Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

Resumo

Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.

Resumo

Uma sonda de força biomembana (BFP) emergiu recentemente como uma superfície de célula nativa ou no nanotool de espectroscopia de força dinâmica in situ (DFS) que pode medir cinéticas de ligação uni-molecular, avaliar propriedades mecânicas de interações ligantes-receptores, visualizar alterações conformais dinâmicas de proteína e elucidar mecanismos de mecanosensing de células mediadas pelo receptor. Mais recentemente, o BFP tem sido usado para medir a constante de mola de ligações moleculares. Este protocolo descreve o procedimento passo-a-passo para realizar a análise constante de DFS da mola molecular. Especificamente, dois modos de operação BFP são discutidos, ou seja, os modos Bead-Cell e Bead-Bead. Este protocolo se concentra em derivar as constantes de mola da ligação molecular e células a partir de dados brutos do DFS.

Introdução

Como técnica de DFS de células vivas, a BFP projeta um glóbulo vermelho humano (RBC; Figura 1) em um transdutor de força ultrasensível e tunable com uma faixa de constante de mola compatível em 0,1-3 pN/nm^1,2,3. Para sondar a interação ligante-receptor, o BFP permite medições de DFS em ~1 pN (10^-12 N), ~3 nm (10^-9 m) e ~0,5 ms (10^-3 s) em vigor, resolução espacial e temporal^4,5. Sua configuração experimental consiste em dois micropipettos opostos, ou seja, a Sonda e o alvo. A micropipette sonda aspira um RBC e uma conta é colada em seu ápice através de uma interação biotina-streptavidina. A conta é revestida com o ligante de interesse(Figura 1A). O micropipette target aspira uma célula ou uma esfera com o receptor de interesse, correspondendo aos modos De célula de contas(Figura 1B) e Bead-Bead(Figura 1C),^{respectivamente 5}.

A construção, montagem e os protocolos experimentais DFS foram descritos em detalhes anteriormente^1,6. Resumidamente, um ciclo de toque BFP consiste em 5 estágios: Abordagem, Impinge, Contato, Retraímento e Dissociado(Figura 1D). A posição de ápice RBC horizontal é denotada como Δx_RBC. No início, a deformação RBC não-apoiada (com força zero) Δx_RBC é 0 (Tabela 1). O Alvo é então conduzido por um piezotranslator para impingir e retrair da conta da sonda(Figura 1D). A sonda RBC é primeiramente compactada pelo Target com deformação RBC negativa Δx_RBC < 0. Em um evento de Bond, a fase Retract passa de uma fase compressiva para uma fase de tração com deformação RBC positiva Δx_RBC > 0 (Figura 2C e D). De acordo com a lei de Hooke, a força de rolamento BFP é capaz de ser medida como F = k_RBC × Δx_RBC, onde k_RBC ( Tabela1) é a constante de mola RBC do BFP. Após a ruptura da ligação e a conclusão de um ciclo de toque, a conta da sonda retorna à posição de força zero com Δx_RBC = 0 (Figura 1D).

Para determinar o k_RBC,medimos e registramos os raios do orifício interno da sonda(R_p),a RBC (R₀) e a área de contato circular(R_c)entre a RBC e a placa da sonda(Figura 1A). Em seguida, a K_RBC é calculada de acordo com o modelo do Evan (Eq.^{1) 7,8} utilizando um programa LabVIEW que atua como um instrumento virtual (VI) para operar o BFP (Figura S1A)^8,9.

(Eq. 1)

Com um BFP estabelecido e dados brutos DFS obtidos, apresentamos como analisar a constante de mola do par ou células do receptor de ligantes. Os dados brutos do DFS sobre a interação da proteína glicosilada Thy-1 e K562 rolam integrin α₅β₁ (Thy-1-α₅β₁; Figuras 3A e 3B)¹⁰ e a do fibrinogênio e da integrin revestida de contas α_IIbβ₃ (FGN-α_IIbβ₃; Figura 3C) ^11,12 foram usados para demonstrar os modos de análise de Células de Contas e Contas de Contas, respectivamente.

