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Todos os experimentos utilizando hPSCs foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, e foram realizados em uma capa de biossegurança classe II com equipamentos de proteção individual adequados. Todos os reagentes são de grau de cultura celular, a menos que seja dito o contrário. Todas as culturas são incubadas a 37 °C, 5% de atmosfera de ar CO2 . Em todas as etapas do ensaio, corpos embrionários ou organoides renais podem ser coletados e fixados ou preparados para análise. As linhas hPSC utilizadas para gerar esses dados foram totalmente caracterizadas e publicadas18.
1. Preparando placas de cultura
NOTA: Aproximadamente 1 h antes de dividir hPSCs, casaco 2 x 100 mm placas de cultura tecidual com um extrato de matriz de membrana de porão qualificado por célula-tronco (BME). Pode-se pré-revestir as placas, selá-las com um filme de parafina e armazenar a 4 °C de acordo com as instruções dos fabricantes.
- Prepare placas tratadas com cultura de tecido de 2 x 100 mm (1 para ensaio organoide renal, 1 para manter a linha celular) e um tubo cônico de 15 mL na capa de biossegurança classe II.
- Aliquot 8 mL de frio, sem soro Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) em um tubo cônico de 15 mL e ~4 mL em cada uma das placas de 100 mm, o suficiente para cobrir o fundo de cada placa com meio.
- Tire uma alíquota de 100 μL de BME do congelador (-20 °C). Usando uma pipeta sorológica de 2 mL, pegue ~1 mL de DMEM frio do tubo cônico de 15 mL. Descongele lentamente a alíquota do BME, encanar suavemente para cima e para baixo com o DMEM frio, evitando fazer bolhas.
NOTA: Não deixe que a alíquota BME fique em temperatura ambiente. Use imediatamente.
- Transfira o DMEM/BME descongelado de volta para o tubo cônico de 15 mL com o DMEM restante. Com uma pipeta sorológica de 10 mL, misture suavemente o BME diluído por pipetar para cima e para baixo pelo menos 8 vezes para dispersar uniformemente o BME, evitando fazer bolhas.
- Transfira 4 mL do BME diluído em cada placa com DMEM e gire suavemente a placa para que o BME seja distribuído uniformemente. Incubar a placa revestida por 1h em temperatura ambiente ou 30 min a 37 °C.
NOTA: Use 50 μL de BME por placa de 100 mm. O uso de outras mídias de cultura hPSC e linhas de células pode exigir diferentes concentrações de BME.
2. Passaging hPSCs
NOTA: Para a cultura de rotina do HPSC, as linhas de células de passagem a 70-80% de confluência.
- Aspire o meio de cultura da placa hPSC a ser passagem. Adicione ~ 8 mL da solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco à placa hPSC e gire suavemente para lavar as células.
- Aspire DBPS e adicione 2 mL de reagente de dissociação de células suaves (GCDR) à placa de 100 mm, gota por gota em cima para cobrir as células.
NOTA: Outros reagentes de dissociação também podem ser usados. Ajuste de acordo.
- Incubar à temperatura ambiente por ~6-8 min até que as colônias estejam se rompendo e as células estejam refrativas sob contraste de fase (Figura 2A).
NOTA: O tempo pode variar entre as linhas de celular. Ajuste de acordo.
- Durante a incubação, prepare um tubo cônico de 50 mL. Adicione 16 mL de meio hPSC (8 mL por placa de 100 mm) e adicione o inibidor de quinase associado a Rho (ROCKi) a uma concentração final de 5 μM.
- Aspire DMEM das placas revestidas de BME e adicione 8 mL de hPSC médio mais ROCKi a cada placa.
- Quando as células estiverem prontas (como descrito no ponto 2.3, Figura 2A), aspire o GCDR e incline a placa ~45° em direção ao experimentador e raspe as células com um levantador de células.
NOTA: Se as células estiverem se desartching, omitir gcdr aspirando e proceder.
- Gire a placa ~90° e raspe novamente para levantar as células restantes. Mantenha a placa ~45° e lave as células para baixo com 3 mL de meio hPSC usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
- Pipeta suavemente para cima e para baixo para quebrar grandes aglomerados (não mais do que 2-3 vezes) e semear as células na razão apropriada para a linha de interesse celular nas placas preparadas. Coloque a placa com as células da incubadora e mova a placa suavemente em 8 movimentos para distribuir as células uniformemente.
