Summary
يقدم هذا البروتوكول مقارنة بين بروتوكولين تعريفيين مختلفين للتمييز بين الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري (hDPSCs) نحو أنساب البنكرياس في المختبر:البروتوكول التكاملي والبروتوكول غير التكاملي. يولد البروتوكول التكاملي المزيد من الخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs).
Abstract
اعتبارا من عام 2000 ، ونجاح زرع جزيرة البنكرياس باستخدام بروتوكول ادمونتون لعلاج مرض السكري من النوع الأول لا تزال تواجه بعض العقبات. وتشمل هذه العدد المحدود من المتبرعين البنكرياس الجثث والاستخدام طويل الأجل لمثبطات المناعة. تعتبر الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) مرشحا محتملا كمصدر بديل لتوليد خلايا تشبه الجزيرة. وقد أوضحت تقاريرنا السابقة بنجاح وضع بروتوكولات تعريفية للتمييز بين الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري (hDPSCs) والخلايا المنتجة للأنسولين (IPCs). ومع ذلك، تباينت كفاءة الاستقراء بشكل كبير. في هذه الورقة، نبين مقارنة كفاءة تحريض البنكرياس hDPSCs عن طريق بروتوكولات تعريفية تكاملية (التلاعب بالبيئات الدقيقة والجينية) وبروتوكولات تعريفية غير تكاملية (التلاعب بالبيئات الدقيقة) لتقديم IPCs المشتقة من hDPSC (hDPSC-IPCs). النتائج تشير إلى كفاءة التعريفي متميزة لكلا النهج التعريفي من حيث هيكل مستعمرة 3 الأبعاد, العائد, علامات مرنا البنكرياس, والممتلكات وظيفية على التحدي الجلوكوز متعددة الجرعة. وستدعم هذه النتائج إنشاء مراكز IPCs منطبقة سريريا ومنصة لإنتاج نسب البنكرياس في المستقبل.
Introduction
مرض السكري هو مصدر قلق عالمي مستمر. وقدر تقرير للاتحاد الدولي للسكري أن الانتشار العالمي لمرض السكري سيرتفع من 151 مليون في عام 2000 إلى 415 مليون في عام 20151،2. وقد توقعت أحدث دراسة قائمة على علم الأوبئة أن انتشار مرض السكري في جميع أنحاء العالم المقدر سيرتفع من 451 مليون في عام 2017 إلى 693 مليون في عام 20451. وقد تجلى نجاح زرع جزيرة البنكرياس باستخدام بروتوكول ادمونتون لأول مرة في عام 2000، عندما ثبت للحفاظ على إنتاج الأنسولين الذاتية وتحقيق الاستقرار في حالة normoglycemic في النوع الأول مرضى السكري3. ومع ذلك، فإن تطبيق بروتوكول إدمونتون لا يزال يواجه مشكلة اختناق. العدد المحدود من المتبرعين البنكرياس الجثث هي القضية الرئيسية منذ كل مريض مع مرض السكري من النوع الأول يتطلب ما لا يقل عن 2-4 المتبرعين الجزيرة. وعلاوة على ذلك, استخدام على المدى الطويل من العوامل المثبطة للمناعة قد يسبب آثار جانبية تهدد الحياة4,5. ولمعالجة هذا الأمر، ركز تطوير علاج محتمل لمرض السكري في العقد الماضي بشكل رئيسي على توليد خلايا فعالة منتجة للأنسولين (IPCs) من مصادر مختلفة للخلايا الجذعية6.
أصبحت الخلايا الجذعية علاجا بديلا في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض السكري من النوع الأول، والذي يسببه فقدان خلايا بيتا. زرع IPCs هو الأسلوب الواعد الجديد للسيطرة على جلوكوز الدم في هؤلاء المرضى7. 10- وفي هذه المقالة، يعرض نهجان لإنشاء مراكز تشجيع الاستثمار، وهما بروتوكولات تعريف التكاملية وغير التكاملية. بروتوكول التعريفي تحاكي عملية نمو البنكرياس الطبيعية للحصول على IPCs ناضجة وظيفية8,9.
