Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Resumo

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Resumo

O câncer de fígado é atualmente a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, e o carcinoma hepatocelular (CHC) é responsável por 75-90% de todos os casos de câncer de fígado. Com a introdução de tratamentos eficazes para prevenir e tratar a hepatite B / C, a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e a forma mais agressiva conhecida como esteato-hepatite não alcoólica (NASH), estão rapidamente se tornando os fatores de risco número um para desenvolver CHC nas sociedades modernas. Para entender melhor o papel que a NASH tem no desenvolvimento do HCC, projetamos um peixe-zebra HCC associado ao NASH. A clareza óptica e a tratabilidade genética das larvas de peixe-zebra as tornam um modelo atraente e poderoso para estudar o microambiente hepático e a composição das células imunes usando imagens vivas fluorescentes não invasivas. Este protocolo descreve como usar um modelo de peixe-zebra HCC associado à NASH para investigar o efeito do excesso de colesterol no microambiente hepático e seu impacto na composição de células imunes nos estágios iniciais da doença. Primeiro, alimentamos larvas de CHC (s704Tg), que expressam beta-catenina ativada específica para hepatócitos, com uma dieta de colesterol alto a 10% por 8 dias para desenvolver um modelo de CHC associado à NASH. Aqui descrevemos como fazer uso de diferentes linhagens transgênicas para avaliar várias características malignas precoces no fígado por microscopia confocal não invasiva, como área hepática, célula e morfologia nuclear (área de hepatócitos, área nuclear, relação nuclear:citoplasmática (relação N:C), circularidade nuclear, pontuação de micronúcleos/hérnia nuclear) e angiogênese. Em seguida, usando linhas transgênicas com células imunes marcadas (neutrófilos, macrófagos e células T), mostramos como analisar a composição das células imunes do fígado em larvas de CHC associadas à NASH. As técnicas descritas são úteis para avaliar o microambiente hepático e a composição das células imunes nos estágios iniciais da hepatocarcinogênese, mas também podem ser modificadas para estudar tais características em outros modelos de doença hepática.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um câncer agressivo com opções terapêuticas limitadas. Verificou-se que mais de 30% de todos os pacientes com CHC são obesos e apresentam EHNA, uma forma agressiva de^DHGNA 1,2,3,4. O consumo de dietas ricas em calorias aumenta drasticamente a disponibilidade de ácidos graxos que causam mudanças metabólicas locais e sistêmicas e desencadeiam esteatose, lesão de hepatócitos, inflamação e fibrose - todas as principais características da NASH. A progressão da NASH para CHC envolve o acúmulo de lipídios no fígado, o que desencadeia inflamação e alteração da composição das células imunes ^5,6,7. É de particular interesse e importância entender como o microambiente hepático e a paisagem das células imunes são alterados durante a progressão da doença hepática e como ela muda devido a certos fatores etiológicos. Para identificar melhor o impacto que o excesso de colesterol tem no microambiente hepático e na paisagem das células imunes, desenvolvemos um modelo único de peixe-zebra de CHC associado à NASH. O uso deste modelo nos deu uma melhor compreensão do impacto da dieta e da supernutrição no microambiente hepático e na progressão da doença hepática.

Modelos de mamíferos, como camundongos e amostras de tecido humano, têm sido essenciais para a compreensão da patogênese da esteato-hepatite e esteatose⁸. Os ratos são o modelo preferido para doenças hepáticas e câncer, mas eles não têm clareza óptica em nível celular, enquanto as amostras de tecido humano muitas vezes não têm o ambiente 3D que os modelos animais são capazes de imitar. Esses obstáculos fizeram do peixe-zebra um modelo poderoso na comunidade de pesquisa. O peixe-zebra tem semelhanças notáveis com os seres humanos, com pelo menos 70% de conservação genética. Mantêm o microambiente hepático, a composição celular hepática, a função, a sinalização e a resposta às lesões ^9,10. Usando uma dieta rica em colesterol (HCD) em combinação com um modelo estabelecido de CHC de peixe-zebra transgênico, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de CHC associado à NASH.

Aqui apresentamos um protocolo explicando como gerar um modelo de peixe-zebra HCC associado à NASH e como estudar o microambiente hepático e abordar as características malignas precoces in vivo. Usando microscopia confocal não invasiva em combinação com linhagens transgênicas de peixe-zebra com membrana e núcleo de hepatócitos marcados fluorescentemente, podemos abordar as características de malignidade precoce analisando a morfologia hepática (área, volume e área de superfície), morfologia celular e nuclear (área de hepatócitos, área nuclear, relação N:C, circularidade nuclear, pontuação de micronúcleos/hérnia nuclear) e angiogênese (densidade dos vasos). O microambiente de células imunes também é uma característica importante na hepatocarcinogênese ^11,12,13,14, portanto, também mostramos como analisar a composição de células imunes hepáticas em larvas de CHC associadas à NASH, usando linhagens transgênicas de zebrafish com células imunes marcadas (neutrófilos^, macrófagos e células T). As técnicas descritas são exclusivas do modelo e extremamente úteis para avaliar o microambiente hepático e a composição das células imunes na progressão da doença hepática.

