Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).
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Artigo de método
In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A partir de 2000, o sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas usando o protocolo de Edmonton para tratar diabetes mellitus tipo I ainda enfrentou alguns obstáculos. Estes incluem o número limitado de doadores cadavéricos do pâncreas e o uso a longo prazo de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido consideradas como um candidato em potencial como uma fonte alternativa de geração celular semelhante a ilhotas. Nossos relatórios anteriores ilustraram com sucesso o estabelecimento de protocolos de indução para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em células produtoras de insulina (IPCs). No entanto, a eficiência da indução variou muito. Neste artigo, demonstramos a comparação da eficiência da indução pancreática do HDPSCs por meio de protocolos integrativos (manipulação microambiental e genética) e não integrativos (manipulação microambiental) para a entrega de IPCs derivados do HDPSC (hDPSC-IPCs). Os resultados sugerem uma eficiência de indução distinta tanto para as abordagens de indução em termos de estrutura de colônia tridimensional, rendimento, marcadores de mRNA pancreático e propriedade funcional no desafio de glicose multidosagem. Esses achados apoiarão o futuro estabelecimento de um IPC clinicamente aplicável e uma plataforma de produção de linhagem pancreática.
Introdução
Diabetes mellitus é uma preocupação global em curso. Um relatório da Federação Internacional de Diabetes (IDF) estimou que a prevalência global de diabetes aumentaria de 151 milhões em 2000 para 415 milhões em 20151,2. O último estudo baseado em epidemiologia previu que a prevalência estimada mundial de diabetes aumentará de 451 milhões em 2017 para 693 milhões em 20451. O sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas utilizando o protocolo de Edmonton foi demonstrado pela primeira vez em 2000, quando foi demonstrado manter a produção endógena da insulina e estabilizar a condição normóglicêica em pacientes diabéticos tipo I3. No entanto, a aplicação do protocolo de Edmonton ainda enfrenta um problema de gargalo. O número limitado de doadores de pâncreas cadavérico é o principal problema, uma vez que cada paciente com diabetes tipo I requer pelo menos 2-4 doadores de ilhotas. Além disso, o uso a longo prazo de agentes imunossupressores pode causar efeitos colaterais fatais4,5. Para lidar com isso, o desenvolvimento de uma potencial terapia para diabetes na última década tem focado principalmente na geração de células eficazes produtoras de insulina (IPCs) de várias fontes de células-tronco6.
As células-tronco tornaram-se um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo o diabetes tipo I, que é causado pela perda de células beta. O transplante de IPCs é o novo método promissor para o controle da glicemia nesses pacientes7. Neste artigo, estão apresentadas duas abordagens para geração de IPCs, protocolos integrativos e não integrativos de indução. O protocolo de indução imitou o processo natural de desenvolvimento pancreático para obter os IPCs amadurecidos e funcionais8,9.
Para este estudo, os hDPSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para detecção de marcadores de superfície MSC, potencial de diferenciação de multilineagem e RT-qPCR para determinar a expressão da propriedade stemness e marcadores genéticos proliferativos (dados não mostrados)8,9,10. hDPSCs foram induzidos em direção ao endoderme definitivo, endóderme pancreático, endócrina pancreática e células beta pancreáticas ou IPCs(Figura 1), respectivamente7. Para induzir as células, uma abordagem de indução de três etapas foi usada como protocolo de espinha dorsal. Este protocolo foi chamado de protocolo não integrativo. No caso do protocolo integrativo, o fator essencial de transcrição pancreática, PDX1,foi superexpresso em hDPSCs seguido pela indução de PDX1 superexpresso em hDPSCs utilizando um protocolo de diferenciação de três etapas. A diferença entre protocolo não integrativo e integrativo é a superexpressão do PDX1 no protocolo integrativo e não no protocolo não integrativo. A diferenciação pancreática foi comparada entre os protocolos integrativos e não integrativos deste estudo.
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Protocolo
Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana, Faculdade de Odontologia da Universidade chulalongkorn. Os DPSCs humanos (hDPSCs) foram isolados de tecidos de polpa dentária humana extraídos tanto de pré-molares quanto de molares devido a problemas de dentes do siso. O consentimento informado foi obtido dos pacientes sob protocolo aprovado (HREC-DCU 2018/054).