NOTA: Neste experimento as linhas hPSC foram divididas a uma proporção de 1:5, isso pode variar para outras linhas e condições celulares. Deixe o prato imperturbável durante a noite.
- Depois de ~ 24 h, examine as células para fixação. Procure por pequenas colônias individuais anexadas. Aspire o médio gasto e reponha com 8 mL de meio hPSC fresco (sem adicionado ROCKi).
- Continue observando e se alimentando diariamente até que as células atinjam ~60% de confluência para iniciar o ensaio organoide renal (geralmente chega de 48 a 72h após a passagem). As colônias serão, idealmente, discretas e não se fundindo (Figura 2B).
NOTA: É muito importante limitar as células a não mais do que 80% de confluência para manter seu estado de pluripotência. Culturas confluentes, manuseio áspero ou passagens mais altas podem levar a diferenciação espontânea indesejada ou baixa eficiência da formação organoide renal.
3. Dia 0 - Configuração do ensaio organoide renal
- Antes de começar, prepare tanto a mídia E5-ILP quanto a Fase II conforme formulações (Tabela 1 e Tabela 2).
NOTA: A mídia pode ser armazenada por até 14 dias a 4 °C.
- Para um ensaio organoide renal (uma placa de cultura de 100 mm é necessária para uma placa de 6 poços), prepare o meio E5-ILP completo em um tubo cônico de 50 mL: 18 mL de E5-ILP suplementado com 8 μ CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-mercaptoetanol (32,7 μL).
- Coloque 2 mL de meio E5-ILP completo em cada poço de uma placa de fixação ultra-baixa de 6 poços.
- Lave os hPSCs a ~60 % de confluência (Figura 2B) duas vezes com ~ 8 mL de DPBS. Em seguida, adicione 2 mL de dispase por placa de 100 mm, solte a gota para cobrir as células e incubar por 6 min a 37 °C.
NOTA: Depois de 6 minutos, as bordas das colônias começarão a se enrolar (Figura 2C, setas vermelhas) enquanto o resto da colônia permanece presa. Se isso não for obtido após 6 minutos, coloque as células de volta na incubadora para mais 30 s. Outras mídias e matriz hPSC podem não ser compatíveis com este tempo. O revestimento BME à base de laminina não é compatível com a despase. Se a BME baseada em laminina for a matriz hPSC padrão, cubra uma das placas da seção 1 com a BME descrita neste método a ser utilizado para o ensaio organoide renal.
- Lave células 3x com ~10 mL de DPBS. Aspirar DPBS, em seguida, inclinar a placa ~45° e raspar para baixo com um levantador de células.
NOTA: A desapase não está desativada, portanto, precisa ser lavada completamente. Não reduza o número de lavagens.
- Lave as colônias do topo com 6 mL de meio E5-ILP completo usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Pipeta para cima e para baixo suavemente para quebrar quaisquer colônias grandes (2 ou 3 vezes geralmente é suficiente).
- Distribua os aglomerados da colônia uniformemente adicionando 1 mL por poço na placa de 6 poços. Coloque a placa em um agitador orbital (configurações: orbital = 30, recíproca = 330°, vibração = 5° - 2 s) que é colocada na incubadora de 37 °C (Figura 2D).
NOTA: O recurso de vibração é importante para a distribuição adequada dos organoides e para evitar o agrupamento.
4. Dia 2 - Alimentação por meio-médio
NOTA: Dentro das 48 horas, aglomerados de colônias formarão corpos embrionários.
- Prepare o meio completo: Para uma placa de 6 poços prepare 12 mL de meio E5-ILP + 8 μM CHIR99021 em um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Beta-mercaptoethanol e ROCKi não são necessários.
- Deixe os corpos embrionários se acomodarem na parte inferior da placa, incline a placa ~45° e depois aspire o meio lentamente a partir da parte superior, deixe ~1 mL por poço.
NOTA: Corpos embrióides nesta fase se aglomeram rapidamente. Não deixe que eles se contentem com > 5 min.
- Adicione 2 mL de meio completo preparado (seção 4.1) por poço. Devolva a placa de volta ao agitador.
5. Dia 3 - Transferência de corpos embrionários para o estágio II médio
- Prepare um tubo cônico de 50 mL e DMEM (baixa glicose). Deixe os corpos embrionários se estabelecerem no fundo da placa. Incline a placa ~45° e aspire o meio de cima lentamente, deixe ~1 mL por poço.
- Colete todos os corpos embrióides cuidadosamente de cada poço usando uma pipeta sorológica de 10 mL e transfira-os para o tubo cônico de 50 mL.
