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Manchando o Ca2+ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

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DOI:

10.3791/62526

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6 de novembro de 2021

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

Neste artigo

Resumo

Protoplastias isolados de células de celulose de maçã foram carregados com um reagente fluorescente de cálcio para detectar concentração de Ca2+ citoplasmática.

Resumo

O Cítosol Ca2+ desempenha um papel fundamental no desenvolvimento das plantas. A imagem de cálcio é o método mais versátil para detectar alterações dinâmicas no Ca2+ no citoplasma. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis de células polpais por hidrólise enzimática. Protoplastias isolados foram incubados com o reagente fluorescente de pequenas moléculas (Fluo-4/AM) por 30 min a 37 °C. As sondas fluorescentes mancharam com sucesso o Ca2+ citosol, mas não se acumularam em vacúolos. La3+, um bloqueador de canal Ca2+, diminuiu a intensidade de fluorescência citoplasmática. Esses resultados sugerem que o Fluo-4/AM pode ser usado para detectar alterações no Ca2+ citosolico na carne de fruta. Em resumo, apresentamos um método para isolar efetivamente protoplastos das células carníolas da fruta e detectar o Ca2+ carregando um reagente fluorescente de cálcio de pequenas moléculas no citoplasma das células de polpa.

Introdução

O Ca2+ desempenha um papel importante na transdução de sinal vegetal e no metabolismo1,2. Além disso, regula os traços de qualidade da fruta3,4, incluindo dureza, teor de açúcar e suscetibilidade a distúrbios fisiológicos durante o armazenamento5,6. O Ca2+ citoplasmado desempenha um papel importante na transdução de sinais e regula o crescimento e o desenvolvimento das plantas7. A perturbação da homeostase de cálcio celular pode induzir o poço amargo nas maçãs8, doença da mancha marrom nas peras9e podridão umbilical no tomate10, afetando a qualidade da fruta e causando severas perdas econômicas3,11. A imagem de cálcio tem resolução espacial e temporal suficiente e é um método importante para observar a dinâmica ca2+ em células vivas12,13.

Atualmente, existem dois métodos principais para a imagem intracelular de cálcio em células vivas: um emprega sondas fluorescentes químicas de pequeno porte molecular14, e o outro é o sensor de codificação genética (GECI)15,16. Dada a dificuldade de estabelecer um sistema transgênico estável em árvores frutíferas e desenvolvimento de frutas mais longas, o GECIS é inadequado para a imagem de fluorescência ca2+ frutífera.

Sondas fluorescentes de pequenas moléculas como o Fluo-4/AM têm uma vantagem particular: sua forma de éster AM (derivado de éster acetoximetila permeável celular) pode ser prontamente carregada em massa em células vivas sem a necessidade de transfecção, o que a torna flexível, rápida e não citotóxica17. Fluo-4/AM poderia ser carregado com sucesso no tubo de pólen de Pyrus pyrifolia18 e Petúnia,19, bem como em células de guarda20 e cabelo raiz de Arabidopsis21.

Atualmente, há poucos relatos sobre a coloração da fluorescência de cálcio das célulasde polpa 22. Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e controle de qualidade de frutos das árvores, como maçãs. As macieiras são reconhecidas mundialmente como uma espécie econômica importante, e as maçãs são consideradas um alimento saudável23. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis da polpa de frutas de maçã através da hidrólise enzimática e, em seguida, carregamos reagentes fluorescentes de pequenas moléculas no citoplasma para detectar Ca2+.

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Protocolo

1. Extração de protoplastia

  1. Prepare a solução básica: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morpholino)ácido estilesullfônico e 0,4 M D-sorbitol.
    NOTA: O pH da solução básica foi ajustado para 5,8 com tampão tris de 0,1 M, filtrado através de filtros solúveis em água de 0,22 μm e armazenado a 4 °C.
  2. Prepare a solução enzimática: Misture 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 e 0,5%(w/v) cellulase R-10 com a solução básica.
  3. Adicione 0,5 mL de solução enzimática em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Escolha uma maçã saudável e madura. Em seguida, corte a polpa em tamanho de 10 x 5 x 1 mm3 (Figura 1A-1C).
  4. Coloque as peças de polpa de frutas de maçã em um tubo centrífuga de 1,5 mL contendo solução enzimática e, em seguida, feche o tubo(Figura 1D).
  5. Incubar o tubo a 28 °C por 1h, tremendo a 70 rpm/min em um agitador no escuro.
  6. Lave os pedaços de polpa. Aspire toda a solução enzimática e adicione 0,5 mL da solução básica.
  7. Centrifugar a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente.
  8. Para obter uma suspensão protoplasta, aspire a solução a partir da parte inferior do tubo de centrífuga(Figura 1E).

