Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Resumo

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Resumo

Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) mtilato resíduos de arginina em uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis em inúmeros processos celulares. PrMTs podem agrupar-se de grupos de arginina guanidino mono ou dimetilato simetricamente ou assimetria. A enzima dessas proteínas é uma área complexa e intensamente investigada que requer quantidades miligramas de proteína recombinante de alta qualidade. O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) que emprega células de insetos Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) tem sido usado para triagem e produção de expressões de muitos PRMTs, incluindo PRMT 1, 2 e 4 a 9. Para testar simultaneamente a expressão de múltiplas construções dessas proteínas, incluindo domínios e fragmentos truncados, bem como as proteínas de comprimento completo, aplicamos métodos escaláveis utilizando pipetas multicanais ajustáveis e programáveis, combinados com placas e blocos de 24 e 96 poços. No geral, esses ajustes de método permitiram uma geração em larga escala de DNA bacmídeo, vírus recombinantes e rastreamento de expressão proteica. O uso de embarcações culturais com um alto volume de suspensão celular Sf9 ajudou a superar as limitações de espaço no gasoduto de produção para produção de proteínas em grande escala em lote único. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para a expressão eficiente e econômica dos PRMTs funcionais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais.

Introdução

Proteína arginina metiltransferases (PRMTs) resíduos de arginina metilato em uma moda dimetil monometo ou simétrica/assimétrica. As sequências repetitivas de RG/RGG/GRG são altamente preferidas pela maioria dos PRMTs e são encontradas em uma grande variedade de proteínas^1,2. Proteínas metiladas de arginina, como histones ou fatores de transcrição e fatores de emenda, regulam transcrição, emenda e estrutura de cromatina^3,4. O aumento do conhecimento da regulação diversificada da utilização do substrato e cofato, da rotatividade e da cinética dos PRMTs, bem como da geração de inibidores seletivos, lançaram luz mecanicista sobre essas enzimas e seus complexos^5,6. No entanto, nem todos os membros da família PRMT são estudados na mesma medida; por exemplo, prMT9 foi recentemente descoberto como um membro da família PRMT¹. Estudos de estrutura e função enzimática para essas proteínas requerem quantidades suficientes, muitas vezes miligramas, de proteína recombinante para estar disponível.

O sistema de expressão procariótica Escherichia coli (E. coli) é geralmente a primeira opção para a triagem de expressão utilizando múltiplos construtos para uma determinada proteína^7,8,9. No entanto, a expressão baseada em E. colinem sempre resulta em quantidades suficientes de proteínas PRMT em suas formas ativas, como temos observado em particular para PRMT5 e PRMT7 (veja abaixo). Assim, os PRMTs que não se expressavam em E. coli ou precisavam ser produzidos pelas máquinas de expressão eucariótica foram subclolados em vetores apropriados para a triagem de expressão no sistema vetorial alternativo de expressão baculovírus (BEVS). Enquanto e. coli expressou amostras de PRMT1, PRMT3 e PRMT8 têm sido amplamente utilizados para ensaios in vitro e cristalografia, outros PRMTs como PRMT5, que requer mep50 parceiro vinculativo de seu domínio de metiltransferase dupla, e PRMTs como PRMT7 e 9, necessitam de expressão celular inseto para obter quantidades suficientes de proteína ativa. No geral, os ensaios padronizados de metiltransferase de média produção padronizados para PRMT4, 5, 6, 7 e 9 utilizaram o BEVS em células^{insetos 6}. O sistema vetorial de expressão de baculovírus (BEVS) é uma plataforma versátil para produzir proteínas recombinantes que requerem o maquinário de expressão eucariótica que permite modificações pós-translacionais essenciais para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais^10,11,12. Vários BEVSs tornaram-se comercialmente disponíveis desde o primeiro uso relatado de baculovírus em 1983 para expressão proteica¹³. A maioria desses protocolos emprega diferentes estratégias para a transferência da expressão plasmid em células de insetos. Estes incluem Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Nosso protocolo é baseado no sistema mais utilizado no BEVS, o sistema Bac-to-Bac¹⁴, que foi projetado para transferir o gene/cDNA codificando a proteína de interesse (POI, aqui os PRMTs) para o genoma baculovírus mantido em uma cepa especializada de E. coli via transposição específica do local¹⁵.

Resumidamente, o vetor de transferência plasmida contendo o gene de interesse foi transformado em células competentes DH10Bac E. coli para gerar DNA bacmídeo viral recombinante. As células Sf9 aderentes foram então transfeinadas com DNA bacmídeo. Quatro a cinco dias após a transfecção, baculovírus recombinantes iniciais escondidos no meio de cultura celular foram recuperados e rotulados como o vírus P1. Os estoques de baculovírus P1 foram então utilizados para amplificação de vírus (ou seja, geração de estoques de baculovírus P2) e triagem de expressão proteica. Com base nos resultados de triagem de expressão, foram identificados e utilizados vírus P2 para a melhor construção de expressão da proteína para gerar culturas de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIS) para a produção de proteínas em larga escala. Aqui, descrevemos nossos protocolos detalhados e descrevemos a lógica por trás de nossas escolhas de reagentes e vasos culturais para apoiar nossa estratégia de desenvolver uma metodologia mais eficiente, econômica e escalável para obter quantidades suficientes de proteínas recombinantes desejadas.

Protocolo

NOTA: A visão geral das etapas do protocolo BEVS está descrita na Figura 1.