لهذه الدراسة، وتميزت hDPSCs من قبل قياس التدفق الخلوي للكشف عن علامة سطح MSC، وإمكانات التمايز متعدد الخطوط، وRT-qPCR لتحديد التعبير عن خاصية الجذعية وعلامات الجينات التكاثرية (البيانات غير مبين)8،9،10. تم حث hDPSCs نحو الاندوديرم النهائي ، بطانة البنكرياس ، الغدد الصماء البنكرياسية ، وخلايا بيتا البنكرياسية أو IPCs (الشكل 1) ، على التوالي7. للحث على الخلايا، تم استخدام نهج التعريفي من ثلاث خطوات كبروتوكول العمود الفقري. كان يسمى هذا البروتوكول بروتوكول غير تكاملي. في حالة البروتوكول التكاملي ، كان عامل النسخ البنكرياسي الأساسي ، PDX1، مفرط التعبير في hDPSCs يليه تحريض PDX1 مفرط التعبير في hDPSCs باستخدام بروتوكول تمايز من ثلاث خطوات. الفرق بين البروتوكول غير التكاملي والتكاملي هو التعبير المفرط عن PDX1 في البروتوكول التكاملي وليس في البروتوكول غير التكاملي. تمت مقارنة تمايز البنكرياس بين البروتوكولات التكاملية وغير التكاملية في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ هذا العمل وفقا لإعلان هلسنكي ووافقت عليه لجنة أخلاقيات البحوث البشرية، كلية طب الأسنان، جامعة شولالونغكورن. تم عزل DPSCs البشرية (hDPSCs) من أنسجة لب الأسنان البشرية المستخرجة من كل من premolars والأضراس بسبب مشاكل أسنان العقل. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى بموجب بروتوكول معتمد (HREC-DCU 2018/054).
1. بروتوكول التعريفي التكاملي
- إعداد متجه العدسة التي تحمل PDX1
- استخدام خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293FT للتغليف الفيروسي. ثقافة والحفاظ على هذه الخلايا في دولبيكو متوسط النسر المعدل (DMEM) تكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS), 1٪ L-الجلوتامين, و 1٪ مضاد حيوي مضاد للميكون.
- توليد PDX1-lentivirus ناقلات عن طريق العدوى المشتركة من 10 ميكروغرام كل من التعبئة والتغليف والمغلف plasmids و 20 ميكروغرام من البلازميد الجينات المستهدفة في خلايا HEK293FT باستخدام نظام تحويل فوسفات الكالسيوم، على سبيل المثال، psPAX2، pMD2. G، والإنسان pWPT-PDX111. تأكد من أن الخلايا هي التقاء 80٪ -90٪ خلال وقت العدوى.
- جمع المتوسطة التي تحتوي على جزيئات العدسية في 48 و 72 ساعة بعد transfection.
- تصفية الوسط المجمع من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر؛ تركيز الفيروسات مع مرشح الطرد المركزي في 100 كيلودا الاسمية خفض الوزن الجزيئي (NMWCO).
- التعبير المفرط PDX1
- استخدام مرور 3-5 hDPSC التي هي 70-80٪ التقاء. حاول حساب الخلايا التي تستخدم عداد خلايا. البذور 1 × 106 hDPSCs على طبق 60 ملم الأنسجة المعالجة بالاستزراع واحتضان بين عشية وضحاها.
