tumores, respectivamente. Procure por massa positiva sustentada ou aumentada em peixes com tumores confirmados.
  5. Depois de identificar peixes portadores de tumores, monitore-os quinzenalmente em busca de evidências de migração de células tumorais, que apresentam como minúsculas massas tumorais EGFP-e/ou mCherry positivo longe do local principal da tumorgênese (região da glândula interrenal). Isole esses peixes em tanques separados conforme necessário e rotule adequadamente para indicar possíveis metástases.
  6. Para confirmar ainda mais a metástase, continue rastreando esses peixes regularmente (a cada duas semanas) até que as distantes massas tumorais fluorescência positivas apresentem claramente maior tamanho, indicando crescimento de tumores nos locais metastáticos.

5. Processamento tecidual e secção de parafina de peixes portadores de tumor

NOTA: Realizar esta etapa para caracterizar os tumores primários e/ou metastáticos desenvolvidos espontaneamente no MYCN e MYCN; LMO1 peixe transgênico.

  1. Após a identificação e verificação de peixes portadores de tumor, sacrifique os peixes do passo 4.6 em uma placa de Petri submergindo peixes em 0,02% de tricaine para anestesiar primeiro e, em seguida, aumentando a dosagem de tricaine até que o peixe não seja mais ressumerado. Corte o peixe em dois pedaços com uma peça contendo a cabeça e uma parte da seção do meio do corpo (incluindo tumor), e outra peça com o resto da seção do meio e da cauda do peixe.
  2. Fixar ambas as seções de peixe com 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS por 1h em temperatura ambiente em um roqueiro. Para aumentar a eficiência de fixação, substitua o buffer por um NOVO PFA de 4% para aumentar a penetração nos órgãos internos de forma eficaz e rápida. Deixe o peixe com tampão de fixação fresco em um roqueiro a 4 °C durante a noite ou por 48 h.
    ATENÇÃO: A PFA é tóxica. Uma vez que os procedimentos de precaução e o descarte adequado do reagente dependem das normas da sua instituição, busque as orientações adequadas antes de usar e descarte do reagente.
  3. Antes do processamento, coloque a amostra em solução de decalcificador 100% rápida para 15-20 min à temperatura ambiente. Certifique-se de usar um recipiente não metálico e verificar amostras durante toda a incubação para evitar a descalcificação. Se o tecido amostral parecer fortemente degradado, coloque a amostra na água ou a 4 °C para retardar o processo de descalcificação.
  4. Uma vez fixado e decalcificado, lave as amostras de peixe com água da torneira corrente por 1h e coloque-a em do processador. Se houver mais de uma amostra, separe cada uma em seu próprio.
  5. Desidratar e preparar o tecido para a incorporação de parafinas colocando com peixes no processador de tecido onde as amostras estão submersas em várias soluções, respectivamente, da seguinte forma: 70% de etanol (60 min, 40 °C), 85% de etanol (50 min, 40 °C), 95% de etanol (40 min, 40 °C) duas vezes, 100% etanol (30 min, 40 °C), outra solução fresca de 100% de etanol (50 min, 40 °C) duas vezes, xileno (30 min, 40 °C), outra solução fresca de xileno (50 min, 40 °C), outro xileno fresco (50 min, 45 °C), parafina (30 min, 45 °C), parafina (20 min, 58 °C) três vezes.
  6. Depois que o tecido for processado, descarregue o da máquina do processador mantendo a organização de cada e certificando-se de evitar misturar as amostras de peixe.
  7. Escolha o molde de tamanho apropriado com base no tamanho do peixe, certificando-se de que o molde caberá todo o com a amostra de peixe. Cubra a parte inferior do molde com parafina líquida a 60 °C.
  8. Coloque imediatamente o com o peixe em cima do molde (certificando-se de que o peixe está colocado em seu lado lateral plano para seções sagitárias) com parafina líquida, e finalize o recheio com parafina até o topo do molde para incorporar completamente o peixe.
  9. Coloque o molde completo na placa fria do microtome de secção até que a parafina seja endurecida.
  10. Uma vez que o bloco de parafina é duro, que pode ser julgado observando visualmente maior opacidade e um toque firme para o bloco, remova suavemente o bloco do molde. Raspe cuidadosamente qualquer excesso de parafina dos lados da fita.
  11. Seção o bloco de peixes embutidos em parafina sagiticamente a 4 mícrons no microtome e flutue as seções em um banho de água quente a 40 °C contendo água destilada.
  12. Transfira cuidadosamente as seções para lâminas carregadas positivamente e asse no forno a 60 °C por 30 minutos antes de manchá-los antes de prosseguir para a etapa 6, 7 ou 8.