1. Geração de um DNA bacmídeo recombinante

1. Preparação de placas seletivas de ágar LB para transformação de DH10Bac
   1. Prepare placas de ágar LB contendo: 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetraciclina, 200 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL IPTG para selecionar para transformadores DH10Bac.
   2. Pese 25 g de caldo LB pré-xado e 13 g de Bacto Agar e coloque em frasco de 2 L. Leve o volume para 1 L com água destilada e autoclave por 15-30 min a 121 °C.
   3. Coloque um banho de água a 50 °C e esfrie a solução de ágar autoclaved no banho de água por 40- 60 min até que seja resfriado até 50-55 °C.
   4. À solução resfriada, adicione gentamicina a uma concentração final de 7 μg/mL, kanamycin a uma concentração final de 50 μg/mL, tetraciclina a uma concentração final de 10 μg/mL, Bluo-gal a uma concentração final de 200 μg/mL, e IPTG para uma concentração final de 40 μg/mL.
   5. Misture a solução de ágar e aliquot 7-10 mL do meio para cada placa de 60 mm usando uma pipeta de 50 mL. Deixe as placas sentarem à temperatura ambiente (2 h) para endurecer. Inverta, enrole e armazene a 4 °C. As placas contendo antibióticos estão estáveis por até 4 semanas.
2. Transformação do plasmídeo em células competentes DH10Bac E. coli
   1. Calcule o volume necessário de células competentes.
   2. Descongele células competentes no gelo, gire suavemente para baixo e resuspend de volta por toques suaves.
   3. Use uma pipeta de 12 canais para distribuir 4 μL das células em cada poço da placa PCR de 96 poços.
   4. Adicione ~ 0,3-0,5 μg de DNA plasmídeo recombinante às células competentes e misture suavemente tocando. Incubar a mistura no gelo por 10-15 min.
   5. Choque térmico da mistura em uma máquina PCR a 42 °C para 45 s. Esfrie no gelo por 2 minutos.
   6. Dispense 0,5 mL de soc médio para cada poço dos blocos de 96 poços (poço de 96 profundidades de 2,4 mL).
   7. Use uma pipeta de 12 canais para transferir a suspensão bacteriana transformada para o poço correspondente do bloco e cubra-a com uma folha de arpore.
   8. Coloque o bloco em uma incubadora de agitação a 37 °C com agitação média (205 rpm) por 4-5 h.
   9. Espalhe uniformemente 30-50 μL da cultura sobre a superfície da placa de ágar LB usando contas de vidro estéreis. Armazene o resto da cultura a 4 °C.
   10. Incubar as placas a 37 °C até que a cor das colônias azul/branca seja perceptível (40-48 h). Descarte a cultura quando o suficiente branco, grandes colônias são obtidas na placa.
   11. Para garantir que as colônias brancas contenham apenas DNA bacmídeo recombinante, re-listra uma colônia branca isolada em placas de ágar LB frescas contendo antibióticos, bluo-gal e IPTG para verificar o fenótipo.
   12. Incubar por 48 h a 37 °C.
   13. Escolha uma colônia branca verificada de uma placa re-listrada para a extração de DNA bacmídeo recombinante.
3. Isolando DNA bacmídeo recombinante
   1. Inocular uma única colônia branca isolada em 3 mL de meio LB suplementada com kanamycina de 50 μg/mL, 7 μg/mL gentamicina e 10 μg/mL tetraciclina em blocos de 24 poços (blocos de 24 poços fundo redondo) e tampa com uma folha de aeropore.
   2. Cresça a 37 °C durante a noite com tremor a 250 rpm.
   3. Centrifugar os blocos de 24 poços a 2.100 x g por 10 min. Decante o supernatante, inverta o bloco, e bata suavemente em um papel de tecido absorvente. Adicione 250 μL de solução 1 (solução de ressuspensão celular) a cada poço.
   4. Sele os blocos com almofadas de fita ou qualquer outro filme de vedação e coloque-os em uma plataforma de agitação a 75 rpm por 5-10 min. Verifique cada poço para garantir a lise celular adequada e resuspenque se necessário, usando uma ponta de 1 mL.
   5. Adicione 250 μL de solução 2 (solução de lise celular) a cada poço, sele os blocos e coloque em uma plataforma de agitação a 75 rpm por 30 s (para evitar a contaminação cruzada das amostras, não inverta blocos de 24 poços) incubando à temperatura ambiente por 4 minutos.
   6. Adicione 250 μL de solução 3 (solução de neutralização), sele os blocos e coloque na plataforma de agitação a 75 rpm por 30 s. Um precipitado branco espesso de proteína e DNA genômico E. coli se formará. Coloque a amostra no gelo por 10-15 minutos.
   7. Centrifugar por 60 min a 2.100 x g a 4 °C para emplagar firmemente o material de precipitação branca. Durante a centrifugação, rotule um novo tubo de microcentrifusagem e adicione 0,8 mL de isopropanol absoluto.
   8. Transfira suavemente o supernatante para o tubo contendo isopropanol, evitando qualquer material branco precipitado. Misture invertendo suavemente o tubo algumas vezes e, em seguida, coloque no gelo por 5 a 10 minutos. Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a -20 °C durante a noite.
   9. Centrifugar a amostra por 15 min a 14.000 x g a 4 °C. Retire o supernasal e adicione 0,5 mL de 70% de etanol a cada tubo. Inverta o tubo várias vezes para lavar a pelota. Centrífuga por 5 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. (Opcional: lavagem repetida)
   10. Leve amostras dentro da capa de fluxo laminar para garantir a esterilidade da preparação plasmida e remova o máximo possível do supernante.
       NOTA: A pelota pode ficar desalojada da parte inferior do tubo, por isso observe cuidadosamente a pelota ao descartar o supernatante.
   11. Seque a pelota dentro da capa de fluxo laminar por 15 a 20 minutos e dissolva o DNA em 50 μL de tampão de elução filtrada, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (certifique-se de que as pelotas não estão sobre-secas).
   12. Uma vez que o DNA bacmídeo recombinante é maior que 135 kb de tamanho, para evitar o corte de DNA, dissolver a pelota por toques suaves.
   13. Para verificar a presença do gene de interesse no DNA bacmídeo, configure a mistura de reação PCR em uma placa PCR de 96 poços.
   14. Prepare o mix pcr da seguinte forma: 1 μL de buffer, 0,2 μL (10 mM cada) de dNTPs, 0,1 μL de polimerase de DNA Taq, 0,1 μL (25 μM) de primers dianteiros e reversos (BACV2FWD: tattccggggttcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL de DNA bacmídeo e 8 μL de água.
   15. Realize a amplificação dos genes alvo com desnaturação inicial por 2 min a 95 °C, seguido por 25 ciclos de 94 °C para 30 s, 55 °C para 30 s e 72 °C para 1 min/kb.
   16. Termine a reação após uma prorrogação final por 7 min a 72 °C.
   17. Analise 10 μL do produto de amplificação em 1% (p/v) gel de agarose contendo solução de coloração de ácido nucleico por eletroforese.
   18. Armazene os DNAs de bacmid verificados a 4 °C.

