Manchando o Ca2+ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

Resumo

Protoplastias isolados de células de celulose de maçã foram carregados com um reagente fluorescente de cálcio para detectar concentração de Ca²⁺ citoplasmática.

Resumo

O Cítosol Ca²⁺ desempenha um papel fundamental no desenvolvimento das plantas. A imagem de cálcio é o método mais versátil para detectar alterações dinâmicas no Ca²⁺ no citoplasma. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis de células polpais por hidrólise enzimática. Protoplastias isolados foram incubados com o reagente fluorescente de pequenas moléculas (Fluo-4/AM) por 30 min a 37 °C. As sondas fluorescentes mancharam com sucesso o Ca²⁺ citosol, mas não se acumularam em vacúolos. La³⁺, um bloqueador de canal Ca^2+, diminuiu a intensidade de fluorescência citoplasmática. Esses resultados sugerem que o Fluo-4/AM pode ser usado para detectar alterações no Ca²⁺ citosolico na carne de fruta. Em resumo, apresentamos um método para isolar efetivamente protoplastos das células carníolas da fruta e detectar o Ca²⁺ carregando um reagente fluorescente de cálcio de pequenas moléculas no citoplasma das células de polpa.

Introdução

O Ca²⁺ desempenha um papel importante na transdução de sinal vegetal e no metabolismo^1,2. Além disso, regula os traços de qualidade da fruta^3,4, incluindo dureza, teor de açúcar e suscetibilidade a distúrbios fisiológicos durante o armazenamento^5,6. O Ca²⁺ citoplasmado desempenha um papel importante na transdução de sinais e regula o crescimento e o desenvolvimento das plantas⁷. A perturbação da homeostase de cálcio celular pode induzir o poço amarg....

Protocolo

1. Extração de protoplastia

1. Prepare a solução básica: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morpholino)ácido estilesullfônico e 0,4 M D-sorbitol.
   NOTA: O pH da solução básica foi ajustado para 5,8 com tampão tris de 0,1 M, filtrado através de filtros solúveis em água de 0,22 μm e armazenado a 4 °C.
2. Prepare a solução enzimática: Misture 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 e 0,5%(w/v) cellulase R-10 com a solução básica.
3. Adicione 0,5 mL de solução enzimática em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Escolha uma maçã saudável e madura. Em seguida, corte a polpa em tamanho de 10 x 5 x 1 mm³ (Figura 1A

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, utilizou-se o método enzimático para obter protoplastos viáveis da polpa (Figura 1). Alguns protoplastos tinham vacuoles, enquanto outros não. Enquanto os protoplastos não apresentaram fluorescência quando o indicador fluorescente Ca²⁺ não foi carregado neles. Quando o Fluo-4/AM foi carregado nos protoplastos, o citoplasma, mas não o vacuole, tornou-se fluorescente(Figura 2). Este resultado indicou que o Fluo-4/AM .......

Discussão

Neste estudo, protoplastos viáveis foram obtidos por hidrólise enzimática. Observe que este método requer maçãs frescas. O presente protocolo permite o rápido isolamento de um grande número de protoplastos da polpa de frutas para uso em estudos de pesquisa. A aplicabilidade deste método não se limita a 'Fuji'; os protoplastos da polpa de maçã de 'Dounan' e 'Honey Crisp' também podem ser extraídos através do mesmo protocolo(Figura Suplementar S4). A solução protoplasta após a enzima contém detritos celula.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 vezes; solução salina tamponada com fosfato	Solarbio	P1022	PBS (solução tamponada com fosfato) é uma solução tampão de fosfato, que pode fornecer um ambiente iônico relativamente estável e capacidade tampão de pH. É uma solução salina tampão frequentemente usada em biologia para clonagem molecular e cultura de células. O pH é 7,4.
Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico	Solarbio	M8010	Tampão biológico
CaCl2· 2H2O	Solarbio	C8370	O cloreto de cálcio di-hidratado é um produto químico branco ou cinza, principalmente na forma granular.
Celulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrada as paredes celulares das plantas.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	Possui boas propriedades hidratantes, evita o ressecamento e evita a cristalização de açúcar, sal, etc.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 é um poliol surfactante não iônico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que foi considerado benéfico para promover a dissolução de corantes insolúveis em água e outros materiais em meios fisiológicos.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA é um substrato de esterase permeável por célula que pode servir como uma sonda de viabilidade que mede tanto a atividade enzimática, que é necessária para ativar sua fluorescência, quanto a integridade da membrana celular, que é necessária para a retenção intracelular de seu produto fluorescente.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	O indicador de cálcio fluorescente verde Fluo-4/AM é uma versão melhorada do indicador de cálcio Fluo-3/AM. O Fluo-4/AM carrega mais rápido e é mais brilhante na mesma concentração. Pode ser bem excitado com um laser de íons de argônio de 488 nm.
Microscópio de fluorescência	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe a imagem de fluorescência.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrada o tecido vegetal para separar células individuais.
Tris	Solarbio	T8060	É amplamente utilizado na preparação de tampões em experimentos de bioquímica e biologia molecular.