Protocolo

Os estudos em animais são realizados seguindo procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina Albert Einstein. Para receitas de buffers e soluções utilizadas no protocolo, consulte o Quadro Suplementar 1.

1. Preparação de dieta enriquecida com colesterol a 10% para o excedente agudo de colesterol.

1. Pese 2 x 4 g de Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) em dois copos de vidro de 25 mL - um para a Dieta Normal (ND) e o outro para a Dieta de Colesterol Alto (HCD) de 10%.
   NOTA: Qualquer dieta comercial de alimentos secos para larvas de peixe-zebra pode ser usada.
2. Pesar 0,4 g de colesterol em um copo de vidro de 10 mL. Cubra o copo com um pouco de papel alumínio.
3. Meça 5 mL de éter dietílico usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G. Em seguida, adicione o éter dietílico ao copo ND e misture-o imediatamente com o alimento seco usando uma espátula.
   CUIDADO: Éter dietílico causa irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Use apenas em um exaustor químico.
4. Meça novamente 5 mL de Éter Dietílico usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G e adicione-a ao copo de 10 mL com Colesterol, misture imediatamente aspirando para cima e para baixo com a seringa.
5. Adicione rapidamente a solução de colesterol ao copo de HCD e misture-a imediatamente com uma espátula até que a solução esteja uniforme.
6. Deixe os copos no exaustor por até 24 h para evaporar completamente o Éter Dietílico. No dia seguinte, moa as dietas GPAS em partículas finas usando um pilão e argamassa.
   NOTA: Moer as dietas é um passo crucial, as larvas não serão capazes de comer partículas maiores que 50 nm.
7. Transfira cada dieta para um pequeno saco plástico rotulado ou para um tubo de centrífuga de 50 mL e armazene a -20 °C.

2. Indução de NASH com larvas de curto prazo alimentadas com dieta enriquecida com colesterol - condições estáticas.

1. Montar linhas de peixes transgênicos no Dia -1 (Tabela 1). Na manhã seguinte (Dia 0), após a desova dos peixes, colete os ovos em um coador de malha.
2. Usando um frasco de lavagem com água embrionária (E3), enxágue bem os ovos e transfira cuidadosamente os ovos para uma placa de Petri de 10 cm com meio E3.
3. Limpe as placas de todos os detritos que possam ter se acumulado nas caixas de reprodução, incluindo quaisquer ovos mortos ou não fertilizados.
   NOTA: Enxaguar os ovos e limpar as placas é crucial para evitar o crescimento descontrolado de microrganismos e consequentes defeitos no desenvolvimento das larvas.
4. Divida os ovos em uma densidade de 70/80 por placa de Petri de 10 cm (em 25 mL de E3). No Dia 1, sob um escopo de dissecação equipado com uma base de transiluminação, verifique e limpe embriões mortos ou embriões com defeitos de desenvolvimento.
   NOTA: Use o modo de campo escuro de base de transiluminação para identificar embriões com efeitos de desenvolvimento e para verificar o crescimento de microrganismos nas placas. Diferentes instalações têm diferentes rendimentos de microrganismos em seus sistemas. Troque o meio E3 e/ou pratos, se necessário, para evitar efeitos negativos.
5. No Dia 5, misture larvas de todos os pratos em uma placa de Petri de 15 cm, adicione E3 sem azul de metileno. Em seguida, divida as larvas nas caixas de alimentação da seguinte forma (Tabela 2).
   NOTA: Em condições de controle, para gerar larvas saudáveis sem desencadear inflamação crônica sistêmica, as larvas devem ser alimentadas com cerca de 0,1 mg de alimento por larva por dia. Observe que a quantidade total de alimentos (Tabela 2) é dividida igualmente em duas mamadas por dia.
6. Mantenha as larvas em uma incubadora a 28 °C, em um ciclo de luz escura (por exemplo, ciclo de 14 h claro/10 h escuro) e alimente as larvas duas vezes ao dia do dia 5 ao dia 12.
7. Aspirar diariamente quaisquer detritos alimentares, bem como 90-95% do meio usando um sistema de vácuo ligado a uma ponta de pipeta de 1 mL. Em seguida, despeje cuidadosamente o novo E3 sem azul de metileno em um canto da caixa de alimentação para evitar danificar as larvas.
   NOTA: A limpeza diária das caixas de alimentação é crucial para evitar o crescimento descontrolado de microrganismos.