2. Geração de estoques de baculovírus recombinantes

NOTA: Use células Sf9 em crescimento exponencial com uma viabilidade de 95% ou mais para qualquer etapa do protocolo de expressão do baculovírus, incluindo transfecção celular para geração de baculovírus, amplificação do volume de baculovírus, triagem de expressão proteica e produção de proteínas.

1. Transfecção de células Sf9 com DNA Bacmid e reagentes de transfecção (T.R.) como JetPrime ou X-tremeGENE 9.
   NOTA: A coloração do Trypan Blue e um hemócitometro podem ser usados para determinar a contagem de células viáveis e a viabilidade celular. Células não viáveis tomam a mancha e aparecem azuis sob o microscópio enquanto as células viáveis permanecem incomparáveis. Para calcular % viabilidade celular, uma contagem total de células é obtida (não manchada e manchada) e a contagem de células viáveis é dividida pela contagem total de células e multiplicada por 100.
   1. Diluir as células Sf9 em crescimento exponencial para uma densidade celular final de 4 x 10⁵ células/mL em mídia de insetos livres de soro e despeje no reservatório de reagentes estéreis.
   2. Use uma pipeta multicanal programável para semear 0,5 mL das células Sf9 diluídas em cada poço de uma placa de 24 poços.
   3. Rotule um poço da placa como controle (não transtrafecado) e use-o como controle para comparar as células transfeinadas e não transfectadas para avaliar possíveis sinais de infecções.
   4. Depois de semear as células nas placas, balance suavemente as placas várias vezes para garantir uma monocamada uniforme de células. Não gire as placas porque as células se aglomerarão no centro do poço.
   5. Incubar as placas a 27 °C por pelo menos 1h para permitir a fixação celular às placas de cultura.
   6. Misture bem o frasco de reagente de transfecção. Para cada transfecção, adicione 2 μL do reagente de transfecção a 100 μL do tampão de transfecção. Qualquer outro meio inseto não upplementado também pode ser usado. Deposite o reagente de transfecção diluído em um reservatório de reagente estéril e misture suavemente por 10 s.
   7. Usando uma pipeta de 12 canais, transfira 102 μL do reagente de transfecção diluída em uma placa estéril de 96 microwell.
   8. Transfira 10 μL de uma solução de 0,2 μg/μL de DNA bacmídeo recombinante para o poço correspondente de uma placa de microwell de 96 poços e misture sacudindo suavemente (tocando) a placa dos lados.
   9. Incubar a mistura de transfecção por 15-20 minutos para permitir a formação complexa.
   10. Usando uma pipeta de 6 canais ajustável projetada para transferência entre placas de 96 e 24 poços, adicione a mistura de transfecção nas células em poços correspondentes de placas de transfecção e incubar por 4-5 h a 27 °C.
   11. Balance suavemente as placas para frente e para trás várias vezes durante o tempo de incubação para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção sobre a monocamada celular.
   12. 4-5 h após a transfecção, adicione 1,5 mL de meio livre de soro de insetos complementado com 10% (v/v) final de soro bovino fetal inativado e antibiótico-antimíctico a 1% (v/v) volume final (100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, e 0,25 μg/mL de anfotericina B).
   13. Incubar as células em uma incubadora de 27 °C por 72-96 h. Balance suavemente as placas de transfecção uma vez por dia, quando possível.
   14. Procure sinais de infecção (SOI), evidentes em células transfeinadas a 72-96 h pós-transfecção(Figura 2). Tenha em mente que as células transfeinadas começarão a produzir o vírus e infectarão ainda mais a cultura; assim, procure os sinais de infecção.
       NOTA: Os sinais de infecção são mudanças estruturais nas células de insetos, como um aumento de 25-50% no diâmetro celular, núcleos celulares ampliados, forma uniformemente arredondada, perda de proliferação e adesão à superfície do prato de cultura, bem como diminuição da viabilidade celular(Figura 2. Células Sf9 infectadas e não infectadas).