1. Protocolo de indução integrativa
- Preparação do vetor lentiviral que carrega PDX1
- Use células de rim embrionário humano (HEK) 293FT para embalagem viral. Cultura e manutenção dessas células no Médio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina e 1% Antibiótico-Antimycotic.
- Gerar vetores PDX1-lentivírus por co-transfecção de 10 μg cada uma das embalagens e plasmídeos de envelope e 20 μg do plasmídeo genético alvo em células HEK293FT usando sistema de transfecção fosfato de cálcio, por exemplo, psPAX2, pMD2. G, e humano pWPT-PDX111. Certifique-se de que as células são 80%-90% confluentes durante o tempo de infecção.
- Colete o meio contendo partículas lentivirais em 48 e 72 h após a transfecção.
- Filtrar o meio coletado através de um filtro de 0,45 μm; concentrar os vírus com um filtro centrífuga a 100 kDa nominais de peso molecular (NMWCO).
- Superexpressão PDX1
- Use a passagem 3-5 hDPSC que seja 70-80% confluente. Tentepsinizar e contar as células usando um contador de células. Semente 1 x 106 hDPSCs em um prato tratado de cultura de tecido de 60 mm e incubar durante a noite.
- 24 h depois, adicione partículas de vírus frescos obtidas da etapa 1.1.4 para transduzir células pré-tratadas de polibreno (4 μg/mL de polibrene, 30 min abaixo de 37 °C e 5% de CO2) na multiplicidade desejada de infecção (MOI). Por exemplo, neste caso, o MOI usado é 20. Manter as células na incubadora de cultura celular por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Após o período de infecção de 24 horas, descarte o meio contendo partículas virais. Adicione novas mídias culturais e continue crescendo as células por 48 h. Todas as culturas são mantidas a 37 °C e 5% de CO2.
- Verifique a morfologia agregada das células transfeinadas antes de prosseguir para a etapa de indução. A transdução PDX1 é confirmada pela análise de expressão genética(Figura Suplementar 1).
NOTA: Verifique a morfologia celular sob um microscópio antes de prosseguir para os próximos passos. - Colher e proceder a um protocolo de indução de três etapas (etapa 1.3) como uma abordagem de indução microambiental.
- Protocolo de indução de três etapas
NOTA: O protocolo de indução de três etapas resultou na série de diferenciação pancreática de hDPSCs para endoderme definitivo, endoderme/endócrina pancreática e beta-células/IPCs pancreáticos usando meio sem soro (SFM)-A, SFM-B e SFM-C, respectivamente.- Descarte o meio de cultura e, em seguida, lave os fdpscs transduturados com solução tamponada de fosfato 1x (PBS).
- Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA às células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% de CO2.
- Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e lave suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte as células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo coletor.
- Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (Força Centrífuga Relativa: RCF), 4 °C, por 5 min. Descarte o supernatante e salve a pelota da célula.
- Resuspenque a pelota em 3 mL do primeiro meio de indução pancreática, ou seja, meio sem soro (SFM)-A. Semente as células em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Mantenha as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias.
NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo. - Remova o SFM-A e adicione 3 mL do segundo meio de indução, ou seja, SFM-B. Mantenha as células pelos próximos 2 dias a 37 °C, 5% DE CO2.
NOTA: Observe a morfologia das células sob um microscópio invertido antes de prosseguir para o próximo passo. - Remova o SFM-B e adicione 3 mL do terceiro meio de indução, ou seja, SFM-C. Manter as células pelos próximos 5 dias em uma incubadora de cultura celular mantida a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 horas. Observe sua morfologia depois de 5 dias.
NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% de albumina de soro bovino (BSA), 1x insulina-transferrina-selênio (ITS), 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de peptídeo semelhante a glucagon (GLP)-1, 1 mM de nicotinamida e 1x aminoácidos não essenciais (NEAAs). - Certifique-se de verificar a morfologia celular sob um microscópio invertido após cada passo. As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias.
- Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).
2. Protocolo de indução não integrativo
NOTA: O protocolo não integrativo é o protocolo backbone para a entrega dos IPCs com o processo de indução de três etapas como abordagem de indução microambiental8,9.