3. Coleta de larvas pós-fertilização de 13 dias das caixas de alimentação.

1. No dia 13, prepare os pratos de coleta de acordo com o número de condições experimentais que foram estabelecidas. Com uma caneta de marcador permanente faça uma marca na lateral dos pratos (tampa e fundo) para evitar a troca de amostras, por exemplo, uma faixa preta para dieta normal (ND) e duas listras pretas para HCD.
2. Despeje E3 suficiente sem azul de metileno para cobrir o fundo de cada prato. Usando cuidadosamente o sistema de vácuo, aspirar a água das caixas de alimentação, tente aspirar quaisquer detritos ou larvas mortas do fundo para evitar a transferência desses materiais para os pratos de coleta.
3. Quando o nível da água começar a ficar baixo, levante lentamente a caixa de alimentação para fazer as larvas nadarem para um dos cantos e, em seguida, aspirar na direção oposta.
   NOTA: Use pipeta de 1 mL com pontas de corte, em diferentes alturas, para permitir diâmetros diferentes ao aspirar a água. Alterne entre os diferentes tamanhos, comece com um diâmetro maior e mude para um menor à medida que o volume de água diminui e a densidade das larvas aumenta.
4. Uma vez que haja apenas cerca de 20-30 mL de líquido, cuidadosamente decante larvas na placa de Petri de coleção preparada na Etapa 1. Coloque a fita etiquetada da caixa de alimentação na tampa do prato.
5. Repita os passos 3.2-3.4 para todas as caixas de alimentação.

4. Ensaio de controle para esteatose hepática induzida por dieta - coloração de óleo vermelho O (ORO), imagem e pontuação.

1. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira 15-20 larvas para um tubo de fundo redondo de 2 mL e coloque no gelo por cerca de 15-30 min. Remova a maior parte da mídia do tubo.
2. Adicionar 2 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar larvas e incubar a 4 °C durante a noite.
3. Na manhã seguinte, retire a solução de PFA a 4% e lave as larvas três vezes com 2 mL de PBS 1x.
4. Prepare uma placa de 12 poços (Figura 2A) por condição com uma inserção de poço de malha.
5. Usando uma pipeta de vidro, transfira a larva do tubo de 2 mL para a inserção previamente colocada no poço, adicione 5 mL de 1x PBS. Salve os tubos de 2 mL para armazenamento de amostras após a coloração.
   CUIDADO: As larvas são extremamente pegajosas nesta fase, não use pipetas de plástico.
6. Transfira a inserção com larvas para outro poço com 5 mL de solução de isopropanol a 60%. Incubar larvas por 30 min de temperatura ambiente (RT).
7. Enquanto isso, prepare um óleo vermelho A 0,3% em solução de isopropanol a 60%. Filtrar a solução a 0,3% de Óleo Vermelho duas vezes utilizando um filtro de seringa a 0,45 μm.
   NOTA: Preparar 5 ml de solução por poço misturando 3 ml de Óleo Vermelho O a 0,5% em Isopropanol com 2 ml de água destilada. O 0,3% Oil Red O em solução de Isopropanol a 60% precisa ser preparado na hora.
8. Em seguida, transfira a inserção de malha com larvas para outro poço com 5 mL de óleo vermelho a 0,3% feito na hora em solução de isopropanol a 60%. Larvas incubadas por 3 h no RT com balanço suave.
9. Após a coloração ORO, enxaguar as larvas transferindo a inserção para outro poço com 60% de isopropanol. Lave as larvas duas vezes em 60% de Isopropanol por 30 min de cada vez, transferindo a inserção sequencialmente para poços com 60% de Isopropanol.
10. Lave as larvas três vezes por 5 min em 1x PBS-0,1% Tween transferindo a inserção sequencialmente para poços com 1x PBS-0,1% Tween.
11. Transfira as larvas para os tubos de 2 mL. Retire o PBST, adicione 1 mL de glicerol a 80% e guarde a 4 °C até à obtenção de imagens.
12. Para uma melhor imagem, transfira larvas para 1x PBS-0,1% Tween e, sob um escopo de dissecção, disseque os fígados puxando cuidadosamente os tecidos usando duas pinças #55.
    NOTA: Se estiver usando uma imagem de fundo Casper pode ser realizada usando as larvas inteiras.
13. Usando uma pipeta de vidro, transfira cuidadosamente os fígados para um poço de uma placa de porcelana com 50% de glicerol. Posicione os fígados usando uma pequena ferramenta para manipular larvas (por exemplo, ferramenta de cílios - Figura 2B). Imagem de fígados em um estereomicroscópio equipado com uma câmera colorida.
14. Escore de esteatose hepática (sem coloração ORO = nenhuma; coloração ORO vermelha clara = leve; coloração ORO vermelho-escuro = moderada/grave).

5. Imagem confocal não invasiva usando o Dispositivo de Enrolamento e Aprisionamento de Peixe-zebra para Crescimento e Imagem (zWEDGI).