3. Triagem de expressão proteica em pequena escala e amplificação do vírus

1. Infecção de células Sf9 com estoques de baculovírus P1.
   NOTA: 4-5 dias após a transfecção, os sinais de infecção devem ser evidentes nas células transfeccionadas quando comparados com as células de controle (não transfeccionadas) sob um microscópio invertido. Os baculovírus recombinantes iniciais secretados no meio de cultura celular devem estar prontos para coletar.
   1. Semente 2 x 10⁵ células Sf9 que crescem exponencialmente em mídia de insetos sem soro em cada poço das placas de 24 poços em um volume total de 2 mL para infecção com vírus P1 para amplificar o volume de vírus (resultando na geração dos vírus P2).
   2. Depois de colocar as células nas placas, balance suavemente as placas, usando movimento para frente e para trás para garantir uma monocamada uniforme. Não gire as placas porque as células se aglomerarão no centro do poço.
   3. Incubar as placas a 27 °C por pelo menos 1h para permitir a adesão celular à placa.
   4. Dispense 4 mL de células Sf9 a uma densidade de 3,5-4 x 10⁶ em meio livre de soro de insetos em cada poço de blocos de 24 poços para infectar com vírus P1 para a triagem de expressão proteica.
      NOTA: Rotule um poço das placas de 24 poços e blocos de 24 poços como controle e uso como um controle não infectado para comparação de células infectadas e não infectadas ao procurar SOI.
   5. Use um multicanal eletrônico programável para permitir a coleta simultânea de vírus P1 (etapa 2.1.13), infecção de células Sf9 recém-semeadas (etapa 3.1.1) e infecção das células de suspensão nos blocos de 24 poços (etapa 3.1.4) com 150 μL de vírus P1.
   6. Gire o resto dos estoques virais P1 coletados por 15 min a 17.970 x g,transfira-os para tubos de microcentrifuuagem e armazene no escuro a 4 °C.
   7. Balance suavemente as placas de 24 poços (passo 3.1.1) em um shaker recíproco para garantir uma distribuição uniforme dos vírus P1 adicionados sobre a monocamada celular; repita isso algumas vezes durante o tempo de incubação.
   8. Cubra os blocos de 24 poços com a cultura de suspensão de células Sf9 infectadas (passo 3.1.4) com uma folha de airpore.
   9. Incubar os blocos de 24 poços a 27 °C, tremendo a 245 rpm por 72-96 h.
   10. Procure por SOI dentro de 72-96 h após o tempo de infecção nas placas de 24 poços com vírus P2 (passo 3.1.1) e nos blocos de 24 poços (passo 3.1.4) com células infectadas para a triagem de expressão.
       NOTA: 4-5 dias após a infecção de células Sf9 com vírus P1, o SOI deve ser evidente nas células infectadas quando comparado com as células de controle não infectadas sob um microscópio invertido.
   11. Coletar vírus P2 de placas de 24 poços, centrífuga por 15 minutos a 17.970 x g,transfira-os para tubos de microcentrifuuge e armazene no escuro a 4 °C.
   12. Às 72-96 h pós-infecção, pulverize sobre os blocos de 24 poços com 70% de etanol, traga para a coifa de fluxo laminar e verifique a densidade e viabilidade celular em alguns poços pela coloração trypan azul.
   13. Prossiga para a purificação de proteínas se as células tiverem sinais de infecção e a viabilidade estiver próxima de 70-75% conforme avaliado pela coloração do Trypan Blue.
   14. Pelota as células centrifugando os blocos de 24 poços a 525 x g a 4 °C por 15 min. Descarte o supernasciente e suspenda completamente as pelotas em 1 mL de tampão de lise compreendendo 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% glicerol (v/v) e 1x coquetel inibidor de protease (coquetel inibidor de protease 100x compreende aprotinina 0,25 mg/mL, leupeptina 0,25 mg/mL, pepstatina A 0,25 mg/mL; E-64 0,25 mg/mL).
   15. Armazene a suspensão da célula a -80 °C para a purificação subsequente do teste (ver 3.2.2).
2. Purificação de proteínas da suspensão celular congelada em blocos de expressão de teste de 24 poços.
   1. Montagem do bloco de vinculação(Figura 3).
      1. Coloque 3 camadas sobrepostas de parafilm no topo do bloco de poços de 96 profundidades (poço de 96 profundidades de 2,4 mL).
      2. Coloque uma placa de filtro de 96 poços (microplaque filtro, 96-well, polipropileno com 25 μm de membrana de polietileno de peso molecular ultra alto) na parte superior do bloco de poços de 96 profundidades.
      3. Empurre para baixo a placa do filtro para fixar as pontas no parafilme para selar a placa do filtro do bloco de 96 poços de profundidade.
      4. Transfira 50 μL de resina Ni-NTA pré-equilibrada de 50% em cada poço da placa do filtro.
   2. Procedimento de expressão de teste
      1. Coloque a suspensão celular congelada (passo 3.1.15) presente em blocos de 24 poços em um banho de água na RT por 5-10 min, depois agite a 450 rpm por 20 minutos.
      2. Centrifugar os blocos de 24 poços a 3.275 x g por 15 min.
      3. Utilizando uma pipeta multicanal, transfira os lises limpos em uma placa de filtro contendo 50 μL de m slurry de resina Ni-NTA pré-equilibrada de 50% (passo 3.2.1.4) e sele a placa do filtro com um tapete de tampa de 96 poços (tapete de tampa de 96 poços, para uso com poço quadrado, 2 mL).
         NOTA: Use alguns elásticos para manter o bloco de ligação unido durante as etapas de incubação e centrifugação.
      4. Coloque o bloco de ligação assegurado por 45-60 min em uma rotadora em uma sala fria para incubar lises limpas com resina Ni-NTA.
      5. Após a incubação, levante cuidadosamente a placa do filtro e remova a camada de parafilm da superfície do bloco de poços de 96 profundidades (passo 3.2.1.1).
      6. Coloque de volta a placa do filtro em cima do bloco de poços de 96 profundidades e gire para baixo o bloco de ligação assegurado por 2 min a 235 x g.
      7. Wash bond Resina Ni-NTA 2x com 2 mL de tampão de lavagem compreendendo 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerol e 15 mM imidazol.
      8. Gire o bloco com tampão de lavagem cada vez por 5 min a 235 x g para garantir a remoção completa do líquido residual.
      9. Transfira a placa do filtro na parte superior da placa PCR de 96 poços contendo 10 μL de corante de carregamento 4x.
      10. Adicione 40 μL de tampão de eluição (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazole) a cada poço da placa do filtro e incubar por 5 min.
      11. Gire o bloco para as proteínas elute na placa PCR de 96 poços a 235 x g por 10 min.
      12. Sele a placa PCR de 96 poços com torneira resistente à alta temperatura e aqueça a 98 °C por 3 min.
      13. Carregue 15 μL de amostras de proteínas elu iludidas no buffer Laemmli padrão em gel SDS-PAGE de 4-20% ao lado da escada de proteína e execute o gel com buffer de corrida padrão contendo SDS.
      14. Manche o gel com azul Coomassie e despega com água. Analise os resultados da expressão do teste para identificar os melhores construtos expressos para produção em larga escala.

