Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.
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Artigo de método
Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fígado é o maior órgão em mamíferos. Desempenha um papel importante no armazenamento de glicose, secreção de proteínas, metabolismo e desintoxicação. Como executor da maioria das funções hepáticas, hepatócitos primários têm capacidade de proliferação limitada. Isso requer o estabelecimento de modelos de expansão de hepatócitos ex vivo para pesquisa fisiológica e patológica hepática. Aqui, isolamos hepatócitos murinos por dois passos de perfusão de colagenase e estabelecemos uma cultura organoide 3D como o "mini-fígado" para recapitular interações célula-células e funções físicas. Os organoides consistem em populações de células heterogêneas, incluindo progenitores e hepatócitos maduros. Introduzimos o processo de forma detalhada para isolar e cultivar os hepatócitos murinos ou hepatócitos fetais para formar organoides dentro de 2-3 semanas e mostrar como passá-los mecanicamente tubos para cima e para baixo. Além disso, também introduziremos como digerir os organoides em células únicas para infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9. Os organoides podem ser usados para telas de drogas, modelagem de doenças e pesquisa hepática básica, modelando biologia hepática e patobiologia.
Introdução
Organoides são aglomerados in vitro auto-organizados, tridimensionais (3D) que incluem células-tronco auto-renovadores e células diferenciadas multi-linhagem1,2. Os organoides de muitos órgãos foram estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes ou adultas por fatores de nicho bem definidos, incluindo o intestino, o cérebro, o cólon, o rim, o fígado, o pâncreas, a tireoide, o estômago, a pele e o pulmão3,4,5,6,7 . Os organoides recapitulam funções celulares físicas imitando o desenvolvimento (originário de células-tronco pluripotentes embrionárias ou induzidas, PSCs) ou progressão de homeostase/regeneração (originária de células-tronco adultas, ASCs), o que abre novos caminhos na pesquisa e terapia de doenças8,9.
Como o maior órgão dos mamíferos, o fígado é o principal responsável pelo armazenamento, metabolismo e desintoxicação. Dois tipos de células epiteliais, hepatócitos e cholangiocitos, constroem a unidade básica de um lobule hepático. Hepatócitos são responsáveis por 70-80% da função hepática10. Embora o fígado tenha notável capacidade de regeneração, a perda rápida de características hepatócidas acontece durante a cultura tradicional de monocamadas por polarização celular disregulada e dediferenciação, o que aumenta a necessidade de pesquisadores e médicos construirem modelos hepáticos de "ponte de lacunas" em um prato. No entanto, até recentemente, os modelos de expansão ex vivo dos hepatócitos primários não tinham sido bem estabelecidos11,12,13,14,15. Organoides hepáticos podem ser estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias/induzidas, conversão de fibroblasto em células semelhantes a hepatócitos e células derivadas de tecidos. O desenvolvimento de organoides hepáticos aumenta a aplicação de um modelo in vitro para telas de drogas e ensaios de toxicidade hepática16,17.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para estabelecer organoides hepáticos de hepatócitos primários murinas. Usando este protocolo, criamos um sistema de cultura in vitro de organoides hepatocitos com duas perfusões de colagemnase. Esses organoides podem ser aprovados para expansão a longo prazo por meses. Sua função fisiológica é altamente consistente com hepatócitos. Além disso, também fornecemos uma descrição detalhada de como realizar manipulação genética, como infecção por lentivírus, transdução de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9 usando organoides. A propagação de organoides hepatocitos esclareceu a possibilidade de usar organoides para entender a biologia hepática e desenvolver abordagens personalizadas e translacionais de medicina.
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Protocolo
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Shandong e foram realizados de acordo com a Licença sob as diretrizes e regulamentos do Home Office (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Este protocolo é usado principalmente para cultivar organoides 3D de hepatócitos primários isolados.
1. Estabelecimento da Cultura Organoide Hepatocito Murine
NOTA: Matriz extracelular como Matrigel ou BME são usadas como matriz de porão para cultura organoides. Armazene a matriz extracelular a -20 °C e pré-descongele a 4 °C ou no gelo. Mantenha a matriz extracelular no gelo durante os experimentos. O meio de lavagem é Avançado DMEM/F12 complementado com GlutaMAX, HEPES e penicilina/estreptomicina. Uma incubadora padrão (37 °C, atmosfera umidificada, 5% CO2) é usada para cultura organoide.
- Preparação de materiais
- Prepare os instrumentos necessários para o experimento: o travesseiro do rato, instrumentos cirúrgicos estéreis como pinça, tesoura, tubos e uma bomba com uma taxa de fluxo de 2-10 mL/min.
