O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.
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Artigo de método
Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fagocitose é um processo orquestrado que envolve etapas distintas: reconhecimento, vinculação e internalização. Faócitos profissionais tomam parasitas leishmania por fagocitose, consistindo em reconhecer ligantes em superfícies parasitas por múltiplos receptores de células hospedeiras. A ligação da Leishmania às membranas macrófagos ocorre através do receptor complementar tipo 1 (CR1) e do receptor complementar tipo 3 (CR3) e receptores de reconhecimento de padrões. Lipofosfoglicano (GLP) e 63 kDa glicoproteína (gp63) são os principais ligantes envolvidos nas interações macrófago-Leishmania. Após o reconhecimento inicial de ligantes parasitas por receptores de células hospedeiras, os parasitas se internalizam, sobrevivem e se multiplicam dentro de vacólos parasitoforosos. O processo de maturação de vacuoles induzidos por Leishmania envolve a aquisição de moléculas de vesículas intracelulares, incluindo a proteína G monomérica Rab 5 e Rab 7, proteína de membrana associada à lisesomal 1 (LAMP-1), proteína de membrana associada lysomal 2 (LAMP-2) e proteína associada a microtúbulos 1A/1B-cadeia de luz 3 (LC3).
Aqui, descrevemos métodos para avaliar os eventos precoces ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras utilizando microscopia confocal, incluindo (i) internalização (ii) vinculante e (iii) maturação fágora. Ao agregar ao corpo de conhecimento em torno desses determinantes do desfecho da infecção, esperamos melhorar a compreensão da patogênese da infecção por Leishmania e apoiar a eventual busca por novos alvos quimioterápicos.
Introdução
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania, resultando em um amplo espectro de manifestações clínicas no hospedeiro vertebrado, incluindo leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral1. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de um bilhão de pessoas estão em risco, com mais de um milhão de novos casos notificados por ano2.
Leishmania spp. são protozoários intracelulares obrigatórios que sobrevivem dentro de células hospedeiras, incluindo monócitos, macrófagos e células dendrí....
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Protocolo
As células foram obtidas de doadores saudáveis após a aprovação dos procedimentos pelos Comitês Nacionais de Ética em Pesquisa (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Culturas celulares
- Macrófagos derivados de monócitos humanos
NOTA: Para obter macrófagos derivados do monócito humano para diferenciação in vitro em macrófagos, coletar sangue de doadores saudáveis e purificar células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), conforme descrito por D. English e B. R. Andersen21.- Depois de coletar sangue periférico (50 mL), despeje-o em um tubo heparinizado e, em seguida, dilua o sangue 1:1 em uma so....
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Resultados
Este relatório tem como objetivo avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a fagocitose de L. braziliensis isolados de pacientes que apresentam L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopia confocal, foram investigados os principais eventos associados à fagocitose dos parasitas: vinculação, internalização e maturação fleuomol. Primeiro avaliamos a ligação L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL por macrófagos derivados de monócitos humano.......
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Discussão
A interação leishmania-macrófago é um processo complexo e envolve várias etapas que podem influenciar o desenvolvimento da doença5. Para entender melhor os mecanismos envolvidos na interação da Leishmania nãoopsonizada e das células hospedeiras, descrevemos um protocolo que emprega microscopia de fluorescência confocal para avaliar a fagocitose desde os estágios iniciais até os estágios finais da infecção por Leishmania . O uso de técnicas de fluorescência envolvendo doi.......
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Divulgações
Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta ou análise de dados, na decisão de publicar ou na elaboração do manuscrito. Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos ao Instituto Gonçalo Moniz, à Fiocruz Bahia, ao Brasil e ao departamento de microscopia pela assistência. Este trabalho foi apoiado pelo número INOVA-FIOCRUZ 79700287000, P.S.T.V. detém uma bolsa de produtividade em pesquisa do CNPq (305235/2019-2). Plasmids foram gentilmente fornecidos por Mauricio Terebiznik, Universidade de Toronto, CA. Os autores gostariam de agradecer a Andris K. Walter pela revisão da língua inglesa e assistência de cópia do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugado cabra anti-coelho IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios nenhum anticorpo anti-LC3 Novus | |
| Biologicals | NB600-1384 | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacina | Isofarma | X | |
| Incubadora de CO2 | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Microscópio de fluorescência confocal (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Microscópio de fluorescência (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hidroxietil piperazina-N'-2-etano-sulfônico) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Soro de cabra normal | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Dispositivo | Lonza | AAB-1001 | |
| Solução de nucleofector | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | |
| Faloidina | Invitrogen | A12379 | |
| Acetato de miristato de forbol (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Solução tampão de fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio | Gibco | 11875-093 | |
| Saponina | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Meio de inseto | Schneider Sigma | S0146 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma | S5761 | |
| Piruvato de sódio | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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Reimpressões e permissões