1. Prepare uma placa de Petri de 10 cm com 15-20 mL de 1x Tricaína-E3, apenas o suficiente para cobrir o fundo.
   NOTA: Uma solução de trabalho de Tricaína-E3 1x (0,16 mg/mL) pode ser obtida diluindo 2 mL de uma solução-mãe de Tricaína 25x (4 mg/mL) em 48 mL de E3. A concentração de tricaína não deve exceder 0,16 mg/mL, uma vez que as larvas são extremamente sensíveis à anestesia neste estágio de desenvolvimento.
2. Transfira 15-20 larvas com uma pipeta plástica Pasteur para a placa de Petri contendo 1x Tricaína-E3 e anestesiar larvas por 5 min.
3. Prepare uma placa de 6 poços com 2-3 mL de E3 sem azul de metileno por poço.
4. Em um estereomicroscópio fluorescente, triagem das larvas anestesiadas para marcadores fluorescentes desejados (Tabela 1). Transfira larvas peneiradas na quantidade mínima de Tricaína em E3 e deixe-as se recuperar na placa de 6 poços até a hora da imagem.
   NOTA: O rastreamento de larvas transgênicas duplas, triplas e quádruplas leva tempo, coloca larvas em E3 e muda o meio da placa de 6 poços com frequência para diminuir a exposição desnecessária à tricaína. Além disso, as larvas neste estágio de desenvolvimento flutuam, portanto, use uma ferramenta de cílios para posicionar as larvas para triagem sem induzir danos nos tecidos.
5. Após a triagem, prepare uma placa de Petri de 10 cm com 25 mL de 1x Tricaína-E3. Transfira 15-20 larvas com uma pipeta de plástico Pasteur para a placa de Petri contendo 1x Tricaína-E3 e anestesiar larvas por 5 min.
6. Enquanto isso, sob o estereomicroscópio, adicionar 1x Tricaína-E3 nas câmaras do dispositivo de ferimento e aprisionamento (por exemplo, zWEDGI)^15,16. Remova as bolhas de ar das câmaras e do túnel de retenção usando uma micropipeta P200. Remova todo o excesso de 1x Tricaína-E3 deixando apenas volume suficiente para encher as câmaras.
7. Transfira uma larva anestesiada para a câmara de carga do zWEDGI e posicione-a usando uma ferramenta de cílios sob o estereomicroscópio. Suavemente, bata na cabeça das larvas e empurre-a para que a cauda entre no túnel de retenção. Além disso, usando a micropipeta remover 1x Tricaína-E3 da câmara de ferimento para ajudar a larva a entrar no túnel. Certifique-se de que a larva esteja posicionada adequadamente para a imagem do lobo esquerdo - Microscópio Invertido: lado esquerdo voltado para baixo; Microscópio vertical: lado esquerdo voltado para cima.
   NOTA: Se um zWEDGI não estiver disponível, o peixe pode ser montado e posicionado em 1% de agarose de baixo ponto de fusão em 1x Tricaína-E3, no entanto, a imersão em agarose pode ser usada apenas para imagens rápidas (até 15 min).
8. Para análise de hepatócitos e morfologia nuclear, imagens de fígados com microscópio confocal utilizando uma objetiva de ar de 40x e pilhas z de seções ópticas de 2 μm. Para a morfologia hepática, angiogênese e ensaios de recrutamento de células imunes imagens de fígados usando um objetivo de ar 20x e z-stacks de seções ópticas de 5 μm. Para larvas com fígados grandes, 2 x 2 imagens de telha devem ser tomadas para garantir a imagem de todo o fígado e área circundante de 75 μm.
9. Após a imagem, use uma pipeta Pasteur de plástico com 1x Tricaína-E3 para puxar a larva do túnel de retenção e transferir para uma placa de Petri com E3 sem azul de metileno.

6. Análise das variações morfológicas hepáticas.

NOTA: As etapas listadas abaixo são realizadas para a área de superfície do fígado e quantificação de volume:

1. Abra o software de imagem. Adicione a pasta contendo arquivos de imagem a serem analisados à Arena, selecionando o ícone Observar pasta. Em seguida, clicando com o botão direito do mouse nas miniaturas, selecione Converter para o formato de arquivo nativo Imaris para converter arquivos no formato (.ims).
2. No submenu Superar, ajuste o brilho e o contraste de cada canal. Em seguida, crie uma superfície a partir do fígado clicando no botão azul Adicionar novas superfícies .
3. Em seguida, no painel de criação de superfície, selecione Segmentar apenas uma região de interesse para criar manualmente uma superfície do fígado.
4. Clique em Ignorar | de criação automática Opção Editar manualmente . Selecione Contorno e desmarque a opção "Volume" no painel de cena.
   NOTA: A opção de visualização de volume precisa ser desmarcada, caso contrário, a seleção da região de interesse em diferentes z-stacks não será possível.
5. Navegue pelas pilhas z e desenhe a região de interesse em cada plano selecionando Modo, escolha o modo de desenho que preferir. Para começar a desenhar o ponteiro de mudança para o modo Selecionar e não Navegar, clique em Desenhar e comece a arrastar o ponteiro pelo fígado para desenhar um ROI.
6. Depois de selecionar um ROI nos diferentes planos focais, selecione Criar uma superfície para mesclar todos os ROIs selecionados e criar a superfície do fígado.
7. Em seguida, usando a superfície recém-criada, crie uma máscara do sinal dos hepatócitos. Clique na superfície e, na guia Editar (o lápis), escolha Mascarar tudo. Na janela que aparece, escolha o canal que você deseja mascarar que será usado para quantificar o volume e a área de superfície do fígado. Em seguida, escolha definir voxels fora da superfície como 0 e marque a opção Canal duplicado antes de aplicar a máscara.
8. Use a área de superfície do fígado e os valores de volume hepático do menu de análise estatística para análise.