6. Hematoxilina e eosina (H&E) coloração de seções de parafina para revisão patológica

  1. Coloque slides contendo seções de parafina a partir da etapa 5.12 em um porta-slides. Dentro de um capuz de fumaça química, desparafinar com xileno 3 vezes, 5 min cada. Descarte a solução após cada uso.
  2. Reidratar seções com 100% de etanol por 3 min, e repetir duas vezes com etanol fresco 100%. Substitua 100% o etanol por 95% de etanol por 3 min e, em seguida, 80% de etanol por 3 min.
  3. Enxágüe seções com água destilada por 5 minutos. Enquanto as seções estão lavando na água, certifique-se de remover partículas oxidadas da hematoxilina filtrando ou deslizando superfície de hematoxilina com um lenço sem fiapos.
  4. Limpe o excesso de água do porta-lâminas com lenços de grau profissionais sem fiapos, e deslizes de manchas em 50% de hematoxilina (diluição 1:1 com água destilada) por 2-5 min, dependendo da preferência de coloração desejada e deterioração do reagente. Descarte a hematoxilina quando a cor da solução mudar de ameixa para azul/marrom ou quando o tempo de coloração se tornar excessivo. Enxágüe os slides com água da torneira por 20 minutos.
  5. Descolorir as seções em 1% de etanol ácido (3,3 mL de ácido clorídrico com 50 mL de 70% de etanol) mergulhando rapidamente os slides várias vezes. Slides podem ser mergulhados até 3 s, mas quanto mais tempo os slides são mergulhados, mais leve as seções se tornam.
  6. Enxágüe os slides na água da torneira duas vezes por 1 minuto cada, e uma vez com água deionizada. Como opção, slides podem ser deixados durante a noite nesta fase, encharcando água.
  7. Mergulhe as seções em 1,36% de solução de carbonato de lítio (47 g de carbonato de lítio, 3500 mL de água) para 3 s. Certifique-se de não incubar demais as seções, já que quanto mais tempo o tempo na solução de carbonato de lítio, maior a probabilidade de o tecido flutuar.
  8. Enxágüe as seções na água da torneira por 5 minutos e limpe o excesso de água do porta-lâminas com lenços de grau profissionais livres de fiapos.
  9. Contratente os slides em eosina 100% pronta para uso para 15-30 s, e desidrate imediatamente com 95% de etanol duas vezes por 5 min cada. Substitua por 100% de etanol duas vezes por 5 min cada, descartando as soluções após cada uso.
  10. Limpe as seções em xileno por 15 minutos e repita duas vezes por 3 vezes no total. Opcionalmente, os slides podem ser deixados no xileno durante a noite à temperatura ambiente para limpar melhor o excesso de água.
  11. Deixe as lâminas secarem no capô da fumaça química e, em seguida, monte um deslizamento de cobertura usando meio de montagem para selar a amostra de tecido.
  12. Visualize e visualize as seções de tecido manchado sob microscopia. Examine cuidadosamente os tumores no local primário (a região da glândula interrenal no rim da cabeça) e as metástases esporádicas distantes em outros tecidos e órgãos do peixe. Envie lâminas manchadas para que as seções teciduais sejam revisadas pelos patologistas. Com base nas características patológicas similares do modelo de peixe ao neuroblastoma humano, espere os tumores que surgiram apenas em MYCN ou MYCN; Peixe LMO1 a ser diagnosticado pela primeira vez como neuroblastoma por patologistas.

