Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos
Neste artigo
Aviso de errata
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumo
Resumo
A imunidade mediada por células T desempenha um papel crucial nas respostas imunes contra tumores, com linfócitos T citotóxicos (CTLs) desempenhando o papel principal na erradicação das células cancerosas. No entanto, as origens e a reposição das células CD8+ T específicas do antígeno tumoral dentro do microambiente tumoral (TME) permanecem obscuras. Este protocolo emprega a linha celular de melanoma B16F10-OVA, que expressa de forma estável os camundongos substitutos neoantígeno, ovalbumin (OVA) e TCR transgênicos OT-I, nos quais mais de 90% das células T CD8+ reconhecem especificamente o peptídeo derivado do OVA OVA257-264 (SIINFEKL) ligado à molécula H2-K(S2-K) do complexo de histocompatibilidade (MHC) da classe I. Essas características permitem o estudo de respostas de células T específicas de antígeno durante a tumorigênese.
Combinando este modelo com a cirurgia de transplante de tumores, os tecidos tumorais de doadores foram transplantados em camundongos receptores sinénicos compatíveis com tumores para rastrear precisamente o fluxo de células imunes derivadas do receptor em tecidos transplantados, permitindo a análise das respostas imunes do CD8+ específico para o tumor e da periferia. Células T. Verificou-se uma transição dinâmica entre essas duas populações. Coletivamente, este design experimental forneceu outra abordagem para investigar com precisão as respostas imunes das células T CD8+ em TME, o que lançará uma nova luz sobre a imunologia tumoral.
Introdução
A resposta imune mediada por células T CD8+ desempenha um papel fundamental no controle do crescimento do tumor. Durante a tumorigênese, as células T CD8+ ingênuas são ativadas no reconhecimento de antígeno de forma restrita à classe I do MHC e, posteriormente, se diferenciam em células efetivas e se infiltram na massa tumoral 1,2. No entanto, dentro do microambiente tumoral (TME), exposição prolongada ao antígeno, bem como fatores imunossupressores, conduzem células CD8+ T específicas do tumor infiltradas em um estado hiporesponsivo conhecido como "exaustão"3....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos com camundongos foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Terceira Universidade Médica Militar. Use camundongos C57BL/6 de 6-8 semanas de idade e camundongos transgênicos OT-I ingênuos pesando 18-22 g. Use tanto o macho quanto o feminino sem randomização ou "cegueira".
1. Preparação de médios e reagentes
- Prepare a cultura celular média D10 como descrito anteriormente29 adicionando 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina de 100 U/mL, estreptomicina de 100 mg/mL e 2 mM de L-glutamina no Meio Águia Modificada de Dulbecc....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O esquema deste protocolo é mostrado na Figura 1. Oito dias após a inoculação do tumor, as células C57BL/6 com tumor de CD45.1+ 1+CD45,2+ foram injetadas em camundongos C57BL/6 portadores de tumor B16F10-OVA. O tumor foi dissecado cirurgicamente a partir de camundongos implantados por células OT-I CD45.1+ (doador) no dia 8 pós-transferência e transplantados em CD45.1+CD45.2+ camundongos implantados por células OT-I (receptor) .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A imunidade mediada por células T desempenha um papel crucial nas respostas imunes contra tumores, com as CTLs desempenhando o papel principal na erradicação das células cancerosas. No entanto, as origens das TCS específicas do antígeno tumor dentro da TME não foram elucidadas30. O uso deste protocolo de transplante de tumores forneceu uma pista importante de que as células T CD8+ específicas do antígeno intratumoral podem não persistir por muito tempo, apesar da existência de células T.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subsídios do National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) e da National Natural Science Foundation of China (No. 31900643 para QH, No. 31900656 à ZW).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m filtro | Millipore | SLGPR33RB | |
| seringa de tuberculina de 1 mL | KDL | BB000925 | |
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U | BD Biosciences | 320310 | |
| Tubo cônico de 15 mL | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Metil-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μ filtro de células de nylon m | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone: linha celular A20 |
| B16F10-OVA | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (albumina de soro bovino) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone: 104 |
| placa | de cultura de célulasCentrífuga BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| Eppendorf | 5810R-A462/5424R | ||
| ciclofosfamida | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ Kit de Isolamento de Células T | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Tubos Sigma | EDS-500g | |
| FACS | BD Falcon | 352052 | |
| soro bovino fetal | Gibco | 10270-106 | |
| citômetro de fluxo | BD | FACSCanto II | |
| hemocitômetro | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurano | RWD ciências da vida | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Near-IR Fixável, para excitação de 633 ou 635 nm Portador | Life Technologies | L10199 | |
| RWD Life Science | F31034-14 | ||
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldeído | Beyotime | P0099-500ml | |
| anti-mouse em PE TCR Vα 2 | BioLegend | 127808 | Clone: B20.1 |
| Caneta Strep Glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP / Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone: 53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| azida sódica | Sigma | S2002 | |
| pinça cirúrgica | RWD Life Science | F12005-10 | |
| tesoura cirúrgica | RWD Life Science | S12003-09 | |
| fio de sutura | RWD Life Science | F34004-30 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referências
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