- 24 ساعة في وقت لاحق، إضافة جزيئات الفيروس الطازجة التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.4 إلى تحويل الخلايا المعالجة مسبقا البوليبريني (4 ميكروغرام / مل البوليبرين، 30 دقيقة تحت 37 درجة مئوية و 5٪ CO2) في التكاثر المطلوب للعدوى (وزارة الداخلية). على سبيل المثال، في هذه الحالة، وزارة الداخلية المستخدمة هو 20. الحفاظ على الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد فترة العدوى 24 ساعة، تجاهل المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروسية. إضافة وسائل الإعلام ثقافة جديدة ومواصلة نمو الخلايا لمدة 48 ساعة. يتم الحفاظ على جميع الثقافات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- تحقق من مورفولوجيا المجمعة للخلايا المصابة قبل الشروع في خطوة التعريفي. يتم تأكيد نقل PDX1 من خلال تحليل التعبير الجيني(الشكل التكميلي 1).
ملاحظة: تحقق من مورفولوجيا الخلية تحت المجهر قبل المتابعة إلى الخطوات التالية. - حصاد والمضي قدما في بروتوكول التعريفي من ثلاث خطوات (الخطوة 1.3) كنهج التعريفي الميكروي.
- بروتوكول تعريفي من ثلاث خطوات
ملاحظة: أدى بروتوكول التعريفي من ثلاث خطوات في سلسلة من التمايز البنكرياس من hDPSCs إلى بطانة الرحم نهائي, بطانة البنكرياس / الغدد الصماء, والبنكرياس بيتا الخلايا / IPCs باستخدام المتوسط الخالي من المصل (SFM)-A, SFM-B, وSFM-C, على التوالي.- تجاهل وسيطة الثقافة، ثم اغسل hDPSCs المحولة بمحلول 1x الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS).
- إضافة 0.25٪ حل تريبسين-EDTA إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 دقيقة في 37 °C, 5٪ CO2.
- إضافة وسيط الثقافة لوقف نشاط التريبسين وتدفق بلطف الخلايا للحصول على تعليق خلية واحدة. عد الخلايا وaliquot 1 × 106 خلايا في كل أنبوب جمع.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 468 x g (قوة الطرد المركزي النسبي: RCF)، 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant وحفظ بيليه الخلية.
- Resuspend بيليه في 3 مل من أول وسيط التعريفي البنكرياس, أي, وسيطة خالية من المصل (SFM)-A. بذور الخلايا على لوحة ثقافة مرفق منخفضة (60 مم). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
ملاحظة: مراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب قبل الشروع في الخطوة التالية. - إزالة SFM-A وإضافة 3 مل من وسيط التعريفي الثاني، أي SFM-B. الحفاظ على الخلايا لمدة يومين المقبلة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: مراقبة مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب قبل الشروع في الخطوة التالية. - إزالة SFM-B وإضافة 3 مل من وسيط التعريفي الثالث، أي SFM-C. الحفاظ على الخلايا لمدة 5 أيام في حاضنة ثقافة الخلية الحفاظ على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تغيير المتوسطة كل 48 ساعة. مراقبة مورفولوجيا بعد 5 أيام.
ملاحظة: يتم استكمال كل وسيطة تعريفية بكواشف مختلفة كما هو موضح؛ SFM-A: 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)، 1x الأنسولين-نقل السيلينيوم (ITS)، 4 nM من أكتيفين A، 1 nM من بوتيرات الصوديوم، و 50 ميكرومتر من بيتا ميركابتوثانول؛ SFM-B: 1٪ BSA, 1x ITS, و 0.3 m التورين; وSFM C: 1.5٪ BSA، 1x ITS، 3 mM تورين، 100 nM من الببتيد مثل الجلوكاجون (GLP) -1، 1 mM نيكوتيناميد، و 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAAs). - تأكد من التحقق من مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب بعد كل خطوة. سوف تصبح الخلايا أكثر تجميعا وتطفو كمستعمرات.
- جمع مستعمرات الخلية لمزيد من التحليل. تحقق من مورفولوجيا المستعمرة وحجمها. إجراء تحليل التعبير علامة الجينات البنكرياس والتحليل الوظيفي (الجلوكوز حفز C-الببتيد إفراز المقايسة).
