A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.
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Artigo de método
Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido
Neste artigo
Resumo
Resumo
A atividade cerebral, os sinais eletroquímicos passados entre os neurônios, é determinada pelos padrões de conectividade das redes neuronais, e pela morfologia dos processos e subestruturas dentro desses neurônios. Como tal, muito do que se sabe sobre a função cerebral surgiu ao lado de desenvolvimentos em tecnologias de imagem que permitem uma visão mais aprofundada sobre como os neurônios são organizados e conectados no cérebro. Melhorias na limpeza tecidual permitiram imagens de alta resolução de fatias cerebrais grossas, facilitando a reconstrução morfológica e análises de subestruturas neuronais, como arbóreos dendráticos e espinhas. Em conjunto, os avanços no software de processamento de imagens fornecem métodos de análise rápida de grandes conjuntos de dados de imagens. Este trabalho apresenta um método relativamente rápido de processamento, visualização e análise de fatias grossas de tecido neural rotulado em alta resolução usando clareira de tecido CLARITY, microscopia confocal e análise de imagem. Este protocolo facilitará os esforços para entender os padrões de conectividade e morfologias neuronais que caracterizam cérebros saudáveis, e as mudanças nessas características que surgem em estados cerebrais doentes.
Introdução
Compreender a organização espacial, padrões de conectividade e morfologia de estruturas biológicas tridimensionais complexas é essencial para delinear as funções de células e tecidos específicos. Isso é especialmente verdadeiro na neurociência, na qual um tremendo esforço tem sido dedicado à construção de mapas neuroanatomômicos de alta resolução do sistema nervoso central1,2. O exame minucial dos neurônios que compõem esses mapas produz morfologias variadas, com conexões e locais que refletem a função desses diversos conjuntos de neurônios3,4. Além di....
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Protocolo
O protocolo a seguir segue todas as diretrizes de cuidados com animais para o Baylor College of Medicine.
1. Dissecção e preparação de tecidos
- Eutanize o rato com uma overdose de isoflurane colocando o rato em um recipiente fechado com uma toalha encharcada em isoflurane (ou por outros meios aprovados pelo IUCAC).
- Perfumar o animal transcardialmente usando uma agulha de 25 G com 10 mL de PBS gelado, seguido por 10 mL de 4% pfa.
- Dissecar a região cerebral (ou tecido) de interesse.
- Coloque o tecido dissecado em 4% pfa durante a noite a 4 °C. A fixação adequada é a chave para este protocolo. Não pule ou....
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Resultados
Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise. Os dados coletados (Figura 6A) refletem que o neurônio 2 tem uma estrutura dendrítica maior com maior densidade de espinhas. Como um todo, os dados sugerem que o neurônio 2 tem uma estrutura dendrítica mais complexa em comparação com o neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão de Sholl, que a.......
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Discussão
Antes do advento das técnicas contemporâneas de limpeza de tecidos, o estudo da morfologia neuronal consistia em seção intensiva de tempo, imagem e reconstrução de seções muito finas adjacentes. O uso de limpeza de tecido eletroforético em combinação com imagens confocal fornece uma visão desobstruída da morfologia neuronal completa. De árvores dendríticas intactas, até o menor ataque sináptico, a imagem e a morfologia neuronal quantificada nunca foram tão viáveis.
A preparação do tecido cereb.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar no momento.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao núcleo viral NRDDC no Jan e Dan Duncan Neurological Institute por produzir os AAVs e lentivírus usados nesses experimentos. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine pela criação de ratos e manutenção geral dos camundongos utilizados. Gostaríamos de agradecer à American Heart Association por seu apoio sob o prêmio número 20PRE35040011, e BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists por seu apoio (PJH). Finalmente, gostaríamos de agradecer à Logos por fornecer ao nosso laboratório o sistema de limpeza de tecidos eletroforéticos Logos X-Clarity.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo Cônico de 15 mL | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Agulha | BD | 305127 | |
| 30% de Acrilamida (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| Tubo Cônico de 50 mL | Thermo Scientific | 339653 | |
| Solução de Limpeza de Tecido Eletroforético | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Logos | C1310X | ||
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldeído 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 garrafas/caixa | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Logotipos do Sistema de Polimerização | C20001 | ||
| X-CLARITY Sistema de Limpeza de Tecidos II | Logotipos | C30001 |
Referências
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions o....
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Reimpressões e permissões