- Prepare os reagentes, incluindo o tampão de perfusão, o tampão de digestão e torná-los estéreis para o isolamento do hepatocitado. Adicione colagenase tipo IV fresco (0,10 mg/mL) e CaCl2 (0,50 M) e pré-aqueça o tampão a 37 °C em banho-maria.
- Prepare o meio condicional para produzir R-spondin 1 e todos os estoques de fatores químicos e de crescimento de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Evite congelar e descongelar com frequência o meio condicional e os estoques. Prepare o meio de cultura fresco e use-o dentro de um mês. Isso é fundamental para a eficiência organoide.
- Isolamento hepatócito murino por perfusão hepática e digestão
NOTA: Camundongos machos ou fêmeas entre 12 semanas e 6 meses foram utilizados para a cultura organoide. Não foram encontradas diferenças óbvias na eficiência da formação organoide da idade do rato doador nessa faixa.- Eutanize o rato com um método eticamente aprovado.
- Conserte o rato no travesseiro do rato e limpe a pele e a pele abdominal com 70% de álcool. Exponha o abdômen e levante o fígado acima do resto do corpo. Faça uma incisão no meio da linha para expor o fígado.
- Encha o tubo ligado à bomba com tampão de perfusão. Faça uma incisão da veia portal (cerca de 1/3 do diâmetro da veia) e coloque cuidadosamente um cateter nele. Levante os órgãos digestivos para ajudar a inserir a cânula. Uma gravata com a linha cirúrgica é opcional para evitar deslizar para fora e romper.
- Inicie a bomba e realize a perfusão a uma vazão de 5-7 mL/min com tampão de perfusão. Se o fígado ficar pálido imediatamente, corte a veia cava inferior para permitir que o tampão de perfusão flua através de todo o fígado e expulse o sangue.
- Quando o fluxo ficar limpo, remova a cânula. Leva cerca de 5-10 minutos.
- Altere o tampão de perfusão com tampão de digestão pré-aquecido a uma taxa de 5 mL/min. Não pare a bomba até que o fígado fique macio e incha. Remova o cateter quando o fígado parar de inchar.
NOTA: É muito importante manter o tempo adequado de digestão para evitar a digestão excessiva e obter células hepáticas únicas. - Corte o fígado e coloque-o em uma placa de 100 mm cheia com 15 mL de meio de lavagem a frio. Corte os ligamentos com uma tesoura pequena. Rasgue o fígado em pedaços com pontas de pipeta ou fórceps.
- Pipeta para cima e para baixo suavemente para liberar as células até que o buffer esteja saturado com células (12-15 vezes). Despeje a suspensão da célula em um tubo de 50 mL através de filtros de 70 μm.
- Centrifugar por 1-3 minutos a 50 x g e 4 °C. Decantar o supernatante. Opcionalmente, resuspensar as células com meio de lavagem ou resuspensar as células com meio de cultura diretamente. Conte as células com um hemacytómetro.
- Distinguir células vivas ou mortas pela máquina de contador celular após coloração de tingimento de células vivas.
NOTA: É melhor purificar hepatócitos usando percoll frio de 40%. Após esta etapa, hepatócitos viáveis estarão na parte inferior dos tubos.
- Cultura organoide e passagem
- Remova o supernatante e resuspende os hepatócitos com uma mistura de matriz extracelular e meio de cultura em uma razão de 3:1.
NOTA: Recomenda-se 10.000-20.000 células em uma mistura de 50-60 μL por poço para uma placa de 24 poços. É importante trabalhar rapidamente e manter a mistura no gelo durante todo o processo. 200-500 organoides poderiam ser formados nesta concentração. - Adicione a gota celular/mistura na placa com pequenas gotículas para evitar que a gota se conecte. Incubar a placa na incubadora celular a 37 °C, 5% de CO2 por 5-10 min e, em seguida, retirar a placa por 20-25 min até que a matriz extracelular se torne sólida.
- Adicione meio de cultura (500 μL por poço para uma placa de 24 poços) nos poços e devolva a placa à incubadora para cultura organoide. Troque o meio a cada 3-4 dias. Observe os organoides até que sejam grandes o suficiente para serem passagemdos.
NOTA: Um diâmetro com cerca de 400-500 μm é adequado para a passagem de organoides hepatocitados. - Isolar organoides da matriz extracelular com o processo detalhado abaixo. Segure uma pipeta pasteur de vidro em uma chama para estreitar sua abertura (por ~1/2). Pipeta mecanicamente para cima e para baixo 5-10 vezes para dissociar os organoides em organoides menores durante a passagem.