4. Preparações das células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIC) para a produção de proteínas

1. 4 dias antes do tempo de produção programado, divida exponencialmente as células Sf9 em um período final de densidade celular de 2 x 10⁶ células/mL em 125 mL / 250 mL / 500 mL Erlenmeyer vidro shake frascos com defletores em 50 mL / 100 mL / 200 mL de inseto soro-livre médio contendo 1% (v/v) antibiótico-antimíctico final.
2. Adicione 0,150 mL / 0,300 mL / 0,6 mL de vírus P2 apropriados, incubar células infectadas a 165 rpm em um agitador orbital com um curso de uma polegada e a uma temperatura mais baixa de 25 °C para retardar a divisão celular.
3. Aos 4 dias após a infecção, verifique as células sob um microscópio para SOI e prossiga para a produção se a viabilidade celular verificada com a mancha trypan azul estiver perto de 70-75%.

5. Preparações celulares Sf9 para produção de proteínas em larga escala

1. 4 dias antes do tempo de produção programado, calcule o volume necessário de células Sf9 para produção de proteínas em larga escala.
2. Semente 2 L de células Sf9 que crescem exponencialmente no Meio Livre de Soro de Insetos para uma densidade celular de 1 x 10⁶ células /mL em 2,8 L Fernbach agitam frascos.
3. Incubar frascos a 27 °C com agitação a 150 rpm.
   NOTA: Para evitar contaminação bacteriana na cultura celular Sf9, use gentamicina para uma concentração final de 10 μg/mL ou penicilina/estreptomicina a 50 U/mL e 50 μg/mL, respectivamente.

6. Infecção das células Sf9 com SCBIIS para a produção de proteínas em larga escala

1. Divida 2 L ou 4 L de células Sf9 que crescem exponencialmente no Meio Livre de Soro de Insetos para uma densidade celular final de 4 x 10⁶ células/mL em frascos de shake 2,5 L Tunair ou garrafas de reagente de 5 L.
2. Adicione 10-12 mL/L da cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIC).
3. Incubar a cultura infectada das células Sf9 em um agitador com 145 rpm na temperatura mais baixa de 25 °C (para diminuir a divisão celular) por 72-96 h.
4. Em 72 h pós-infecção, verifique as células sob um microscópio para SOI e avalie a viabilidade celular.
5. Normalmente, após cerca de 72 h pós-infecção, a viabilidade das células Sf9 cai para 70%-75% (medida com a mancha Trypan Blue). Colher células Sf9 infectadas em uma garrafa de polipropileno de 1 L por centrifugação a 900 x g por 15 min a 4 °C.
6. Resuspenque a pelota celular coletada de 1 L da cultura celular de produção com 20-25 mL de 1x PBS girando suavemente e transfira em tubos cônicos de 50 mL.
7. Gire a suspensão da célula a 900 x g por 15 minutos e descarte a solução PBS.
8. Resuspene a pelota de célula lavada com 20-25 mL do tampão de suspensão (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% glicerol, 1x coquetel inibidor de protease) e congelamento de flash em nitrogênio líquido; armazenar a −80 °C até a purificação.
   NOTA: Os procedimentos de purificação dos PRMTs foram descritos detalhadamente no artigo⁶publicado pelo SGC .

Resultados

Uma visão geral do protocolo BEVS está descrita na Figura 1. Múltiplos construtos de expressões de PRMTs, incluindo comprimento total, domínios e fragmentos truncados, foram gerados no Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) de acordo com estratégias internas com a tentativa de aumentar a taxa de sucesso para identificar proteínas solúveis e estáveis com um nível de expressão relativamente alto^7,9. Os leitores interessados são encorajados a rever as definições e a metodologia do SGC de projetar um "fragmento" como o segmento da sequência genética incorporada em um clone de expressão, "domínio" como domínio estrutural anotado pelo PFAM e "construção" como o fragmento clonado em um vetor de expressão, todos os quais foram descritos em detalhes em uma publicação anterior⁷. Os construtos de expressão de PRMTs apresentados neste protocolo são para a produção das proteínas com marca polihistidina clonadas no vetor pFBOH-MHL, que é um derivado do vetor pFastBac1. Na Figura 4,apresentamos a análise SDS-PAGE das construções solúveis marcadas por Sua marcadas de PRMT1, 2, 4-9 purificadas a partir de pelotas coletadas após 4 mL de produção em células Sf9 (etapa 3.1.4). O PRMT1 e o PRMT9 de comprimento completo (FL) não são apresentados neste gel, uma vez que o FL PRMT1 foi produzido a partir de E. coli, e FL PRMT9 produzido a partir de BEVS foi purificado pela Bandeira-tag⁶. As construções truncadas de PRMT1, FL PRMT4 e todos os construtos PRMT8 mostram um rendimento relativamente alto, mas elunatos proteicos contêm frações de contaminantes co-purificados. Esses construtos requerem maior otimização dos protocolos de purificação. Abordagens adicionais são, portanto, necessárias para melhorar a pureza dessas proteínas a partir de produções de escala, como a redução da quantidade de contas de níquel na fase da incubação com um lise esclarecido; aumento das concentrações de imidazol nos tampões de lavagem; decote da sua tag com protease TEV, seguido de aplicação em uma resina ni-affinity; e, etapas adicionais de purificação, como exclusão de tamanho e cromatografia de troca de íons. As construções de PRMT2 apresentam rendimento significativamente menor em comparação com outras proteínas e proteína PRMT2 de comprimento total acompanhada por uma forte faixa contaminante. A produção de escala e duas etapas de purificações, como o IMAC e a exclusão de tamanho, confirmaram um baixo nível de expressão para este construto, juntamente com a presença persistente do contaminante co-purificador para a proteína FL. Proteínas puras foram obtidas para o complexo PRMT5 produzido e purificado com seu parceiro obrigatório de ligação, o MEP50. A construção truncada de PRMT9 tem nível de expressão quase duas ou três vezes menor, perto de 1,5 mg/L, em comparação com outros PRMTs. No entanto, os estoques virais recombinantes desta construção têm sido utilizados para a produção de escala, difundindo cristais, e a estrutura foi resolvida para essa proteína juntamente com PRMT4, 6 e 7(Figura 5).