7. Análise Imunohistoquímica (IHC) com anticorpos contra marcador de NB e transgenes superexpressos para confirmar ainda mais a propagação do tumor e sua propriedade de linhagem simadrenal

  1. Coloração com sistema de coloração totalmente automático
    1. Para comparar melhor o resultado do IHC com o da coloração de H&E, selecione slides adjacentes da etapa 5.12 para coloração do IHC.
      NOTA: Embora um sistema automatizado de coloração permita resultados mais rápidos e menos trabalhosos, um protocolo manual para coloração de IHC pode ser usado na ausência desse, referindo-se a etapas da subseção 7.2.
    2. Diluir o anticorpo primário contra hidroxilase de tyrosina (TH) (1:500), um marcador de neuroblastoma, baseado na concentração desejada e na quantidade total necessária com o diluente de anticorpos primário correspondente do sistema automatizado.
      NOTA: As concentrações de anticorpos ideais podem variar dependendo do anticorpo e do tecido.
    3. Uma vez que o sistema automatizado usa a recuperação de antígeno induzido pelo calor a bordo com solução de recuperação de epítope por 20 minutos e o reagente de detecção correspondente do sistema, certifique-se de que os parâmetros para a máquina sejam definidos como: Bloqueio de Peroxidase, 5 min; Anticorpo primário com concentração desejada, 15 min; anticorpo secundário igG anti-coelho biotinilado (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; substrato intenso da DAB misto, 5 min; e Hematoxylin, 5 min.
    4. Uma vez que as configurações estejam definidas, coloque a bandeja de anticorpos na máquina. Configure os slides criando um novo estojo, que rotulará os slides. A máquina está agora carregada e pronta para funcionar (deswaxing, coloração e contra-retenção).
    5. Uma vez que os slides são desespecidos, manchados e contra-manchados usando a máquina automatizada, desidratam os slides em gradientes de etanol de 70%, 95% e 100% por 5 min cada. Submergir slides de seções em 100% de etanol fresco novamente por 5 min.
    6. Limpe as seções em xileno por 5 minutos, duas vezes ou deixe slides no xileno durante a noite para limpar melhor o excesso de água.
    7. Deixe as lâminas secarem no capô da fumaça química e, em seguida, monte um deslizamento de tampa usando um meio de montagem. Visualize e visualize as seções de tecido manchado com microscopia.
    8. Para confirmar firmemente a metástase no modelo de peixe, compare os slides manchados com anticorpos contra o marcador neuroblastoma do passo 7 aos manchados pela H&E a partir do passo 6.
      NOTA: Espere ver manchas positivas para o marcador de neuroblastoma, TH, em todas as células tumorais identificadas pela coloração de H&E. Também não há coloração positiva para TH em tecidos adjacentes onde os tumores metastáticos foram identificados em LMO1; Mycn peixe. Certifique-se de selecionar o controle WT e os peixes somente MYCN que têm idade semelhante ao MYCN; Peixe LMO1 para esta análise para descartar a possibilidade de que os tumores metastáticos sejam tumores primários multifocais.
  2. Coloração manual sem sistema automatizado de coloração IHC
    1. Depois que os slides forem assados, selecione slides adjacentes da etapa 5.12 para permitir uma melhor comparação entre a mancha de H&E e IHC para desparafinar. Dentro de uma capa de fumaça química, depilar e reidratar os slides com xileno usando as etapas anteriores 6.1 e 6.2., respectivamente.
    2. Após a desparafinação e reidratação, mergulhe slides em solução de bloqueio endógeno de peróxido (1x PBS contendo 0,1% de azida de sódio e 0,3% peróxido de hidrogênio) por 5 min a temperatura ambiente. Lave slides em PBS fresco 1x por 3 min e repita duas vezes para um total de 3 vezes.
      ATENÇÃO: O azida de sódio é extremamente tóxico. Certifique-se de praticar procedimentos de precaução e descarte adequado de reagente, dependendo das normas da sua instituição.
    3. Recupere o antígeno incubando lâminas em solução com proteinase K (1:500 em 1x PBS) por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave slides 3 vezes com 1x PBS por 3 min cada.
    4. Bloqueie slides incubando com 5% de soro de cabra em 1x PBS por 30 minutos em temperatura ambiente no roqueiro. Lave slides com pbs 1x fresco duas vezes por 3 min cada.
    5. Adicione 4 gotas de solução de bloqueio Avidin diretamente no slide e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar slides com PBS fresco 1x duas vezes por 3 min cada, adicione 4 gotas de solução de bloqueio de Biotina e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
    6. Depois de bloquear slides, incubar em anticorpo primário de hidroxilase de tyrosina (TH) (1:500) por 45-60 min em temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Mancha com anticorpos adicionais contra transgênicos e outros marcadores relevantes para abordar a fisiologia e atividade do tumor primário e outros locais metastáticos. As concentrações ideais de anticorpos podem variar dependendo de anticorpos e tecidos.
    7. Lave slides com PBS fresco de 1x por 3 min, repetindo duas vezes com um total de 3 vezes.
    8. Incubar lâminas em anticorpo secundário de anticorpo secundário anti-coelho IgG (1:500) diluído em solução de bloqueio por 45-60 min à temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem anterior 7.2.7.
    9. Adicione hrp conjugado Avidin (1:300 em 1x PBS), e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Lave slides 3 vezes com PBS fresco 1x por 5 min cada.
    10. Prepare a solução de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) (2,5 mL de água destilada, 1 gota de tampão de kit, 1 gota de peróxido de hidrogênio e 2 gotas de DAB do kit), e coloque gotas de DAB diretamente em slides perto de um microscópio. Após adicionar DAB, observe a reação de mudança de cor nos slides sob microscópio. Uma vez alcançada a intensidade de coloração desejada, pare a reação colocando seções de slides em água destilada a frio.
    11. Contratente os slides com hematoxilina fresca de 50%, submergindo ou mergulhando amostras por alguns segundos curtos e colocando de volta em água destilada. Repita como desejado, mas normalmente, uma vez deve ser suficiente, já que as seções teciduais são finas.
    12. Desidratar amostras de tecido em lâminas em gradiente de álcool como descrito anteriormente na etapa 7.1.5 e continuar através das etapas restantes (com a última etapa como 7.1.8) para terminar a análise do IHC.