NOTA: Durante a passagem, prepare pontas e tubos de micropipette pré-lavados com tampão de lavagem de ponta para evitar a perda de organoides grudados nos tubos ou pontas.
- Remova o supernatante e resuspende os hepatócitos com uma mistura de matriz extracelular e meio de cultura em uma razão de 3:1.
2. Manipulação genética de organoides hepatocitados de murina
- Células únicas de organoides hepatocitos
- Adicione 500 μL de solução de recuperação de lavagem a frio/célula para cada poço. Pipeta para cima e para baixo para destruir a mistura de matriz celular/extracelular com uma micropipette e, em seguida, transferir a suspensão organoide para um tubo centrífuga de 15 mL no gelo. Opcionalmente, gire o tubo para cima e para baixo de tempos em tempos para descongelar bem a mistura.
- Centrifugar por 5 min a 500-800 x g e 4 °C e descartar o supernatante. Adicione 1 mL de solução de trippsina à pelota e pipeta-a para misturar. Incubar a 37 °C por 5-10 min e, em seguida, parar de digestão adicionando um volume de 2x de meio de lavagem.
- Centrifugar por 5 min a 800 x g e 4 °C e descartar o supernaspeso. Resuspenda a pelota com meio de cultura e conte as células usando um hemacytómetro.
- siRNA ou transfecção plasmida
NOTA: Organoides menores com diâmetro inferior a 50 μm ou células únicas de organoides hepatocitados são transfecidos com siRNA usando lipofectamina ou plasmídeos usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.- Misture siRNA ou plasmídeos com reagente de transfecção. Adicione células únicas de organoides e a mistura Lipofectamina-RNA/Lipo-plasmid (por exemplo, RNAiMAX) em 1-2 poços na placa de 24 poços e centrífuga por 1 h a 500 x g e 32 °C. Após a centrifugação, incubar a placa na incubadora por 4-5 h a 37 °C.
- Coletar as células e sementes em matriz extracelular com meio de cultura a uma concentração de 10.000 células por poço. Altere o meio para a condição de seleção dois dias após a transfecção. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.
- Infecção lentiviral
NOTA: Pequenos organoides com diâmetro inferior a 50 μm ou células únicas de organoides hepatocitados são infectados por lentivírus usando reagentes infecções médios de acordo com as instruções do fabricante.- Misture 250 μL da suspensão unicelular do organoide e 250 μL de partículas virais em um tubo de 1,5 mL.
- Emplaque a mistura e centrífuga por 1h a 500 x g e 32 °C. Incubar por 4-5 h a 37 °C.
- Recolher as células e sementes em matriz extracelular com meio de cultura. Altere o meio para a condição de seleção dois dias após a transfecção. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.
- Engenharia genética por CRISPR/Cas9
NOTA: Fornecemos vídeo para este desempenho nos materiais suplementares. Células únicas de organoides foram infectadas com lentivírus ou transfectadas por plasmídeos portadores de sgRNA e Cas9.- Digestão de células únicas de organoides hepatocitos cultivados e passagem de acordo com o método acima.
- Infecte células individuais com sgRNA usando reagentes médios e infecciosos Opti-MEM de acordo com as instruções do fabricante.
- Misture 250 μL de uma suspensão unicelular e 250 μL de partículas virais em um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a mistura de 500 μL por 1h a 500 x g e 32 °C e, em seguida, incubar por 4-5 h a 37 °C.
- Recolher a suspensão celular e a semente em matriz extracelular. Avalie a eficiência de formação organoide após 10 dias.
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Resultados
Os organoides hepatocits do fêmea Alb-Cre; O rato Rosa26-GFP (8 semanas) foi observado cinco dias após a semeadura (Figura 1A). Os organoides estão proliferando com a coloração positiva ki67 (Figura 1B). A expressão de interferência de genes representativos em organoides hepatocitos, seja por transfecção de sirna ou infecção por lentivírus, foi examinada por qRT-PCR e mancha ocidental. Os resultados são mostrados nas Figuras 2A e
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Discussão
A capacidade de cultivar hepatócitos maduros por longos períodos é fundamental no estudo da ciência básica hepática, toxicologia medicamentosa e infecções hepatotrópicos de microbiologia hospedeira, como malária e vírus da hepatite. Com um nicho bem definido, o protocolo aqui cria um sistema de cultura para hepatócitos. Este protocolo leva hepatócitos maduros a expandir-se na cultura 3D com uma heterogeneidade que recapitula a interação célula-célula, a maioria da função hepatocita e modificações genéticas, permitindo o ...
