Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente desenvolvido pelo Laboratório Henikoff para capturar os fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o ^genoma5. Quando comparado ao ChIP, a CUT&Tagcan gera bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento ^{simplificado3}. Até o momento, foram estabelecidos métodos para análise de regiões de cromatina com modificações específicas de histona utilizando CUT&Tag em células ^animais4,5. Especificamente, cut&tag de célula única (scCUT&Tag) também foi desenvolvido com sucesso para tecidos humanos e ^células6. No entanto, devido à complexidade da parede celular e metabólitos secundários, a CUT&Tag ainda é tecnicamente desafiadora para tecidos vegetais.

Anteriormente, relatamos um protocolo CUT&Tag usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allotetraploid4. Para demonstrar a eficiência do isolamento dos núcleos e da captura de DNA utilizando tecido vegetal, o procedimento de criação de perfil é apresentado aqui. Os principais passos incluem isolamento de núcleos intactos, incubação in situ com o anticorpo para modificação de cromatina, incubação transposase, integração adaptadora e preparação da biblioteca de DNA. A solução de problemas se concentra na preparação da biblioteca CUT&Tag para o isolamento dos núcleos da planta e controle de qualidade.

Neste estudo, apresentamos uma estratégia refinada da CUT&Tag para plantas. Não só fornecemos um protocolo passo-a-passo para o perfil H3K4me3 em folhas de algodão, mas também fornecemos uma metodologia otimizada para o isolamento dos núcleos vegetais, incluindo a estratégia de seleção da concentração de detergente para a lise celular adequada e a estratégia de filtragem dos núcleos. Passos detalhados com comentários críticos também estão incluídos neste protocolo atualizado.

1. Prepare soluções de transposase e estoque (Dia 1)

NOTA: Nesta parte, os adaptadores de oligonucleotídeos são complexos com transposase Tn5 para fazer transposase ativa.

1. Primers diluídos (primer A, primer B e primer C) a 100 μM de concentração usando o buffer de renascimento (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (consulte a Tabela 1 para obter informações sequenciais de primers e Tabela 2 para as receitas para soluções de trabalho). Armazenar a -20 °C até usar.
2. Configure as seguintes reações em tubos PCR: Reaction 1 (adaptador AB), 10 μL de 100 μM primer A, 10 μL de 100 μM primer B; Reação 2 (adaptador AC), 10 μL de 100 μM primer A, 10 de μL 100 μM primer C.
3. Enrilhar os adaptadores na máquina PCR utilizando o seguinte programa: tampa de calor (102 °C), 75 °C para 15 min, 60 °C para 10 min, 50 °C para 10 min, 40 °C para 10 min, 25 °C por 30 min.
   NOTA: Os adaptadores são moléculas de DNA parcialmente duplas (concentração = 50 pmol/μL).
4. Configure a seguinte reação em um tubo de centrífuga de 1,5 mL: 10 μL de transposase pA-Tn5 (500 ng/μL ou 7,5 pmol/μL), 0,75 μL do adaptador AB (50 pmol/μL), 0,75 μL do adaptador AC (50 pmol/μL), 7 μL de tampão de acoplamento. Pipeta 20x suavemente para misturar bem e incubar a 30 °C em um banho de água por 1h. A concentração final de transposase = 4 pmol/μL. Armazenar a -20 °C até usar.
   NOTA: Molar razão do adaptador AB: adaptador AC: transposase = 0,5:0.5:1.
5. Prepare as soluções de estoque de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 2 e autoclave ou filtre as soluções de estoque para esterilizar.
6. Autoclave e esterilizar tesouras, papel filtro, uma peneira de aço inoxidável, uma argamassa, pilões, etc.