Preparação Experimental BFP
Para obter detalhes sobre a preparação experimental e instrumentação da BFP, consulte os protocolos publicados anteriormente³. Resumindo, a RBC humana foi biotinilada usando o Biotin-PEG3500-NHS no buffer de carbono/bicarbonato. Proteínas de interesse foram covalentemente acoplado às contas de vidro borossilicato usando MAL-PEG3500-NHS no tampão fosfato. Para anexar ao RBC biotinilado, a conta da sonda também é revestida com streptavidina (SA) usando o MAL-SA. Consulte a Tabela de Materiais e Tabela 2.

Para montar o BFP (Figura 1, à esquerda),a terceira micropipette denominada 'Ajudante' será usada para entregar a conta da sonda e colá-la ao ápice da RBC^1,3. A interação covalente entre a conta da sonda revestida SA e a RBC biotinilada é muito mais forte do que a ligação ligante-receptor de interesse. Assim, o estágio Dissociado pode ser interpretado como a ruptura da ligação ligante-receptor em vez do desprendimento da conta da sonda da RBC.

Protocolo

1. Obter eventos de DFS analisáveis

1. Inicie o experimento no software (por exemplo, LabVIEW VI) para a configuração de controle e parâmetro BFP(Figura S1A).
2. Observe os toques de esferas/células de esferas de esferas de teste repetitivo no software para Monitor BFP(Figura S1B).
3. Teste e alcance a frequência de adesão ≤ 20% dentro dos primeiros 50 toques, ajustando a força de impacto e o tempo de contato, pelo qual garante que ≥ 89% do evento de adesão do DFS sejam mediados por ligações únicas^12,13,14.
   NOTA: Para cada par de células de contas/contas, realizamos 200 ciclos de toque repetitivos. Para obter qualidade de dados publicáveis, geralmente executamos n ≥ 3 pares De Contas ou Contas-Célula.
   1. Salve os dados, na forma de Força vs. Tempo, à pasta dirigida pelo usuário até o final de cada par, solicitado pelo software para o controle bfp e configuração do parâmetro.
4. Colete os dados brutos force vs. Time dos eventos bond, conforme exemplificado na Figura 2A,utilizando a plataforma de aquisição BFP(Figura S1C).
   1. Abra o software de análise de dados BFP. Clique no ícone da pasta amarela e selecione o arquivo de dados brutos correspondente clicando neles.
5. Execute o programa e clique no botão para cima e para baixo para alternar entre os eventos. Use os critérios de exclusão outlier(Figura S2) para selecionar eventos inválidos. Selecione o tipo de dados de exportação como formato Força vs. Tempo e clique no botão Exportar dados de gráficos.

2. Converta a curva força vs. tempo para a curva força vs. deslocamento

1. Exporte o segmento de dados correspondente ao estágio Retractção para uma planilha (Figura 2A, letreiro quadrado), que é relevante para a análise constante da mola.
2. Plote a Curva Força vs. Tempo usando o software de planilha. Para obter a curva Força vs. Deslocamento, converta os valores de tempo(Figura 2A, x-eixo) para os valores de deslocamento totais (Δx_tot) multiplicando os valores do tempo com a velocidade de movimento piezo (ou seja, 4.000 nm/s por predefinição).
3. Zero o primeiro ponto de dados subtraindo o menor valor de deslocamento de cada valor de deslocamento adquirido. Essa transformação horizontal não afeta as encostas ascendentes do estágio Retractção nem o cálculo constante de mola subsequente.
4. Notavelmente, o BFP é considerado como um sistema de mola serial no qual Δx_tot (Tabela 1) somam deformações do RBC, Δx_RBC (Tabela 1),a ligação molecular, Δx_mol (Tabela 1),e a célula Alvo, Δx_célula (Tabela 1),como o Eq. 2:
   (Eq. 2)
5. Plote a Força (F) vs. Deslocamento (Δx_tot) curva como mostrado na Figura 2B.