Para as produções de escala, os vírus P2 correspondentes foram utilizados para infectar a cultura de suspensão das células de insetos Sf9. Esta etapa gera 50/100/200 mL de células infectadas por baculovírus contendo células infectadas e vírus P3 no supernanato. Para a produção de proteínas em larga escala, 2 L de células Sf9 foram cultivadas em cada um dos frascos de shake de 2,8 L Fernbach a 150 rpm, 27 °C(Figura 6). No dia da produção, 2 L de células Sf9 (viabilidade celular > 97%) em 2,5 L Tunair shake flasks ou 4 L em 5 L garrafas de reagente foram diluídas para uma densidade celular de 4 x 10⁶/mL. Estas células foram infectadas diretamente com 10-12 mL/L de cultura de suspensão de células de insetos infectadas por baculovírus e incubadas a uma temperatura reduzida de 25 °C, a 145 rpm. A infecção do lote de produção diretamente com uma cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus reduziu significativamente as etapas laboriosas e demoradas na amplificação do volume do vírus, excluindo o manuseio extra das células infectadas, e evitou a redução da degradação de titer e vírus. A manutenção da cultura celular SF9 e a produção de escala têm sido feitas nos vasos de cultura com um alto volume de preenchimento para adotar uma produção de proteína em larga escala em um lote(Figura 6).

PrMT 4, 5 (em complexo com MEP50), 6, 7 e 9 proteínas produzidas a partir da plataforma de produção mediada por Baculovirus têm sido utilizadas para caracterização cinética e triagem de compostos inibidores no SGC⁶. Estruturas cristalinas foram resolvidas e depositadas no Protein Data Bank (PDB) para as formas de comprimento total ou truncada das proteínas PRMT 4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados no repositório plasmídeo addgene (Addgene é um parceiro distribuidor do SGC, https://www.addgene.org/) e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa (Figura 5).

Figura 1: Visão geral esquemática das etapas do processo de expressão do baculovírus Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Células Sf9 infectadas e não infectadas. Os sinais de infecção são mudanças estruturais nas células de insetos, como um aumento de 25-50% no diâmetro celular, núcleos celulares ampliados, forma uniformemente arredondada, perda de proliferação e adesão à superfície do prato de cultura, bem como uma diminuição na viabilidade celular. Barra de escala branca 200 μm. Os sinais de infecção aqui apresentados são os mesmos para as células transfeccionadas usando ambos os reagentes de transfecção, JetPrime e X-tremeGene 9. O exemplo em particular é para o reagente de transfecção JetPrime. (A) Células Sf9 não infectadas como controle. (B) Células Sf9 infectadas por baculovírus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Montagem de placa de ligação para purificação rápida de proteínas de expressão de teste. Consulte o texto para obter detalhes, passos 3.2.1-2 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados de triagem de expressão proteica. Resultados de triagem de expressão proteica da produção de proteína mediada por baculovírus em 4 mL de cultura de suspensão Sf9 infectados com vírus recombinantes P1 correspondentes para diferentes PRMTs e o complexo PRMT5-MEP50. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resumo das construções de expressão para PRMT4, 6, 7 e 9 utilizados para estudos de estrutura de cristal no Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). As estruturas cristalinas foram resolvidas e depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB) para as formas de comprimento completo ou truncadas de proteínas PRMT 4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados no repositório plasmídeo addgene e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa (Addgene é um parceiro distribuidor do SGC, https://www.addgene.org/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Manutenção de células de insetos Sf9 e produção de proteínas nos diferentes vasos da cultura: (A) 2,8 L Frasco de Fernbach para manutenção celular e produção de proteínas. O uso do volume de preenchimento de 72% aumenta a taxa de rendimento em 2,5 vezes em uma plataforma de agitação. (B) Os frascos de shake tunair (apenas 9 frascos de 10 são apresentados nesta imagem) e garrafas de reagente com um volume de preenchimento de 80% aumentam drasticamente a capacidade de produção da plataforma de agitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Uma das vantagens do BEVS em células de insetos centra-se na capacidade do maquinário de modificação pós-translacional para permitir modificações mais complexas, como fosforilação, miristoilação e glicosilação. Juntamente com a dobra altamente eficiente das proteínas mamíferas, essas modificações facilitam altas quantidades de proteína modificada e dobrada adequada para experimentos fisiologicamente relevantes a jusante¹⁶.