NOTA: Execute as seguintes etapas para quantificação da área do fígado.

9. Abra o software Fiji. No menu Plug-ins, selecione Bio-formats seguido por Bio-formats Importer, marque a opção Split channels para abrir o arquivo de imagem.
10. No menu Imagem, selecione Propriedades para verificar se a imagem tem o tamanho de pixel e a profundidade de voxel corretos, se não os valores corretos. Em seguida, vá para o Menu de Imagens, clique em Ajustar seguido de Brilho e Contraste, ajuste o brilho e o contraste da imagem.
11. Em seguida, o uso do canal de hepatócitos cria uma projeção de intensidade máxima do fígado. Vá para o Menu de Imagens, clique em Pilhas seguido por Projeto Z. Selecione Projeção de Intensidade Máxima.
12. Usando a ferramenta de seleção à mão livre, crie manualmente uma região de interessados (ROI) em torno do fígado larval. Em seguida, no menu Analisar , clique em Medir para obter a área do fígado. Salve os resultados como planilha para análise posterior.

7. Hepatócitos e análise morfológica nuclear.

1. Abra o software Fiji. No menu Plug-ins, selecione Bio-formats seguido de Bio-formats Importer tick na opção Split channels para abrir o arquivo de imagem.
2. No menu Imagem, selecione Propriedades para verificar se a imagem tem o tamanho de pixel e a profundidade de voxel corretos, se não os valores corretos. Em seguida, vá para o menu Imagens, clique em Ajustar seguido de Brilho e Contraste, ajuste o brilho e o contraste da imagem.
3. No menu Analisar , selecione Definir medidas em todos os parâmetros que você deseja analisar (por exemplo, descritores de área, perímetro e forma). Selecione o canal fluorescente da membrana dos hepatócitos. Navegando por Z, use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar o ROI perfeito em torno de um hepatócito. Em seguida, no menu Analisar , clique em Medir para calcular a área dos hepatócitos.
4. Repita o passo 7.3 para 15-30 hepatócitos. Salve os resultados como planilha para análise posterior.
5. Em seguida, selecione o canal fluorescente do núcleo. Navegando por Z, use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar o ROI perfeito em torno do núcleo do hepatócito. Em seguida, no menu Analisar , clique em Medir para calcular a área nuclear e a circularidade.
6. Repita o passo 7.5 para 15-30 hepatócitos. Salve os resultados como uma planilha para análise posterior, incluindo a quantificação da relação nuclear:citoplasmática.
7. Amostras de escore para presença de micronúcleos e hérnia a seguir (Tabela 3).

8. Análise da angiogênese.

1. Criar manualmente uma superfície para o fígado, conforme descrito na secção 6 do presente protocolo. Nomeie esta superfície como "Superfície do fígado".
2. Crie uma máscara para o sinal das células endoteliais dentro do fígado. Clique na superfície e, na guia de edição (o lápis), escolha Mascarar tudo. Na janela que aparece, escolha o canal das células endoteliais para isolar os sinais dos vasos apenas do fígado. Escolha definir voxels fora da superfície como 0 e marque a opção Canal duplicado antes de aplicar Máscara.
3. Renomeie novas células endoteliais mascaradas como Vasculatura do fígado.
4. Para medir o volume do vaso e a área de superfície, crie uma segunda superfície. Clique no botão azul Adicionar novas superfícies . Na primeira etapa da criação da superfície, verifique se todas as opções estão desmarcadas para criar automaticamente uma superfície.
5. Na segunda etapa, escolha o canal de vasculatura do fígado para criar uma superfície. Desmarque a opção de suavização para detectar o maior número possível de detalhes das embarcações e habilitar a subtração em segundo plano na opção de nivelamento.
6. Ajuste o limiar garantindo que a superfície detectada esteja colocalizando com o sinal de vasculatura hepática. Use valores de área de superfície e volume no menu de análise estatística. Calcule o índice de densidade do vaso usando as seguintes equações:
   Índice de densidade dos vasos (por μm 2 do fígado) = (Área de superfície do vaso (μm 2)) / (Área de superfície do fígado (μm²))
   Índice de densidade do vaso (por μm 3 do fígado) = (Volume do vaso (μm 3)) / (Volume do fígado (μm³))