8. Picrosirius mancha vermelha de lâminas de parafina para acúmulo de colágeno em tumores como estudo mecanismo

  1. Repita as etapas 6.1-6.3 para desapor, hidratar e lavar seções de parafina em slides.
  2. Depois de borrar o excesso de água do porta-lâminas com lenços livres de fiapos profissionais, colorigue em 50% de hematoxilina por 10 minutos. Enxágüe os slides com água da torneira por 10 minutos.
  3. Transfira os slides para Picrosirius Red e incubar à temperatura ambiente por 1h.
  4. Lave os slides em água acidificada (ácido acético glacial de 5 mL em 1 L de torneira ou água destilada) duas vezes, incubando por 5 minutos no shaker.
  5. Decante a maior parte da água dos slides primeiro antes de agitar fisicamente e borrar seções em lâminas para remover o máximo de água possível.
  6. Coloque rapidamente slides em três mudanças de 100% de etanol para desidratar seções de parafina.
  7. Repita as etapas 6.10 e 6.11 para limpar slides no xileno e montar a amostra. Em seguida, imagem com microscópio composto que é equipado com uma câmera.
  8. Usando ImageJ, conte as fibras de colágeno vermelho-positivo picrosirius em pelo menos três campos aleatórios para cada seção. Comparar entre slides do MYCN e MYCN; Seções de peixes LMO1.