- Use a passagem 3-5 hDPSCs a 70%-80% de confluência.
- Descarte o meio de cultura e lave os hDPSCs com 1x PBS.
- Adicione 0,25% de solução trypsin-EDTA nas células e incubar por 1 min a 37 °C, 5% DE CO2.
- Adicione o meio de cultura para parar a atividade de trippsina e pipeta suavemente as células para obter a suspensão de célula única. Conte células e alíquotas 1 x 106 células em cada tubo de coleta.
- Centrifugar a suspensão celular a 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Descarte o supernatante.
- Resuspend a pelota em SFM-A e semente em uma placa de cultura de baixa fixação (60 mm). Cultume as células a 37 °C e 5% de CO2 por 3 dias. Verifique a morfologia celular sob um microscópio invertido.
- Remova o SFM-A, adicione SFM-B (Dia 3) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 2 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2.
- Remova o SFM-B, adicione SFM-C (Dia 5) e, em seguida, mantenha as células pelos próximos 5 dias abaixo de 37 °C, 5% DE CO2. O SFM-C é alterado a cada 48 horas.
NOTA: Cada meio de indução é complementado com reagentes diferentes como descrito; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM de ativação A, 1 nM de butirato de sódio e 50 μM de beta-mercaptoetanol; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS e 0,3 mM taurina; e SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM taurina, 100 nM de GLP-1, 1 mM de nicotinamida e 1x NEAAs. - Certifique-se de verificar a morfologia celular sob o microscópio invertido após cada passo e no dia 10.
NOTA: As células se tornarão mais agregadas e flutuarão como colônias. - Colete colônias de células para análise suplementar. Verifique se há morfologia e tamanho da colônia. Realize a análise de expressão de marcador genético pancreático e a análise funcional (ensaio de secreção de C-peptídeo estimulado por glicose).
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Resultados
Neste artigo, foram comparados os resultados de ambos os protocolos de indução. Os diagramas de ambos os protocolos de indução são ilustrados na Figura 2A,C. Em ambos os protocolos, a avaliação foi realizada sob um microscópio leve, e as imagens foram analisadas com ImageJ. hDPSCs foram capazes de formar estruturas semelhantes a colônias a partir do primeiro dia de indução em ambos os protocolos de indução. A morfologia da colônia era redonda e densa, e todas as colônias flu...
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Discussão
Alcançar maior produção de IPCs de MSCs desempenha um papel essencial na terapia do diabetes. As etapas críticas do protocolo integrativo dependem da qualidade das células a serem utilizadas para a transdução e a qualidade das células transduzidas. Alguns requisitos celulares que devem ser verificados para uma transdução bem-sucedida estão garantindo a saúde celular, o gerenciamento de bancos celulares e as células estão em um estado mitoticamente ativo. Além disso, o monitoramento da viabilidade das células transduzidas...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
SK, WR e QDL foram apoiados pela Unidade veterinária de pesquisa de células-tronco e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP foram apoiados pelo Avanço Acadêmico de Chulalongkorn em seu projeto do séculoII. CS foi apoiado por uma pesquisa apoiando a bolsa da Faculdade de Ciência Veterinária, o Avanço Acadêmico chulalongkorn em seu projeto do século2, unidade de pesquisa de células-tronco veterinárias e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cultura de células | |||
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific Corporation, EUA | 15240062 | |
| Corning® Placa de cultura tratada com TC de 60 mm | Corning® | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Pó de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Um pacote é usado para preparar 1 L de solução PBS com DDI estéril |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Filtro Centrífugo Ultra-15 | Merck Millipore, EUA | UFC910024 | |
| Plasmídeo Humano pWPT-PDX1 | Addgene | 12256 | Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV, 0.45 µ m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmídeo | Addgene | 12259 | Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Reagente de |
| Infecção / Transfecção de Polibreno | Addgene_12259 Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmídeo | Addgene | 12260 | Presente de Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Protocolo de indução em três etapas | |||
| Activin A Proteína humana recombinante | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Albumina de soro bovino (BSA, fração de Cohn V, livre de ácidos graxos) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Peptídeo semelhante ao glucagon (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Aminoácidos Não Essenciais (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Placa de cultura de células não tratadas, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Butirato de sódio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referências
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Reimpressões e permissões