2. بروتوكول التعريفي غير التكاملي
ملاحظة: البروتوكول غير التكاملي هو البروتوكول الأساسي لتقديم IPCs مع عملية التعريفي من ثلاث خطوات كنهج التعريفي البيئة الدقيقة8،9.
- استخدام مرور 3-5 hDPSCs في 70٪ -80٪ التقاء.
- تجاهل ثقافة المتوسطة وغسل hDPSCs مع برنامج تلفزيوني 1x.
- إضافة 0.25٪ حل تريبسين-EDTA على الخلايا واحتضان لمدة 1 دقيقة في 37 °C, 5٪ CO2.
- إضافة وسيط الثقافة لوقف نشاط التريبسين وماصة بلطف الخلايا للحصول على تعليق خلية واحدة. عد الخلايا وaliquot 1 × 106 خلايا في كل أنبوب جمع.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 468 × ز (RCF)، 4 درجة مئوية، 5 دقائق. تجاهل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه في SFM-A والبذور على لوحة ثقافة مرفق منخفضة (60 ملم). زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 أيام. تحقق من مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب.
- إزالة SFM-A، إضافة SFM-B (اليوم 3) ومن ثم الحفاظ على الخلايا لمدة 2 أيام القادمة تحت 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- إزالة SFM-B، إضافة SFM-C (يوم 5) ومن ثم الحفاظ على الخلايا لمدة 5 أيام القادمة تحت 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. يتم تغيير SFM-C كل 48 ساعة.
ملاحظة: يتم استكمال كل وسيطة تعريفية بكواشف مختلفة كما هو موضح؛ SFM-A: 1٪ BSA, 1x ITS, 4 nM من activin A, 1 nM من بوتيرات الصوديوم, و 50 ميكرومتر من بيتا ميركابتوثانول; SFM-B: 1٪ BSA, 1x ITS, و 0.3 m التورين; وSFM C: 1.5٪ BSA، 1x ITS، 3 متر تورين، 100 nM من GLP-1، 1 mM نيكوتيناميد، و 1x NEAAs. - تأكد من التحقق من مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب بعد كل خطوة وفي اليوم العاشر.
ملاحظة: الخلايا سوف تصبح أكثر تجميعا ثم سوف تطفو كمستعمرات. - جمع مستعمرات الخلية لمزيد من التحليل. تحقق من مورفولوجيا المستعمرة وحجمها. إجراء تحليل التعبير علامة الجينات البنكرياس والتحليل الوظيفي (الجلوكوز حفز C-الببتيد إفراز المقايسة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه المقالة، تمت مقارنة نتائج كل من بروتوكولات التعريف. ويتضح المخططات من كل بروتوكولات التعريفي في الشكل 2A، C. في كلا البروتوكولين، تم إجراء التقييم تحت المجهر الخفيف، وتم تحليل الصور مع ImageJ. وتمكنت مركبات الهيدروفلوريك من تشكيل هياكل شبيهة بالمستعمرة منذ اليوم الأول للتحريض في كلا البروتوكولين التعريفيين. كان مورفولوجيا المستعمرة مستديرا وكثيفا ، وطفت جميع المستعمرات في أوعية الثقافة طوال فترة التعريفي(الشكل 2B، D). كما تم تحديد العدد الإجمالي للمستعمرة لكلا البروتوكولين؛ وأظهرت النتيجة أن مجموع عدد المستعمرة في حالة بروتوكول التعريفي التكاملي كان أعلى قليلا بالمقارنة مع بروتوكول التعريفي غير التكاملي(الشكل 2E). غير أن الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية. وعلاوة على ذلك، تم أيضا تقييم توزيع حجم المستعمرة في كل من بروتوكولات التعريفي(الشكل 2F). وفقا لنتائجنا ، تم تشكيل مستعمرات صغيرة إلى متوسطة الحجم عند الحث التكاملي ، والذي كان مهما للحد من النواة النخرية داخل المستعمرة.
