O protocolo delineado descreve o procedimento para a produção do complexo de proteína de domínio de ligação receptora HiBiT e sua aplicação para detecção rápida e sensível de anticorpos SARS-CoV-2.
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Artigo de método
Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT
Neste artigo
Resumo
Resumo
O surgimento da pandemia COVID-19 aumentou a necessidade de melhores métodos de detecção sorológica para determinar o impacto epidemiológico da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). O número crescente de infecções por SARS-CoV-2 aumenta a necessidade de melhores ensaios de detecção de anticorpos. Os métodos atuais de detecção de anticorpos comprometem a sensibilidade para a velocidade ou são sensíveis, mas demorados. Uma grande proporção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 tem como alvo o domínio de ligação receptora (RBD), um dos compartimentos imunogênicos primários do SARS-CoV-2. Recentemente projetamos e desenvolvemos um RBD altamente sensível, bioluminescente marcado (NanoLuc HiBiT-RBD) para detectar anticorpos SARS-CoV-2. O texto a seguir descreve o procedimento para produzir o complexo HiBiT-RBD e um ensaio rápido para avaliar a presença de anticorpos direcionados a RBD usando esta ferramenta. Devido à durabilidade do produto de proteína HiBiT-RBD em uma ampla gama de temperaturas e ao procedimento experimental mais curto que pode ser concluído dentro de 1 h, o protocolo pode ser considerado como uma alternativa mais eficiente para detectar anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.
Introdução
O recente surgimento de um novo coronavírus, SARS-CoV21, causou mais de 2.800.000 mortes e 128 milhões de infecções a partir de 30 de março de 20212. Devido à falta de um procedimento de tratamento confiável e bem estabelecido para as terapias clínicas SARS-CoV-2, muitos esforços têm sido feitos para restringir a transmissão viral e, mais importante, desenvolver um tratamento eficaz e robusto ou uma vacina3. Até o momento, há mais de 50 candidatos à vacina COVID-19 em ensaios relatados pela Organização Mundial da Saúde4. A detecção de anticorpos contra o SARS-CoV....
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Protocolo
NOTA: O protocolo descrito abaixo adere a todas as diretrizes éticas de acordo com o código de protocolo 20200371-01H.
1. Produção e avaliação do biorelatador HiBiT-RBD
- Produzindo uma quantidade suficiente de bioreporter HiBiT-RBD
- Prepare-se para a cultura celular
- Prepare o meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina/estreptomicina. Em seguida, aqueça a mídia em um banho de água de 37 °C.
- Ligue o gabinete de segurança biológica (BSC) e use 70% de v/v de etanol para esterilizar a superfície do gabinete.
- Cultura a linha cel....
- Prepare-se para a cultura celular
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Resultados
Foram registrados os sinais tanto do liseto celular contendo HiBit-RBD quanto do sobrenante das células transfeinadas (Figura 2) para avaliar a fonte proteica apropriada. HiBiT-RBD e LgBit foram usados separadamente como controles, e os dados mostraram baixo fundo em comparação com um sinal forte quando ambas as partes foram combinadas. Assim, a interação HiBiT-RBD com o LGBiT é necessária para gerar enzima ativa para digestão substrato e atividade de bioluminescência (F.......
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Discussão
O número crescente de pessoas infectadas com o SARS-CoV-2 e o esforço contínuo para a vacinação global exigem testes sorológicos sensíveis e rápidos que podem ser usados em serosurveys em larga escala. Pesquisas recentes mostram que bionotáciferas com base em nanoluciferase divididos podem ser usados para desenvolver tais ensaios. Recentemente desenvolvemos o bioreporter HiBiT-RBD para projetar um teste que pode ser usado para detectar anticorpos específicos SARS-CoV-2 no soro do paciente de forma rápida e confiável (
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos e agradecemos a assistência técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Agradecemos também a Mina Ghahremani pelo Design Gráfico. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo. A DWC é apoiada em parte pela Faculdade uOttawa e pelo Departamento de Medicina.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5x Tampão de Lise Passivo | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Arruela Magnética Portátil | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Sistema de Ensaio de luciferase Dual-Glo | Promega | E2940 | Kit de 100 mL |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmídeo | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgtacgtgtacgt aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgtacgggccagatacgc gttgacattgattattgactagttattagt aatcaattacggggtcattagtttatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggccccctggctgcccccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtgtatcatatgccaagta cgccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgttgtt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggatttccaagtccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtagggtgtatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicilina estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pierce Protein G Grânulos Magnéticos | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo Neutralizador de Pico, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | Luminômetro | ||
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0,25% |
Referências
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F.
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Reimpressões e permissões
