Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.
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Artigo de método
Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma sonda de força biomembana (BFP) emergiu recentemente como uma superfície de célula nativa ou no nanotool de espectroscopia de força dinâmica in situ (DFS) que pode medir cinéticas de ligação uni-molecular, avaliar propriedades mecânicas de interações ligantes-receptores, visualizar alterações conformais dinâmicas de proteína e elucidar mecanismos de mecanosensing de células mediadas pelo receptor. Mais recentemente, o BFP tem sido usado para medir a constante de mola de ligações moleculares. Este protocolo descreve o procedimento passo-a-passo para realizar a análise constante de DFS da mola molecular. Especificamente, dois modos de operação BFP são discutidos, ou seja, os modos Bead-Cell e Bead-Bead. Este protocolo se concentra em derivar as constantes de mola da ligação molecular e células a partir de dados brutos do DFS.
Introdução
Como técnica de DFS de células vivas, a BFP projeta um glóbulo vermelho humano (RBC; Figura 1) em um transdutor de força ultrasensível e tunable com uma faixa de constante de mola compatível em 0,1-3 pN/nm1,2,3. Para sondar a interação ligante-receptor, o BFP permite medições de DFS em ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) e ~0,5 ms (10-3 s) em vigor, resolução espacial e temporal4,5. Sua configuração experimental consiste em dois micropipettos opostos, ou seja,....
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Protocolo
1. Obter eventos de DFS analisáveis
- Inicie o experimento no software (por exemplo, LabVIEW VI) para a configuração de controle e parâmetro BFP(Figura S1A).
- Observe os toques de esferas/células de esferas de esferas de teste repetitivo no software para Monitor BFP(Figura S1B).
- Teste e alcance a frequência de adesão ≤ 20% dentro dos primeiros 50 toques, ajustando a força de impacto e o tempo de contato, pelo qual garante que ≥ 89% do evento de adesão do DFS sejam mediados por ligações únicas12,13,14.
NOTA: Para ....
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Resultados
Neste trabalho, demonstramos o protocolo da análise constante da mola BFP. Para o modo de análise de células de contas, analisamos o kmol da ligação molecular entre a proteína glicosilácida Thy-1 revestida na conta da sonda e a integrin α5β1 expressas na célula Target K562 (Thy-1-integrin α5β1; Figura 3A) 10. Acélula ktambém é derivada do modo Célula de Contas (Célula K562;
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Discussão
Em resumo, fornecemos um protocolo detalhado de análise de dados para pré-processamento dos dados brutos do DFS e que deriva constantes de mola molecular nos modos de análise BFP Bead-Bead e Bead-Cell. São apresentados modelos biomecânicos e equações necessárias para determinar as constantes moleculares e celulares da mola. Embora sejam estudadas integrins diferentes, o kmol medido pelo modo Bead-Bead e pelo modo Bead-Cell possui diferenças significativas de alcance(Figura 3A
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes a relatar em relação ao presente estudo.
Agradecimentos
Agradecemos a Guillaume Troadec pela discussão útil, Zihao Wang pela consulta de hardware, e o Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer pelo apoio à nossa startup de laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Funcionalização de esferas de vidro |
| Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Preparação de tampão fosfato |
| Aquisição de dados BFP VI | LabVIEW | BFP e parametrização Análise | |
| de dados BFP VI | Análise de dados brutos | LabVIEW | |
| Biotina-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotinilação de hemácias |
| Contas de vidro borossilicato | Distrilab Particle Technology, Holanda | 9002 | Funcionalização de esferas de vidro |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A0336 | Câmera de funcionalização de ligantes |
| VI | Monitoramento LabVIEW | BFP | |
| D-glicose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode' s preparação do tampão |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode' s preparação do tampão |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Funcionalização do grânulo de vidro |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode' s preparação do tampão |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Preparação do tampão carbonato/bicarbonato; Tyrode' s preparação do |
| tampão Carbonato de sódio (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Preparação do tampão carbonato/bicarbonato |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode» s preparação do tampão |
| Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (NaH2PO4• H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Preparação de tampão fosfato |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Funcionalização de esferas de vidro |
Referências
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
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Reimpressões e permissões