- Lave cada poço para coletar quaisquer corpos embrióides restantes com ~ 1 mL de DMEM (baixa glicose) e adicione-os ao mesmo tubo cônico de 50 mL.
- Deixe os corpos embrionários se acomodarem no fundo do tubo, ~5 min. Enquanto estiver esperando, adicione 2 mL de meio estágio II a cada poço da placa de 6 poços. Seive grandes corpos embrióides (>300 μm) usando um coador de células de 200 μm (Figura 2E).
- Use um novo tubo cônico de 50 mL e coloque o coador de células de 200 μm em cima. Pipeta todos os corpos embrionários usando uma pipeta sorológica de 10 mL cuidadosamente sobre o coador celular.
- Enxágüe o coador celular com um adicional de ~5 mL de DMEM (baixa glicose) para coletar quaisquer corpos embrionários presos no coador celular. Permita que os corpos embrionários se acomodem no fundo do tubo cônico.
- Quando os corpos embrionários estiverem assentados, aspire o supernasciente e lave com ~10 mL de DMEM (baixa glicose).
- Aspirar DMEM e suspender de re suspendida os corpos embrionários em 6 mL do meio estágio II.
- Transfira os corpos embrionários de volta para a placa de fixação 6 bem ultra-baixa, distribuindo-os uniformemente entre os 6 poços.
- Realizar meia alteração média, conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.3 a cada dois dias.
NOTA: A partir do dia 3, os corpos embrionários terão uma aparência 'dourada' e lisa e esférica (Figura 2F). A partir do 6º dia, a formação de túbulos em corpos embrióides individuais se tornará aparente, com números crescentes nos dias seguintes atingindo números ideais e crescimento até o dia 14 (Figura 2G,H). Para eliminar a formação de aglomerados ocasionais, ao observar visualmente os organoides renais, ou corpos embrionários muito pequenos sem túbulos, peneirar os <200 e grandes organoides de > 500 μm com uma célula de 500 e 200 μm de coador, conforme descrito nas etapas 5.4.1 e 5.4.2.
6. Transferir para frasco de rotador e alimentação
NOTA: Um frasco rotador pode ser usado a qualquer momento a partir do dia 3 para experimentos que requerem um grande número de organoides. A transferência de rotina de organoides acontece em nosso laboratório entre os dias 6 e 8. Consulte a seção Discussão para obter alternativas se o equipamento não estiver disponível.
- Transfira corpos embrionários em um frasco rotador de 125 mL com 45 mL de meio estágio II. Defina a velocidade do agitador magnético a 120 rpm e coloque na incubadora (Figura 2I).
- Para alimentar corpos embrionários ou organoides renais, deixe os organoides renais se estabelecerem brevemente no fundo do frasco rotador. Levante a tampa de um braço lateral do frasco e coloque a pipeta aspirante dentro, com a ponta tocando o oposto dentro da parede.
- Angule lentamente a pipeta aspirada para baixo e aspire aproximadamente metade do meio. Reabasteca com 20 mL de meio fresco estágio II, tubulando-o através da mesma abertura.
7. Configuração de placa de agitação magnética de 6 poços (6MSP)
NOTA: O formato 6MSP pode ser usado no lugar de frascos rotadores se várias condições precisarem ser testadas. Use o 6MSP para tratamentos compostos ou nefrotoxinas. Isso economiza a quantidade de meio utilizado no segundo estágio, mantendo a disponibilidade de nutrientes através da difusão.
- Limpe as barras de agitação magnética oval em um tubo cônico de 50 mL lavando em uma cultura de tecido detergente adequado brevemente (se nunca usado) ou de molho por > 1 h, se usado anteriormente.
- Lave brevemente 3x em DPBS estéreis.
- Lave 1x por 5 min em 70% de etanol, 1x em DPBS estéreis.
- Enxágüe com solução anti-adesão e lave 1x em DPBS estérei e aspire.
- Com cuidado, usando fórceps longos estéreis coloque uma barra de agitação magnética em cada poço da placa de 6 poços com corpos embrionários ou organoides renais.
- Coloque a placa sobre o 6MSP e defina a velocidade para 120 rpm (Figura 2J). Manter organoides renais com meio meio de alteração conforme seção 4.2 e 4.3.
NOTA: Para que as barras de agitação magnética se posicionem e comecem a girar, talvez seja necessário primeiro colocar o nível de potência para 100 brevemente, então uma vez que todos estejam girando, abaixem o nível de energia para 25.