Aqui, descrevemos protocolos detalhados do BEVS enfatizando elementos críticos para a triagem de expressão bem-sucedida de múltiplas construções de proteínas PRMT e produção de proteína PRMT em larga escala na plataforma de expressão Baculovirus: 1) O uso de pipetas multicanais regulares, ajustáveis e programáveis para transferir os materiais biológicos entre 24 e 96 - placas e blocos de cultura de células bem nas fases de DNA bacmid e geração de vírus; uma coleção dos vírus recombinantes, amplificação dos volumes virais dos vírus recombinantes e preparação dos blocos de triagem de expressão proteica. 2) Reagentes de transfecção de alto desempenho e econômicos para a geração de vírus recombinantes. 3) Cultura de suspensão de células de insetos infectadas pelo baculovírus (SCBIIC) para produção de proteínas em larga escala. 4) Utilização de frascos de alto volume de enchimento 2,8 L Fernbach para manter a cultura de suspensão Sf9 e frascos de shake tunair de 2,5 L e garrafas de reagente de 5 L para a produção de proteínas em larga escala.

Considerações especiais e fundamentais para os passos de transformação e transfecção.
Embora um protocolo comercial recomende o uso de 100 μL de células competentes para uma transformação¹⁴, a eficiência de transformação das células comerciais DH10Bac E. coli é tão alta quanto 1 x 10⁸ cfu/ μg DNA, por isso usamos apenas 4 μL. Isso é suficiente para cada transformador obter colônias isoladas de recombinantes brancas para o isolamento do DNA bacmídeo. As células Sf9 aderentes na placa de transfecção de 24 poços foram semeadas a uma densidade celular de 2 x 10⁵ /mL em 0,5 mL de Mídia de Insetos Sem Soro. Este volume é suficiente para garantir até mesmo a cobertura da superfície de trabalho do poço. Ao mesmo tempo, não dilui muito a mistura de transfecção, o que aumenta a eficiência da transfecção. Reagentes de transfecção não são tóxicos para as células Sf9, e a troca de mídia não é necessária. Em vez de uma mudança de mídia, um adicional de 1,5 mL de mídia contendo 10% (v/v) FBS é adicionado na placa de transfecção a 4-5 horas após a transfecção para facilitar o crescimento celular. A eficiência de transfecção de ambos os reagentes de transfecção é alta. Ainda assim, com x-tremeGene 9, os sinais de infecção nas células transfeinadas (Figura 2) aparecem 10-12 h mais cedo do que com o reagente JetPrime, por isso escolhemos entre esses reagentes dependendo do cronograma de trabalho dos próximos passos nos protocolos, o que proporciona alguma flexibilidade no processo geral.

A triagem de expressão de teste proteico pode ser configurada com vírus P2 se a quantidade dos vírus recombinantes iniciais, coletadas da placa de transfecção e rotuladas como P1, for um fator limitante a ser usado para a triagem da expressão proteica.

Considerações ao passar de pequenos para grandes volumes culturais.
Historicamente, acreditava-se que o crescimento ideal das células requer um alto espaço aéreo na cultura de suspensão das produções de manutenção celular Sf9 e escala. No entanto, em 2014, foi relatado que o alto espaço aéreo em navios culturais é menos crítico do que se pensava¹⁷. Um vaso cultural criado usando velocidade de agitação adequadamente ajustada para o lançamento orbital da plataforma de agitação fornecerá transferência de oxigênio suficiente mesmo na cultura de suspensão de alto volume, criando e mantendo pequenas bolhas de ar por mais tempo. Com essa abordagem, as células de insetos disponíveis comercialmente podem ser cultivadas a uma velocidade de agitação mais alta dentro de uma faixa normal do tempo de duplicação das células sem sacrificar a alta viabilidade celular.

Assim, há 6 anos, começamos a aumentar o volume de cultura de suspensão em um frasco de agitação durante a manutenção celular e introduzimos um tipo diferente de vaso cultural para produção de proteínas, ajustando e monitorando as condições de agitação(Figura 6). Para estabelecer condições ideais nesses vasos culturais, monitoramos os parâmetros de cultura celular Sf9, como o tempo de duplicação celular, juntamente com viabilidade celular, tamanho e forma, estado de agregação e infectabilidade das células.

Por exemplo, para a manutenção celular Sf9, nos frascos de shake de 2,8 L Fernbach, nós cultura 2 L em vez de 0,8 L das células de suspensão Sf9 tremendo a 150 rpm a 27 °C e viabilidade celular na maior parte do tempo é perto de 99%, com células divisórias saudáveis em forma uniforme. Para a produção de escala, infectamos 4 L de células em garrafas de reagente 5 L tremendo em alta velocidade a 145 rpm a uma temperatura reduzida de 25 °C. As incubadoras mais usadas com uma plataforma de agitação embutida podem conter frascos de shake de 6 x 2,8 L ou garrafas de reagente 6 x 5 L, ou frascos de shake 10 x 2,5 L Tunair. Assim, a capacidade da plataforma de agitação, se enchermos frascos de shake Fernbach e garrafas de reagente a 1/3 versus o alto volume de enchimento dos vasos é de 4,8 L contra 12 L usando frascos de shake 2.8 L Fernbach e 10 L versus 24 L usando garrafas de reagente 5 L(Figura 6). A manutenção da cultura celular suspensa e a produção de escala nos navios de cultura com um volume de alto enchimento nos ajudaram a superar as limitações dos volumes de produção e adotar uma plataforma em larga escala. Assim, isso é altamente útil para laboratórios sem acesso a bioreatores e/ou espaço limitado nos gasodutos de produção.

