Este protocolo descreve em detalhes todas as etapas envolvidas na obtenção de progenitores hematopoiéticos derivados de leucofilter e sua diferenciação in vitro e maturação em megacaiócitos portadores de proplatelet que são capazes de liberar plaquetas no meio da cultura. Este procedimento é útil para uma análise aprofundada dos mecanismos celulares e moleculares que controlam a megacaripoiese.
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Artigo de método
Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Diferenciação e Formação de Plaquetas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A expansão in vitro e a diferenciação de progenitores hematopoiéticos humanos em megacaiócitos capazes de alongar proplatelets e liberar plaquetas permite um estudo aprofundado dos mecanismos subjacentes à biogênese plaquetária. Os protocolos de cultura disponíveis são baseados principalmente em progenitores hematopoiéticos derivados de medula óssea ou sangue do cordão umbilical levantando uma série de preocupações éticas, técnicas e econômicas. Se já existem protocolos disponíveis para a obtenção de células CD34 a partir de sangue periférico, este manuscrito propõe um protocolo simples e otimizado para a obtenção de células CD34+ a partir de filtros de leucodepleção prontamente disponíveis em hemocentros. Estas células são isoladas de filtros de leucodepleção utilizados na preparação de produtos de transfusão de sangue, correspondendo a oito doações de sangue. Estes filtros devem ser descartados. Um procedimento detalhado para coletar progenitores hematopoiéticos identificados como células CD34+ desses filtros é descrito. O método para obter megacaiócitos maduros estendendo proplatelets enquanto discute sua evolução fenotípica também é detalhado. Finalmente, o protocolo apresenta um método calibrado de pipetação, para liberar eficientemente plaquetas que são morfologicamente e funcionalmente semelhantes às nativas. Este protocolo pode servir de base para avaliar compostos farmacológicos que atuam em várias etapas do processo para dissecar os mecanismos subjacentes e abordar os rendimentos da plaqueta in vivo.
Introdução
As plaquetas de sangue vêm de grandes células poliploides especializadas, os megacaiócitos (MK), que se originam de um processo de produção constante e afinado conhecido como megacariopoiesis (MKP). No ápice desse processo estão células-tronco hematopoiéticas que, em contato com o ambiente de medula óssea (citocinas, fatores de transcrição, nicho hematopoiético), poderão proliferar e diferenciar-se em progenitores hematopoiéticos (HP) capazes de se comprometer em direção à via megacariocítica, dando origem a MKs imaturos1. Sob a influência de várias citocinas, e em particular trombopoietina (TPO), que é a principal citocina de MKP; o MK passará....
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Protocolo
Foram obtidas amostras humanas de controle de doadores de sangue volonteer que deram consentimento por escrito recrutado pelo centro de transfusão de sangue onde a pesquisa foi realizada (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Todos os procedimentos foram registrados e aprovados pelo Ministério da Educação Superior e Pesquisa da França e registrados sob o número AC_2015_2371.Os doadores deram sua aprovação no formulário de consentimento do CODHECO AC- 2008 - 562, para que as amostras fossem utilizadas para fins de pesquisa. Os estudos em humanos foram realizados de acordo com a declaração de Helsinque.
1. Extração e seleção de células CD3....
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Resultados
Extração e seleção de células CD34+ de LRFs
Aqui, o método, derivado de Peytour et al.9,descreve a extração e seleção de células CD34+ de LRFs descartados disponíveis em bancos de sangue após a remoção de leucócitos. Seguindo o procedimento de retroafismo, geralmente 1,03 x 109 ± 2,45 x 108 células/LRF (Média±SEM; n = 155) são recuperados com uma viabilidade de 94,88 ± 0,10%(Figura 2A i). Após a sel.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método para produzir MK capaz de emitir proplatelets da HP derivada do sangue e para liberar plaquetas do meio de cultura. A HP é obtida da LRF, um subproduto dos bancos de sangue, usado para remover leucócitos contaminantes de produtos sanguíneos celulares e evitar reações adversas. Embora este método seja relativamente simples, alguns pontos merecem atenção especial.
A deposição da suspensão celular no meio gradiente de densidade (etapa 1.3.1) deve ser realizada su.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Tubos Trucount | BD Bioscience | 340334 | |
| Kit de Microesferas CD34 UltraPure, humano | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrífuga | Heraeus | Megafuge 1.OU | Ou material equivalente |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Ou material equivalente |
| Criotubos | Dutscher | 55002 | Ou material equivalente |
| Dextran de leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Ou material equivalente |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Ou material equivalente |
| Unidade de filtração Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Citômetro de fluxo | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserções | Fenwal | R4R1401 | Ou material equivalente |
| Capuz de fluxo laminar | Holten | NA | Produto arquivado |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Caneta Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Ou material equivalente |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Recipientes de transferência 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Filtros Pré-Separação (30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µ m PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Seringas 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Ou material equivalente |
| Filtros de seringa Millex 0,22µ M PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubos 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Ou material equivalente |
| Tubos 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Ou material equivalente |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Ou material equivalente |
Referências
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
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Reimpressões e permissões