تم إجراء تحليل علامة جين البنكرياس باستخدام RT-qPCR وفقا لمنشورنا الأخير10. وترد معلومات عن قائمة المبرمجين المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. تم تقديم قيمة مرنا كتعبير مرنا النسبية من قبل تطبيع إلى RNA ريبوسومال 18S والتحكم باستخدام صيغة 2(-ΔΔCt). وكشفت نتائج هذه الدراسة أن بروتوكول التعريفي التكاملي أثمر مستعمرات ذات تعبير عال عن علامات البنكرياس المتأخرة، بما في ذلك ISL-1و MAF-Aو GLUT-2 والأنسولين وGLP-1R (الشكل 3)، مما يشير إلى تمايز hDPSCs تجاه IPCs. كما وصف في هذه الدراسة التقييم الوظيفي لمركبات الكربون الهيدروفلورية - البيربونية(الشكل 4). تم استخدام إفراز C-peptide محفز للجلوكوز8،9 مقايسة باستخدام مجموعة ELISA. وأظهرت النتائج أن بروتوكولات التعريفي التكاملي وغير التكاملي أسفرت عن مستعمرات قادرة على إفراز الببتيد C.
الشكل 1:رسم تخطيطي لتمايز MSC تجاه IPCs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:مورفولوجيا، مجموع عدد المستعمرة، وتوزيع حجم مستعمرة من IPCs باستخدام بروتوكولين مختلفين. رسم تخطيطي للبروتوكول التكاملي عن طريق التعبير المفرط عن عامل النسخ الأساسي ، PDX1 ، يليه بروتوكول التعريفي ثلاثي الانحدار(A). مورفولوجيا hDPSCs المصابة في كل خطوة من خطوات التعريفي (ب). رسم تخطيطي غير تكاملي كبروتوكول العمود الفقري(C). مورفولوجيا hDPSC-IPCs باستخدام البروتوكول غير التكاملي(D). مجموع مستعمرة (ه) وتوزيع حجم مستعمرة (واو) من اثنين من بروتوكولات مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تحليل التعبير الجيني البنكرياسي لمركبات الكربون الهيدروفلورية -IPCs التي تم الحصول عليها من بروتوكولين مختلفين. تم تحليل التعبير مرنا من بطانة البنكرياس (PDX1 و NGN-3) (أ), علامات جزيرة البنكرياس (ISL-1, MAF-A, GLUT-2, و الانسولين) (B), وعلامة البنكرياس ذات الصلة (GLP-1R) (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:التحليل الوظيفي لمركبات الكربون الهيدروفلورية - البيربونية التي تم الحصول عليها من بروتوكولين مختلفين. تم تحديد إفراز الببتيد C في كل بروتوكول تحريضي ، بروتوكولات التكامل(A)وغير التكاملية(B)، من خلال فحص إفراز الببتيد C (GSCS) المحفز للجلوكوز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تحليل PDX1 مرنا بعد نقل PDX1. يظهر تحليل التعبير PDX1 مرنا بعد 48 ساعة من تحويل PDX1 في MOI 20 في hDPSCs. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| جينات | رقم الانضمام | التمهيدي الأمامي | طول | TM | |
| عكس التمهيدي | (bp) | (°C) | |||
| PDX-1 | NM_000209.4 | 5 ' – AAGCTCACGCGTGGAAAGG – 3 ' | 145 | 57.89 | |
| 5 ' – GGCCGTGAGATGTACTTGTG – 3 ' | 52.38 | ||||
| NGN-3 | NM_020999.3 | 5' – CGGTAGAAAGGATGACCT – 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' – GGTCTCTCGTCTTCCGAGG – 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 | NM_002202.2 | 5 ' – TCCCTATGTGTTGGGGGGG - 3 ' | 200 | 60.32 | |
| 5 ' – TTGGCGCATTGATCCCGTA – 3 ' | 60.39 | ||||