9. Análise de recrutamento de células imunes.

1. Abra o software Fiji. No menu Plug-ins, selecione Bio-formats seguido de Bio-formats Importer tick na opção Split channels para abrir o arquivo de imagem.
2. No menu Imagem, selecione Propriedades para verificar se a imagem tem o tamanho de pixel e a profundidade de voxel corretos, se não os valores corretos. Em seguida, vá para o menu Imagens, clique em Ajustar seguido de Brilho e Contraste, ajuste o brilho e o contraste da imagem (por exemplo, macrófagos - mCherry ou dTomato; neutrófilos - PBM; Células T - EGFP; hepatócitos - EGFP ou mCherry).
3. Em seguida, crie projeções de intensidade máxima para cada canal.
4. Conforme descrito na secção 6 (Passos 6.9-6.12), crie um ROI em torno do fígado larval e meça a área do fígado. Crie um segundo ROI, incluindo a área do fígado e a área circundante de 75 μm ("Área de recrutamento").
5. Em seguida, no menu Editar , selecione a opção Seleção seguida de Adicionar ao gerente. Selecionando um canal inato de células imunes Projeção de Intensidade Máxima, clique no ROI do fígado na janela ROI Manager para definir a área de Recrutamento.
6. No menu Plug-ins, selecione a opção Analisar seguida de Contador de células e conte as células imunes dentro da área de Recrutamento. Registre o número de células imunes recrutadas para a área do fígado em uma planilha.
7. Calcule as densidades de neutrófilos, macrófagos e células T normalizando o número de células imunes por área do fígado.

Resultados

Ao introduzir uma dieta de colesterol alto a curto prazo em um modelo de peixe-zebra de carcinoma hepatocelular (CHC), que superexpressa uma forma constitutivamente ativa específica de hepatócitos de beta-catenina (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷, somos capazes de criar um modelo de vertebrado não mamífero de CHC associado à NASH. A progressão da doença hepática pode ser monitorada precocemente pela medição da esteatose hepática, tamanho do fígado, hepatócito, morfologia nuclear, angiogênese e infiltração de células imunes (Figura 1).

Larvas de CHC alimentadas com uma dieta normal não apresentam esteatose hepática leve, medida pela coloração Oil Red O. No entanto, larvas de CHC alimentadas com dieta rica em colesterol apresentam aumento significativo da esteatose hepática (Figura 2).

Um marcador bem conhecido de doença hepática é a hepatomegalia¹⁷. Para avaliar o tamanho do fígado, as larvas de CHC podem ser cruzadas com uma linha transgênica que expressa especificamente um marcador fluorescente nos hepatócitos, como o Tg(fabp10a:H2BmCherry). Para avaliar a hepatomegalia, a avaliação da área hepática (2D), da área de superfície hepática e do volume hepático (3D) é realizada. Após 8 dias de exposição a um excedente de colesterol, observou-se aumento hepático em larvas de CHC (Figura 3).

Usando imagens vivas não invasivas, linhagens de peixes transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em membranas de hepatócitos (como Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) e em núcleos de hepatócitos (como Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) podem ser usadas para avaliar alterações morfológicas celulares e nucleares associadas à malignidade em hepatócitos. A área de hepatócitos foi aumentada no CHC associado à NASH (Figura 4A,B,D), bem como na área nuclear (Figura 4C,E) e na relação nuclear:citoplasmática (Figura 4F). Uma diminuição significativa da circularidade nuclear também foi observada no grupo HCD+HCC (Figura 4G). A lipotoxicidade desencadeia danos ao DNA, uma característica da carcinogênese na presença de micronúcleos. Utilizando o marcador H2B-mCherry observou-se maior incidência de micronúcleos nas larvas do CHC alimentadas com dieta hipercolesterolística (Figura 4H).

A vasculatura hepática pode ser facilmente avaliada em modelos de peixe-zebra usando uma linha marcada transgênica, como Tg (kdrl:mCherry ou Tg(fli:EGFP), que rotulam a vasculatura. Observou-se aumento significativo da densidade dos vasos nas larvas de CHC+HCD (Figura 5).

Para observar a resposta inflamatória desencadeada precocemente no CHC associado à NASH, uma linhagem de peixes transgênicos expressando proteínas fluorescentes em macrófagos e neutrófilos, como Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), foi cruzada com a linha transgênica do CHC. A infiltração de neutrófilos e macrófagos ocorre tanto no CHC quanto no HCC alimentados com HCD, o que foi avaliado pela quantificação do número e densidade de neutrófilos/macrófagos no fígado e arredores (área circundante até 75μm) (Figura 6A-H). No entanto, o HCC+HCD apresentou um aumento significativo no número e densidade de neutrófilos (Figuras 6F-H). Aos 13 dias após a fertilização, o sistema imunológico adaptativo já está funcional. Usando uma linha de peixes transgênicos expressando proteína fluorescente em células T, como a Tg(lck:EGFP), e em combinação com a linha transgênica HCC; avaliamos o impacto do excesso de colesterol no recrutamento de células T para o fígado. Uma diminuição significativa na densidade de células T e no número total foi observada em larvas de CHC alimentadas com HCD (Figura 6I-K).

Linhagens transgênicas de peixe-zebra	Referência ZFIN	Análise
Casper	roya9; mitfaw2	Ose hepática da estese
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Vênus / fabp10a: H2B-mCherry )	s704Tg / uwm41Tg	Morfologia hepática
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vênus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Hepatócitos e morfologia nuclear
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_ cryaa: Vênus; fli: EGFP)	s704Tg / y1Tg	Angiogênese
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Vênus;  mfap4: Tomate-CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	Recrutamento de macrófagos e neutrófilos
Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Vênus; lck: EGFP)	s704Tg / cz1Tg	Recrutamento de células T

Tabela 1: Linhagens transgênicas de peixe-zebra a serem utilizadas em diferentes ensaios.