Este protocolo poderia ser prontamente adaptado para a produção e purificação de construções proteicas com diferentes etiquetas de afinidade utilizando resinas apropriadas e modificando tampões de purificação, como foi descrito no artigo⁶ publicado pelo SGC para as proteínas de comprimento total marcadas por bandeiras do PRMT4, 7, 9, e do complexo PRMT5-MEP50 e PRMT6. Embora descrevamos um protocolo BEVS para a família prmt de proteínas, a mesma abordagem pode ser aplicada a qualquer outra família de proteínas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2.8L Nalgene  Frasco de Cultura Fernbach, Policarbonato,	Nalgene	29171-854	Para manutenção em larga escala de cultura em suspensão de células Sf9
Blocos de 24 Poços RB	Qiagen	19583	Para incubação de  4ml de suspensão  Células Sf9 para proteínas  triagem de expressão
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	Para análise SDS-PAGe das proteínas purificadas
50ml Reservatório de Reagente	Celltreat Scientific Products	229290	Reservatório usado para reagente de transfecção diluído  e suspensão de células Sf9
Tapete de tampa de 96 poços, para uso com poço quadrado, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Usado para cobrir bloco de 96 poços
Placa PCR de 96 poços	Ágar Eppendorf	30129300
Bacto	BD	214010	Para paltes de seleção de ágar LB
Folhas de fita Airpore	Qiagen	19571	Para cobrir blocos de 24 poços para triagem de
expressão de proteínasCentrífuga Allega X-15R	Beckman Coulter	392932
Antibiótico Antimicótico (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	não catalogado	interno	Bacmid DNA para produção de baculovírus
Bluo-Gal, 1g Placas de	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
, 24-Well, com tampa, fundo plano, estéril	Eppendorf	30722116	Placa tratada com cultura Cell
Resuspension Solution 0.5  L	Millipore Sigma	LSKCRS500	Para Célula de Extração de DNA Bacmid
Solução de Lise 0.5  L	Millipore Sigma	LSKCLS500	Para extração de DNA Bacmid
CELLSTAR  Placas de Cultura de Tecidos, 96 poços	Greiner Bio-One	655180	Para mistura de transfecção
ClipTip 1250, recarga de filtro, estéril	de 94420818	ThermoFisher Scientific	para  pipeta multicanal programável e ajustável
dNTP Mix (25 mM cada)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip  Pipeta Equalizadora Multicanal com Espaçamento Eletrônico de Ponta Ajustável, 15 a 1250 μ L	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Pipeta multicanal programável e ajustável
E4  Pipeta espaçadora ajustável XLS de 6 canais, 20-300 μ L	Ranin	LTS EA6-300XLS	Pipeta multicanal ajustável Ranin
Filtro microplaca, 96 poços, polipropileno, com 25 µ m membrana de polietileno de ultra alto peso molecular	Agilent	201005-100	Para purificação de proteínas em triagem de expressão
Kit de frasco defletor completo Tunair, 2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	Para produção de proteínas em larga escala em cultura em suspensão de células SF9
Gentamicina 10x10ml	BioShop	15750078
Soro Fetal Bovino Inativado por Calor	Wisent Biocenter	080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamina, 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	Meio de crescimento de células de insetos sem soro
InstantBlue, Mancha de Proteína Ultrarrápida	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	Para coloração de gel de proteína (SDS-PAGE)
Iptg, Ultra Puro, Livre de Dioxano, Min 99.5%	BioShop	IPT001.100
Reagente de Transfecção JetPRIME  Fornecido com  tampão jetPRIME	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	Para transfecção de células Sf9 para gerar baculovírus
Monossulfato de canamicina	BioShop	KAN201.100
Lb Caldo (Lennox), Pó Microbiano Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 poço profundo 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Usado nos procedimentos de triagem de transformação e expressão
Eficiência máxima DH10Bac Células competentes, 0,5 ml	Thermo Fisher	10361012	Células competentes para geração de DNA bacmid
Pipeta de 12 canais mLINE, ajustável 30 - 300 uL	Sartorius	Sartorius 725240	12 canais solução de neutralização de pipeta
, 0,5  L	Millipore Sigma	LSKNS0500	Para extração de DNA bacmid
New Brunswick  Innova 44R, 120V, órbita 2,5 cm (1 pol)	Eppendorf	M1282-0004	Incubadora Shaker para incubação de suspensão de células Sf9
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	Para purificação de proteínas
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyer Flask com Defletores, Corning  500ml	Pyrex	4444-500	Para cultura em suspensão de células Sf9
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask com Baffles, Corning  125ml	Pyrex	4444-125	Para cultura em suspensão de células Sf9
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask com Baffles, Corning  250ml	Pyrex	4444-250	Para cultura em suspensão de células
Sf9RedSafe  Nucleico  Ácido  Coloração  Solução	Froggabio	21141
RNase A, 0.9  mL	Millipore Sigma	LSKPMRN30	Para tampão de suspensão para extração de DNA bacmid
Roll & Cultive Esferas de Vidro Esféricas	MP Biomedicals	115000550	Para espalhar células bacterianas pela superfície de uma placa de ágar.
RT-LTS-A-300μ L-768/8 (pontas)	Ranin	30389253	Pontas para pipeta multicanal ranin
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Serum, Cultura de Células, Soro Fetal Bovino (Fbs), Hyclone, Caracterizado	Canadenselifesciences	SH3039602	Adição ao soro medim livre para  as células transfectadas
Células Sf9	Thermo Fisher	12659017	Inseto cells
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (Anteriormente GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Meio de crescimento de células de insetos livres de soro
Tape Pad	Qiagen	19570
Taq DNA Polymerase com ThermoPol Buffer - 2.000 unidades	New England Biolabs	M0267L
Tetraciclina Hcl	BioShop	TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solução	Gibco	15250061	Para avaliação da viabilidade celular
VITLAB  Frascos de Reagentes, PP com Tampas de Rosca, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	Para produção de proteína em larga escala em cultura em suspensão de células Sf9
VWR  Mini Incubadora Digital	VWR	10055-006	Incubadora para células Sf9 aderentes
VWR  Incubadora de Microplacas	VWR	97043-606	Incubadora para cultura em suspensão de células Sf9 em blocos de 24 poços
Placas de Petri VWR		VWR CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Reagente de Transfecção  1,0 M	Roche	6365787001	Para transfecção de células Sf9 para gerar baculovírus recombinante