| MAF-A | NM_201589.3 | 5 ' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3 ' | 102 | 59.83 | |
| 5 ' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3 ' | 58.74 | ||||
| غلوتا-2 | NM_000340.1 | 5' – GGTTTGTAACTTATGCCTAAG – 3 ' | 211 | 52.25 | |
| 5' – مجلس التعاون الخليجيTAGTTATGCATTGCAG – 3' | 54.24 | ||||
| إنسولين | NM_000207.2 | 5 ' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3 ' | 215 | 64.34 | |
| 5 ' – TTCCACAATGCCACGCTCTGC – 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062.4 | 5 ' – TCGCTGTGAAAAGAGGAGGA – 3 ' | 189 | 59.38 | |
| 5' – TCACTCCCGCTCTGTGTG – 3' | 60.25 | ||||
| 18S | NR_003286.2 | 5 ' – GTGATGCCCTTAGGTCC – 3 ' | 233 | 55.04 | |
| 5 ' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3 ' | 54.86 | ||||
الجدول 1: معلومات التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يؤدي تحقيق إنتاج أعلى من الشركات عبر بروتوكول الإنترنت من الشركات ذات التصلب المتعدد دورا أساسيا في علاج مرض السكري. تعتمد الخطوات الحاسمة للبروتوكول التكاملي على جودة الخلايا التي ستستخدم في النقل ونوعية الخلايا المنقولة. بعض متطلبات الخلية التي يجب التحقق من تحويلها بنجاح هي ضمان صحة الخلية، وإدارة الخلايا المصرفية، والخلايا في حالة نشطة mitotically. علاوة على ذلك ، فإن مراقبة صلاحية الخلايا المنقولة تلعب أيضا دورا مهما. يحدث النقل الأقل نجاحا بسبب ضعف قدرة الخلايا المحفزة علىالبقاء 12. للبروتوكولات غير التكاملية ، يجب تحقيق المظهر المورفولوجي والمستعمرات العائمة لأنها مرتبطة بنضجتمايز البنكرياس 9.
من حيث تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتقنية بروتوكول التعريفي التكاملي ، يمكن الحصول على خلايا صحية وجيدة النوعية باستخدام الخلايا في المقاطع 3-5 و 70٪ -80٪ التقاء ، في حين يجب مراقبة جودة الخلايا المنقولة عن طريق التحقق بشكل روتيني من جودة الخلايا المحفزة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. هذه النتيجة هي في علاقة مع دراسة سابقة ذكرت أن العديد من العوامل التي تؤثر على كفاءة النقل تعتمد على صحة الخلية، والتقاء الخلايا، وعدد الممرات13. في هذه الدراسة، لا يزال البروتوكول غير التكاملي مع عملية تعريف من ثلاث خطوات يواجه قيودا، تتعلق بشكل رئيسي بحجم المستعمرة وتشكيل عدد المستعمرة. هذه النتيجة تتفق مع دراستنا السابقة8،9. للتغلب على هذه المشكلة، نقترح التحقق من جودة الخلايا وكذلك نوعية الأوعية ثقافة مرفق منخفضة.
والقيود المفروضة على هذه التقنية هي تعقيد بروتوكول الحث التكاملي، الذي يرجع إلى استخدام منصتين متتاليتين مختلفتين. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وزارة الداخلية لا يعني زيادة كفاءة النقل. وفي دراسة مماثلة باستخدام تحويل الفيروس العدسي، لم تتمكن وزارة الداخلية العليا من تحقيق كفاءة نقل أفضل. يقترح المؤلفون استخدام المساعد مثل كبريتات البروتامين14. وتتصل القيود المفروضة على استخدام البروتوكولات غير التكاملية بمسائل تقنية مثل تقنيات المناولة لإنتاج المستعمرة وحصادها وتفاوت أحجام وهياكل المورفولوجية للبلدان المنتجة.