Número de larvas	Tamanho da caixa de alimentação	Quantidade de alimento por dia (mg)	Volume E3 (ml)
30-40	Caixa de reprodução pequena	3-4	200
60-80	Caixa de reprodução pequena/grande	6-8	400
100-150	Grande caixa de reprodução	10-15	500

Tabela 2: Estabelecer condições das caixas de alimentação.

Fenótipo	Método de pontuação
Nenhum	Núcleos normais, sem micronúcleos ou hérnia
Moderada	Baixo número de micronúcleos (menos de 5 por campo de visão) e/ou hérnia
Moderado / Grave	Número moderado a elevado de micronúcleos (mais de 5 por campo de visão) e/ou hérnia

Tabela 3: Micronúcleos e Pontuação da Hérnia Nuclear.

Figura 1: Diagrama de protocolo resumindo as principais etapas experimentais e a abordagem de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ensaio de Controle para Esteatose Hepática - Coloração ORO. Larvas de CHC foram alimentadas com dieta normal ou com colesterol alto e coloração Oil Red O (ORO) foi realizada para avaliar a esteatose hepática. (A) Diagrama da placa de 12 poços para realizar a coloração ORO sequencial usando as inserções de poço de malha. (B) Imagem da ferramenta de cílios usada para manipular larvas. (C) Imagens representativas de fígados corados com Vermelho Óleo; Larvas de CHC e HCC+HCD. (D) Gráfico qui-quadrado mostrando porcentagem de larvas com diferentes escores de esteatose hepática. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas do tamanho do fígado. Larvas transgênicas de CHC expressando um marcador hepático (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) foram fotografadas ao vivo e de forma não invasiva, em microscópio confocal de disco giratório invertido usando um zWEDGI. (A) Reconstruções 3D representativas de fígados em larvas de CHC e HCC+HCD. (B-D) Gráfico mostrando alterações morfológicas hepáticas, incluindo área hepática (B), área de superfície hepática (C) e volume hepático (D) em larvas de CHC e HCC + HCD. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens representativas de hepatócitos e morfologia dos núcleos. Foram fotografadas linhagens transgênicas de CHC expressando proteínas fluorescentes nas membranas dos hepatócitos (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) e nos núcleos dos hepatócitos (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (A-C) Reconstruções 3D representativas dos núcleos de F-actina e hepatócitos de larvas de CHC e HCC+HCD. As pontas de seta abertas mostram núcleos aumentados; as pontas de seta brancas mostram o núcleo com forma alterada; e setas vermelhas mostram micronúcleos e hérnia nuclear. (D-G) Gráficos mostrando médias de parâmetros celulares e nucleares em larvas de 13 dias de idade de CHC e HCC+HCD. (D) Área dos hepatócitos. (E) Área Nuclear. (F) Relação nuclear:citoplasma. (G) Circularidade nuclear. Cada ponto representa médias por larva. Os gráficos de pontos mostram gráficos qui-quadrados médios ±SEM (H) mostrando porcentagem de larvas com diferentes escores de Micronúcleos e Hérnia nuclear. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens representativas da vasculatura hepática. Linhagens transgênicas de CHC expressando proteínas fluorescentes em núcleos de hepatócitos (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) e em células endoteliais (Tg)fli:EGFP)). (A) Reconstruções 3D representativas da vasculatura hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (B-C) Gráfico mostrando o índice de densidade dos vasos por área de superfície hepática (B) volume (C) em larvas de CHC e HCC+HFCD. Os gráficos de pontos mostram a média ±SEM. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens representativas da paisagem das células imunes do fígado. Linha de CHC transgênica que expressa proteínas fluorescentes em macrófagos e neutrófilos (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) ou em células T (Tg(lck-EGFP). (A, C, F) Reconstruções 3D representativas de fígados e recrutamento de leucócitos para a área hepática em larvas de CHC e HCC + HCD de 13 dias de idade. (B) Diagrama da área do fígado fotografada. (D-E) Gráfico mostrando a densidade (D) e o número (E) de macrófagos na área hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (G-H) Gráfico mostrando a densidade (G) e o número (H) de neutrófilos na área hepática em larvas de CHC e HCC+HCD. (G) Reconstruções 3D representativas do recrutamento de células T para a área do fígado em larvas de CHC e HCC + HCD. (H-I) Gráfico mostrando a densidade de células T (H) e o número (I) na área do fígado em larvas de CHC e HCC + HCD. Os gráficos de pontos mostram a média ±SEM. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Tabela de Buffers e Soluções Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Com um aumento da incidência de CHC, especificamente o CHC induzido por NASH, é de grande importância ter modelos mais eficientes para estudar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no CHC associado à NASH. A deconvolução das interações célula-célula no fígado é crucial para entender melhor a progressão da doença hepática e a hepatocarcinogênese. A abordagem descrita neste protocolo oferece uma maneira única de analisar a progressão da doença hepática in vivo e de forma não invasiva.