2. Coloração de fluorescência de íons de cálcio de pequena molécula

  1. Prepare a solução de carregamento Fluo-4/AM com Fluo-4/AM de 2 mM, 20% F-127, e 10x salina tamponada com fosfato (PBS:80 mM Na2HPO4, 1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4e 26 mM KCI) em uma proporção de 1:1:2.
  2. Adicione 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM a 99 μL da suspensão protoplasta presente nos tubos de centrífugas de 1,5 mL. Certifique-se de que a concentração final do corante fluorescente é de 5 μM. Misture a solução e feche o tubo.
  3. TratamentoLa 3+: Prepare a solução 100 μM La3+ com 98 μL da suspensão protoplasta, 1 μL de 10 mM La3+e 1 μL de solução de carregamento Fluo-4/AM. Misture a solução e feche o tubo.
  4. Incubar por 30 min a 37 °C no escuro.
  5. Lave os protoplastos por centrifugação a 300 x g por 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL da solução e adicione 70 μL da solução básica.
  6. Incubar a suspensão do protoplasto a 37 °C por 30 min para desestárrio completamente.
  7. Aspire 15 μL da suspensão protoplasta e gotejamento em um slide.
  8. Observar sob um microscópio de fluorescência(Figura Suplementar S1).
    NOTA: Use uma câmera colorida com alta sensibilidade, ou seja, sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) com resolução de pixels de 3,45 μm.
  9. Selecione o canal GFP para imagem (20x). Coloque o brilho em 0,5.
    NOTA:A iluminação é de cubos de luz LED de intensidade ajustável com um conjunto integrado de filtro revestido de força. O comprimento de onda de excitação do Fluo-4/AM é de 490 nm.

3. Ensaio de viabilidade protoplasta

  1. Prepare a solução de estoque fluoresceína (FDA): Dissolver a FDA em acetona até que a concentração final seja de 1 mg/mL.
  2. Prepare a solução de trabalho da FDA com 1 μL da solução de estoque e 99 μL de acetona.
  3. Adicione 1 μL de solução de trabalho fda a 99 μL de suspensão protoplasta. Misture a solução pipetando para cima e para baixo e, em seguida, feche o tubo.
    NOTA: A concentração final da FDA é de 100 μg/L.
  4. Mancha à temperatura ambiente por 5 minutos no escuro.
  5. Prepare os slides e observe sob um microscópio de fluorescência.
  6. Selecione o canal GFP para imagem(Figura 1F).

4. Análise de imagem

  1. Analise as imagens adquiridas utilizando análise de imagens e software de planilha (por exemplo, Image-Pro Plus e Excel 2010).
  2. Selecione dois diâmetros verticais dos protoplastos para calcular a intensidade da fluorescência(Figura Suplementar S2). Medida a intensidade de fluorescência de todos os protoplastos em diferentes tratamentos foi medida. Para processamento final, use software de edição de fotos.

5. Análise estatística

  1. Realizar análise estatística utilizando software estatístico(Figura Suplementar S3). Os dados são apresentados em Média ± SD. O teste tdo aluno foi utilizado para analisar as diferenças entre os grupos experimentais.

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Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, utilizou-se o método enzimático para obter protoplastos viáveis da polpa (Figura 1). Alguns protoplastos tinham vacuoles, enquanto outros não. Enquanto os protoplastos não apresentaram fluorescência quando o indicador fluorescente Ca2+ não foi carregado neles. Quando o Fluo-4/AM foi carregado nos protoplastos, o citoplasma, mas não o vacuole, tornou-se fluorescente(Figura 2). Este resultado indicou que o Fluo-4/AM ...

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Discussão

Neste estudo, protoplastos viáveis foram obtidos por hidrólise enzimática. Observe que este método requer maçãs frescas. O presente protocolo permite o rápido isolamento de um grande número de protoplastos da polpa de frutas para uso em estudos de pesquisa. A aplicabilidade deste método não se limita a 'Fuji'; os protoplastos da polpa de maçã de 'Dounan' e 'Honey Crisp' também podem ser extraídos através do mesmo protocolo(Figura Suplementar S4). A solução protoplasta após a enzima contém detritos celula...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Melhoria da Variedade Agrícola da Província de Shandong (2019LZGC0007) e equipe de inovação de árvores frutíferas do moderno sistema de tecnologia da indústria agrícola de Shandong (SDAIT-06-05).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 vezes; solução salina tamponada com fosfatoSolarbioP1022PBS (solução tamponada com fosfato) é uma solução tampão de fosfato, que pode fornecer um ambiente iônico relativamente estável e capacidade tampão de pH. É uma solução salina tampão frequentemente usada em biologia para clonagem molecular e cultura de células. O pH é 7,4. 
Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônicoSolarbioM8010Tampão biológico
CaCl2· 2H2OSolarbioC8370O cloreto de cálcio di-hidratado é um produto químico branco ou cinza, principalmente na forma granular.
Celulase R-10Yakult HonshaMX7352Degrada as paredes celulares das plantas.
D-sorbitolSolarbioS8090Possui boas propriedades hidratantes, evita o ressecamento e evita a cristalização de açúcar, sal, etc.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 é um poliol surfactante não iônico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que foi considerado benéfico para promover a dissolução de corantes insolúveis em água e outros materiais em meios fisiológicos. 
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA é um substrato de esterase permeável por célula que pode servir como uma sonda de viabilidade que mede tanto a atividade enzimática, que é necessária para ativar sua fluorescência, quanto a integridade da membrana celular, que é necessária para a retenção intracelular de seu produto fluorescente. 
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201O indicador de cálcio fluorescente verde Fluo-4/AM é uma versão melhorada do indicador de cálcio Fluo-3/AM. O Fluo-4/AM carrega mais rápido e é mais brilhante na mesma concentração. Pode ser bem excitado com um laser de íons de argônio de 488 nm.
Microscópio de fluorescênciaThermo FisherEVOS Auto 2Observe a imagem de fluorescência.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351Degrada o tecido vegetal para separar células individuais.
TrisSolarbioT8060É amplamente utilizado na preparação de tampões em experimentos de bioquímica e biologia molecular.

Referências

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