كان عامل النسخ الأساسي ، PDX1، كبيرا ، وبالتالي كان له دور محتمل في التزام تحريض MSC تجاه IPCsالناضجة 15و16و17و18. تعديل بروتوكول العمود الفقري باستخدام PDX1-overexpressed hDPSCs تليها بروتوكول التعريفي من ثلاث خطوات كان يهدف أساسا إلى إنتاج عالية الغلة ناجحة من IPCs ناضجة وظيفية19،20،21. عكست نتائج هذا البروتوكول أن تحريض MSC نحو IPCs الناضجة يتطلب التعبير قبل الاندوديرميك عن PDX19. وأظهر التقييم المورفولوجي أنه يمكن الحصول على الهيكل ثلاثي الأبعاد غير المرفق للمستعمرات في كلا البروتوكولين باستخدام أوعية مرفق منخفضة. وكان هذا الهيكل المهم لتحقيق نضوج تمايز البنكرياس7,9,22,23. بالإضافة إلى ذلك ، وفقا لتقييم حجم المستعمرة ، أدى البروتوكول التكاملي إلى اتجاه إيجابي لإجمالي عدد المستعمرة وإنتاج مستعمرة صغيرة إلى متوسطة الحجم ، والتي يمكن أن تمنع نواة نخرية للمستعمرة. لذلك، سيكون من المفيد لمزيد من زرع7،19،21،24،25. تم مراعاة التنظيم التنظيمي لعلامات جين البنكرياس في المراحل المتأخرة(ISL-1 و MAF-Aو GLUT-2 والأنسولين وGLP-1R)في هذا البروتوكول. وكانت علامات الجينات البنكرياسية في المراحل المتأخرة في بروتوكول التعريفي التكاملي أعلى مقارنة بالبروتوكول الفقري. وكشف أن فرط التعبير عن PDX1 زاد عدد السلف البنكرياس, أي, يمكن تحقيق نتيجة أفضل من حيث تطور منتصف إلى مرحلة متأخرة من تطوير البنكرياس19,26,27,28. وعلاوة على ذلك، ولتوضيح وظيفة مراكز تشجيع الاستثمار، تم إجراء فحص ل GSCS. HDPSC-IPCs المنتجة من كلا البروتوكولين يفرز C-الببتيد، مما يشير إلى المستعمرات النشطة وظيفيا.
لتلخيص التطبيقات المستقبلية للتقنية المستخدمة في هذه الدراسة، كان كل من بروتوكولات تحريض البنكرياس قادرة على توليد IPCs في المختبر. من حيث إجمالي عدد المستعمرة ، وإنتاج مستعمرة صغيرة إلى متوسطة الحجم ، والتعبير عن علامة البنكرياس ، أظهر البروتوكول التكاملي اتجاها مفيدا لتشكيل IPC ، مما يدعم تطبيق MSC في علاجات السكري القائمة على الخلايا الجذعية للممارسات البشرية والبيطرية7و29و30و31و32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم SK وWR وQDL من قبل وحدة أبحاث الخلايا الجذعية البيطرية والهندسة الحيوية ، صندوق الوقف Ratchadaphiseksomphot ، جامعة شولالونغكورن. تم دعم TO و PP من قبل تشولالونغكورن التقدم الأكاديمي في مشروعها القرن2. وقد تم دعم CS من خلال منحة دعم بحثية من كلية العلوم البيطرية ، والتقدم الأكاديمي Chulalongkorn في مشروع القرن الثاني ، والخلايا الجذعية البيطرية ووحدة أبحاثالهندسة الحيوية ، وصندوق الوقف Ratchadaphiseksomphot ، وجامعة شولالونغكورن ، وصندوق البحوث الحكومية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care.
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B.
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