A preparação da dieta é fundamental para o sucesso do estabelecimento de um modelo de CHC associado à NASH. É importante deixar o éter dietílico evaporar completamente dentro do exaustor para evitar efeitos nocivos, enquanto prepara dietas para o peixe-zebra. Para usar essas dietas com larvas (5-12 dias após a fertilização), é extremamente importante moer as dietas em partículas finas para garantir a ingestão de alimentos pelas larvas. O uso de análogos de ácidos graxos marcados fluorescentemente pode ser usado para avaliar a ingestão de alimentos em larvas.

Antes de colocar as larvas nas caixas de reprodução e iniciar o procedimento de alimentação, é crucial garantir que a amostragem experimental seja uniformizada pela mistura de larvas de diferentes placas. Essa etapa é importante, uma vez que diferentes microambientes, a partir do Dia 0, são promovidos em cada uma das placas e podem afetar a resposta inflamatória.

Outro passo importante é contar as larvas, para saber quanto alimento é necessário para cada caixa de alimentação. Se a quantidade de alimento não for adequada para o número de larvas presentes em cada caixa, ocorrerá um dos dois cenários: 1) as larvas serão subalimentadas; 2) as larvas serão superalimentadas. A alimentação imprecisa levará a condições insalubres associadas à desnutrição ou supernutrição, como inflamação, o que afetará drasticamente o microambiente hepático. Se ocorrer uma alimentação imprecisa, as larvas mostrarão problemas de movimento. Nesta fase de desenvolvimento, as larvas devem nadar intensamente, portanto, se os problemas de movimento forem notados, as larvas foram criadas em condições insalubres (desnutrição ou exposição a doses tóxicas de colesterol devido à superalimentação). Por esta razão, os procedimentos de alimentação precisam ser rigidamente controlados para ambas as dietas, normal e colesterol enriquecido. Alguns ensaios podem ser realizados para abordar rapidamente a precisão da alimentação e da saúde das larvas, incluindo a presença de hepatomegalia (tamanho do fígado) e inflamação de tecidos e órgãos, particularmente fígado e intestino (aumento visível da infiltração de neutrófilos e macrófagos).

A limpeza diária e a substituição de 95% do E3 são fundamentais para reduzir o crescimento de microrganismos nas caixas de alimentação e melhorar a saúde e a sobrevivência das larvas. Alternativamente, as larvas podem ser colocadas em um sistema de rack autônomo. Para melhores resultados, coloque 60-80 larvas em um tanque de 3 litros. Mantenha o fluxo de água no nível mínimo, ajustando o fluxo para um modo de gotejamento rápido e alimentando as larvas com 3-4 mg duas vezes ao dia (AM e PM). O fluxo de água deve ser verificado regularmente para garantir o fluxo correto em cada tanque. Em nosso laboratório, este método nos dá 95-100% de sobrevivência com alimentação de curto prazo de 10% de HCD. Além disso, esse método reduziu consideravelmente a carga de trabalho inerente à limpeza diária e à troca de água necessária no protocolo de alimentação estática descrito.

Enquanto utilizamos uma dieta enriquecida com colesterol a 10% para induzir a EHNA em uma exposição de curto prazo (5 dias é suficiente para induzir esteato-hepatite), alterações na dieta podem ser realizadas e expandidas para usar frutose ¹⁸, ácidos graxos (como o ácido palmítico)¹⁹ ou protocolos de alimentação que podem ser estendidos usando uma dieta enriquecida com colesterol a 4%²⁰. Atualmente, existem poucos alvos terapêuticos bem-sucedidos para CHC e nenhum para NASH. O uso de modelos de peixe-zebra oferece uma oportunidade única para expandir nosso conhecimento sobre hepatocarcinogênese, mas também um sistema de vertebrados inparalelo para realizar grandes rastreios de drogas de rendimento. As técnicas descritas neste protocolo facilitarão achados futuros e alvos terapêuticos para doença hepática e hepatocarcinogênese.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colesterol	Sigma	C8667-25G	Facilmente degradado. Loja -20°C.
Kit de suporte Corning Netwells 15 mm	Fisher	07-200-223
Inserções Corning Netwells	Fisher	07-200-212
Éter dietílico	Fisher	60-046-380	Altamente Volátil.
Fórceps Dumont #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% paraformaldeído (PFA)	Ciência da Microscopia Eletrônica	15710
Dieta Golden Pearl 5– 50 nm Active Spheres	Brine Shrimp	Direct-Qualquer	alimento comercial em pó seco para larvas pode ser usado.
Pipetas de Transferência Graduada	Fisher	22-170-404
Isopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, Pacote com 10	Crystalgen	221-1422-10
100X20MM	Fisher	08-747D
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Solução de óleo vermelho O 0,5% isopropanol	Sigma	O1391-500ML
Tricaína	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Sistema de vácuo para coleta de larvas
Microscópios
Microscópio estereoscópico	fluorescenteLeica	M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal	Microscópio Nikon	Nikon CSU-W1
Estereomicroscópio	Leica	S9i com base
Software
Fiji	Programa de processamento de imagem Java de código aberto.
Imaris 9.6	Bitplane; Instrumentos de Oxford.