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Divulgações
Os autores não revelam conflitos.
Agradecimentos
Agradecemos ao Professor Hans Clevers por fornecer gentilmente as linhas celulares para produzir r-spondin1 recombinantes. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Programa Nacional de P&D da China (2019YFA0111400), da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31970779) ao H.H., e do Grupo de Pesquisa Interdisciplinar e de Inovação da Juventude da Universidade de Shandong (2020QNQT003) ao H.H.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3,50 g/L |
| Glicose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9,00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4,00 g/L |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1,51 g/L |
| NaCl Sangon Bitech | A501218-0001 | 80,0 g/L | |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0,78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3,50 g/L |
| Fenol Vermelho | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0,06 g/L |
| Tampão de digestão | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0,50 M |
| Colagenase IV | Sigma | C1639 | 0,10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23,80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4,00 g/L |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1,51 g/L |
| NaCl Sangon Bitech | A501218-0001 | 80,0 g/L | |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0,78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3,50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | armazenado a 4 ° C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | armazenado a 4 & C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | armazenado a 4 &graus; C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicilina/estreptomicina | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Meio de Cultura | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Concentração de estoque 500 µ M, concentração final 2 µ M |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | armazenado a 4 > C |
| B-27 suplemento 50x, menos vitamina A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Concentração de estoque 30 mM, concentração final 3 µ M |
| DMEM / F12 | Gibco | 11330032 | armazenado a 4 & C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Concentração de estoque 100 mM, concentração final 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | armazenado a -20 ° C |
| N-acetilcisteína | Sigma Aldrich | A9165 | Concentração de estoque 500 mM, concentração final 1 mM |
| Nictinamida | Sigma Aldrich | N0636 | Concentração de estoque 1 M, concentração final 3 mM |
| Penicilina/estreptomicina | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| EGF humano recombinante | Peprotech | AF-100-15 | Concentração de estoque 100 µ g/ml, concentração final 50 ng/ml |
| Humano recombinante FGF10 | Peprotech | 100-26 | Concentração de estoque 100 µ g/ml, concentração final 100 ng/ml |
| HGF humano recombinante | Peprotech | 100-39 | Concentração de estoque 100 µ g/ml, concentração final 25 ng/ml |
| TGF-&alfa humano recombinante; | Peprotech | 100-16A | Concentração de estoque 100 µ g/ml, concentração final 100 ng/ml |
| TNF-&alfa humano recombinante; | Origene | TP750007-1000 | Concentração de estoque 100 µ g/ml, concentração final 100 ng/ml |
| Inibidor de Rho quinase Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dicloridrato | Concentração de estoque 10 mM, concentração final 10 µ |
| M Rspondin-1 meio | Linha celular estável gerada no Hu Lab. Concentração final 15%. | ||
| Outros | |||
| 0,22 µ m filtro | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # tubo de silicone | LangerPump | ||
| 24 bem, suspensão | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 ° C Banho-maria | |||
| 70 µ m filtro | BD | 352350 | |
| Accutase | célula-tronco | AT-104 | armazenada a 4 & C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Coelho |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Coelho |
| Gabinete de segurança biológica | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Solução de recuperação de células | Corning | 354253 | armazenado em 4 ° |
| C Centrífuga 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| incubadora CO2 | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | armazenado em RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | armazenado a -20 &graus; Lentivirus |
| ShanghaiGenePharmaCo. | Hdac7 | LV2020-2364 | armazenado em -80 ° C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co., Ltd. | REVG004 | Aumento da eficiência da infecção por vírus |
| Software Image Pro Plus Media | Cybernetics, Bethesda, MD, EUA | versão 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Reagente de Transfecção | Invitrogen | 13778150 | Aumento da eficiência da infecção por vírus |
| Corante de células vivas | Luna | F23001 | armazenado a 4 ° C |
| Centrífuga de mesa de baixa velocidade | TD5A-WS / TD5AWS | ||
| Nucleofactor-α 2b Dispositivo | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | armazenado em 4 °; C |
| Pipeta Pasteur | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Bomba peristáltica | LangerPump | BT100-2J | |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Ativar com metanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | armazenado a -80 ° C |
| Centrífuga refrigerada | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Concentração de estoque 10 mM, concentração final 4 µ M |
| Tripsina / EDTA | Gibico | 25200072 | armazenado a 4 ° Fornecedor |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | armazenado a -20 ° O |
Referências
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Reimpressões e permissões