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Results

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Para determinar se o LMO1 sinergiza com MYCN para afetar a patogênese NB, construções transgênicas que impulsionam a expressão de LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) ou MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nas células PSNS sob controle do promotor dβh foram injetadas em embriões de zebrafish13. Conforme ilustrado na Figura 1A, após o desenvolvimento de linhas transgênicas estáveis e a validação de seus genótipos, os pe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O zebrafish tem sido comumente utilizado em pesquisas nas últimas décadas, especialmente em pesquisas sobre câncer, por razões óbvias, como sua facilidade de manutenção, reprodução robusta e claras vantagens para a imagem in vivo1,28. O modelo de zebrafish pode ser facilmente manipulado embrionáriamente devido à sua fertilização e desenvolvimento externo, o que complementa bem aos organismos modelos de mamíferos, como ratos e camundongos, para estudos ge...

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa R01 CA240323 (S.Z.) do Instituto Nacional de Câncer; uma subvenção W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (DoD); um prêmio V Scholar da V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e uma Bolsa de Plataforma do Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e suportes do Mayo Clinic Cancer Center e Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
vetorSK-4100do vetor do jogo do vetor da diaminobenzidina (DAB)
Fisher científico/Acros orgânico64-19-7
Agarose GP2Midwest Scientific009012-36-6
Pel-FreezP40101
Avidin/Biotina que obstrui o vetorSP-2001 do jogo de bloqueio da hidroxilase (TH)
Detecção intensa de BOND RLeica BiosystemsDS9263
BOND diluente de anticorpo primárioLeica Biosystems Newcastle, Ltd.AR9352
Instrumento BOND-MAX IHCLeica Biosystems Newcastle, Ltd.N/Asistema de coloração IHC totalmente automatizado
CH211-270H11 BAC cloneBACPAC centro de recursos (BRFC)N/A
Microscópio composto equipado com câmera DP71OlympusAX70
Cytoseal XYL (meio de montagem à base de xileno)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601pronto para uso (sem necessidade de preparação)
EtanolCarolina86-1263
Expandir Sistema de PCR de Modelo LongoRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Clonase II mistura enzimáticaInvitrogen, CA11789-020
Gateway LR Clonase II mistura enzimáticaInvitrogen, CA11791-100
Anticorpo secundário anti-Rb de cabra (Biotinilado)DakoE0432
Solução de hematoxilina, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Ácido clorídricoAqua Solutions4360-1L
Peróxido de hidrogênio, 3%Fisher ScientificH324-500
I-SceI enzimaNew England Biolabs, MAR0694L
Sulfato de canamicinaTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Carbonato de LítioSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Micrótomo para seccionamentoLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Quimicamente Competente E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de UtahN/Aum presente generoso
(Consulte a página da web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page para obter material, que é distribuído livremente conforme descrito.)
Cera de parafinaSurgipath Paraplast39603002Parrafin para parafina
ParaformaldeídoAlfa AesarA11313
vetor pDEST (vetor de destino modificado contendo locais de reconhecimento I-SceI)Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, Karlsruhe, AlemanhaN / Aum presente generoso
pDONR 221 vetor doador de gatewayThermo Fisher Scientific12536-017
pDONRP4-P1R vetor doador Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de UtahN/Aum generoso presente
vermelho de fenol, 0,5%Sigma Aldrich  P0290
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10XBioRad1610780
Kit de coloração vermelha PicrosirriusPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinase K, recombinante, PCR GrauRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Descalcificador RápidoApex EnginerringRDO04
Azida de Sódio (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Microscópio de fluorescência estéreoLeicaMZ10F
Microscópio de fluorescência estereoscópica equipado com uma câmera digital de mira DS-U1 para imagem de imagemNikonSMZ-1500
Taq DNA PolimeraseNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP®   6 Processador de Infiltração a Vácuo AISakuraN/AModelo #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XilenoThermo FisherScientific X3P1GAL
3,3' - ácido acético do Anticorpo

References

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