3. Análise cnstante de mola do modo de célula de contas

1. Na curva Força vs. Deslocamento, pode-se identificar dois slop distintos, onde cada um pode representar a fase compressiva e a fase de tração. Encaixe uma linha de regressão em cada grupo de dados(Figura 2B),onde a inclinação de ajuste linear maior representa a constante total da mola na fase compressiva(Figura 2B, vermelha),denotada como k₁ (Tabela 1); e a inclinação de ajuste linear menor representa a constante total da mola na fase detração (Figura 2B, azul),denotada como k₂ (Tabela 1).
2. Para molas conectadas em séries por descrição passo 2.2, expresse a recíproca da constante total da mola, k_tot (Tabela 1),como a soma dos inversos constantes da mola de RBC, k_RBC (Tabela 1),a ligação molecular, k_mol (Tabela 1),e a célula Alvo,_célula K(Tabela 1). Durante a fase compressiva do modo Célula de Contas, a ligação molecular não é esticada, portanto k_mol não é levado em consideração. A recíproca do k_tot neste cenário (1/k₁) é expressa como
   (Eq. 3).
   Nos dados de exemplo, k_RBC é pré-determinado (0,25 pN/nm por padrão). k_célula pode ser derivada do Eq. 3 com os adquiridos k₁ e k_RBC ( Figura3B).
3. Durante a fase de tração, a adesão é formada entre o par ligante-receptor. Expresse a recíproca do k_tot neste cenário (1/k₂) como
   (Eq. 4)
   onde k₂ (Tabela 1) representa a constante total da mola durante a fase de tração.
4. Deriva k_mol de subtração 1/k₁ de 1/k₂ (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).

4. Análise constante da mola do modo contas-contas

1. Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase compressiva para obter k₁ (semelhante à Figura 2B, vermelho). Note-se que, no modo Bead-Bead, a célula Target é substituída por uma conta de vidro revestida com o receptor de interesse(Figura 1C). Uma vez que a deformação das contas é insignificante, o termo_{de célula} de 1/kpode ser removido do Eq. 3 e Eq. 4 em conformidade. O k_tot recíproco da fase compressiva (1/k₁) pode ser expresso como:
   (Eq. 5)
2. Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase de tração para obter k₂ (semelhante à Figura 2B, azul). O k_tot recíproco da fase de tração (1/k₂) pode ser expresso como:
   (Eq. 6)
3. Deriva k_mol de subtrair 1/k₁ de 1/k₂ (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).

Resultados

Neste trabalho, demonstramos o protocolo da análise constante da mola BFP. Para o modo de análise de células de contas, analisamos o k_mol da ligação molecular entre a proteína glicosilácida Thy-1 revestida na conta da sonda e a integrin α₅β₁ expressas na célula Target K562 (Thy-1-integrin α₅β₁; Figura 3A) ¹⁰. A_célula ktambém é derivada do modo Célula de Contas (Célula K562;

Discussão

Em resumo, fornecemos um protocolo detalhado de análise de dados para pré-processamento dos dados brutos do DFS e que deriva constantes de mola molecular nos modos de análise BFP Bead-Bead e Bead-Cell. São apresentados modelos biomecânicos e equações necessárias para determinar as constantes moleculares e celulares da mola. Embora sejam estudadas integrins diferentes, o k_mol medido pelo modo Bead-Bead e pelo modo Bead-Cell possui diferenças significativas de alcance(Figura 3A

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS)	Uct, Specialties, llc	4420-74-0	Funcionalização de esferas de vidro
Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparação de tampão fosfato
Aquisição de dados BFP VI	LabVIEW		BFP e parametrização Análise
de dados BFP VI	Análise de dados brutos	LabVIEW
Biotina-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	Biotinilação de hemácias
Contas de vidro borossilicato	Distrilab Particle Technology, Holanda	9002	Funcionalização de esferas de vidro
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A0336	Câmera de funcionalização de ligantes
VI	Monitoramento LabVIEW		BFP
D-glicose	Sigma-Aldrich	G7021	Tyrode' s preparação do tampão
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' s preparação do tampão
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funcionalização do grânulo de vidro
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tyrode' s preparação do tampão
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparação do tampão carbonato/bicarbonato; Tyrode' s preparação do
tampão Carbonato de sódio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparação do tampão carbonato/bicarbonato
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tyrode» s preparação do tampão
Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (NaH2PO4• H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparação de tampão fosfato
Streptavidin-Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Funcionalização de esferas de vidro