2. Isolamento dos núcleos (Dia 2)

1. Pré-esfrie a centrífuga a 4 °C. Para cada 1 g do material inicial (folhas de algodão), prepare 25 mL de tampão de isolamento nuclear A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampão de isolamento nuclear B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampão de lavagem nuclear (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,5 mM espermidina, coquetel inibidor protease 0,1%), 1 mL de tampão de anticorpos (50 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1 mg/mL BSA, coquetel inibidor de prote 0,1%, 0,05% w/vonina). Deixe os tubos sentarem no gelo até usar.
2. Triture folhas frescas (~1 g) em nitrogênio líquido para um pó fino e transfira para um tubo de 50 mL contendo 25 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado A.
3. Misture a solução tampão suavemente e incuba o tubo no gelo por 5 minutos com agitação suave para dispersar o material uniformemente.
4. Centrifugar por 5 min a 500 rcf a 4 °C para formar a pelota celular.
5. Decante o supernaspe e resuspenque a pelota com 20 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado B complementado com 0,5% Triton X-100. Inverta o tubo suavemente para resuspensar a pelota completamente.
   NOTA: O buffer de isolamento nuclear B de 20 mL é aplicável para 1 g de material de partida, e este volume pode ser dimensionado de acordo.
   1. Realize um ensaio piloto para testar o efeito da concentração em série de Triton X-100 (por exemplo, 2 mL tampão de isolamento nuclear B, cada um com 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1% Triton X-100 para 100 mg de tecidos triturados). A concentração apropriada de Triton X-100 é indicada por um acúmulo de núcleos brancos/cinzentos na parte inferior e um supernatante verde escuro após lise e centrifugação em baixa velocidade (< 500 rcf por 4 min).
6. Filtre o lise celular resultante com uma combinação de duas peneiras: uma peneira de 500 malhas na parte superior para remover os detritos de tecido maiores e uma peneira de 1000 malhas na parte inferior para coletar os núcleos.
   NOTA: Escolha um tamanho de malha adequado para as peneiras, dependendo do tamanho dos núcleos das plantas.
7. Use papel filtro estéril na parte de trás da peneira para absorver detritos de pequenas células no lise.
8. Transfira os núcleos restantes contendo liseto na parte superior da peneira de 1000 malhas para quatro tubos frescos de centrífuga de 1,5 mL.
9. Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C para coletar os núcleos.
10. Remova o máximo possível do supernatante usando uma ponta de pipeta e lave a pelota com tampão de lavagem nuclear.
11. Adicione 800 μL do tampão de lavagem nuclear e inverta os tubos suavemente para resuspensar a pelota. Gire o tubo novamente por 4 min a 300 rcf a 4 °C.
12. Realize um total de 3 lavagens.
13. (Opcional) Imagem dos núcleos sob um microscópio para coloração DAPI.
    1. Transfira 100 μL de suspensão de núcleos no tampão de lavagem nuclear a partir da etapa 2.11. para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 900 μL de tampão de lavagem nuclear e 2 μL de solução de estoque DAPI (1 mg/mL) para fazer uma concentração final de trabalho de 2 μg/mL para DAPI. Incubar o tubo no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente.
    2. Após a coloração, centrífuga por 4 min a 300 rcf a 4 °C para coletar os núcleos.
    3. Remova o máximo possível do supernatante usando uma ponta de pipeta. Lave 3 vezes com 800 μL do tampão de lavagem nuclear.
    4. Remova o máximo possível do supernasciente e resuspenja os núcleos com 100 μL de tampão de lavagem nuclear.
    5. Imagem dos núcleos sob um microscópio de fluorescência usando o canal DAPI.
14. Misture os núcleos de dois tubos (~50 μL de núcleos em volume em cada tubo de 1,5 mL). Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o máximo possível do buffer restante usando uma ponta de pipeta.

3. Incubação de anticorpos

1. Resuspend cada 50 μL de núcleos em um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de anticorpos.
2. Configure as seguintes reações em tubos de 1,5 mL: duas réplicas biológicas de grupos de controle de IgG com 150 μL de núcleos (~ 1 μg de cromatina) e 2 μL de IgG (1 mg/mL) em cada tubo, duas réplicas biológicas de grupos de ensaio H3K4me3 com 150 μL de núcleos e 2 μL de anticorpo anti-H3K4me3 (1 mg/mL) em cada tubo.
3. Misture a solução suavemente e deixe os tubos em um agitador horizontal para hibridização durante a noite a 4 °C e 12 rpm.
4. Pré-esfrie a centrífuga a 4 °C. Prepare um tampão de lavagem fresco de 50 mL de imunoprecipitação (IP) (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, ,0,05% w/v digitonin) em um tubo de centrífugas de 50 mL. Deixe o tubo sentar no gelo.
5. Centrifugar os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o tampão de anticorpos de cada tubo.
6. Adicione 800 μL de tampão de lavagem IP em cada tubo e misture delicadamente. Deixe os tubos em um agitador horizontal por 5 minutos em temperatura ambiente e 12 rpm.
7. Após a lavagem, centrifufique os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o supernatante usando uma ponta de pipeta.
   NOTA: Para evitar qualquer perturbação da pelota dos núcleos, deixe ~50-80 μL do buffer com os núcleos.
8. Repetição passos 3.6.-3.7. mais duas vezes.
9. Após a terceira lavagem, centrífuga por 2 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o buffer restante o máximo possível.

4. Incubação transposase

1. Faça fresco 1 mL de tampão de incubação transposase (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, 0,05% w/v digitonin) misturando 1 mL do tampão de lavagem IP com 30 μL de 5 M NaCl.
2. Para preparar o mix de transposase Tn5 para incubação, adicione 1 μL da transposase a cada 150 μL do tampão de incubação transposase.
   NOTA: Prepare o mix de solução transposase primeiro de acordo com o número de reações e, em seguida, adicione uma alíquota de 150 μL a cada tubo.
3. Resuspend os núcleos com 150 μL de solução transposase.
4. Deixe os tubos em um agitador horizontal a 12 rpm por 2-3 h em temperatura ambiente e misture a cada 10-15 min.
5. Após a incubação da transposição, centrifugar os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o tampão de incubação transposase em cada tubo.
6. Lave os tubos com tampão de lavagem IP. Para isso, adicione 800 μL de tampão de lavagem IP em cada tubo, misture suavemente e deixe os tubos em um agitador horizontal a 12 rpm por 5 min à temperatura ambiente.
7. Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o supernatante usando uma ponta de pipeta.
8. Repetição passos 4.6.-4.7. mais duas vezes.
9. Após a terceira lavagem, centrífuga por 2 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o buffer restante o máximo possível.

5. Tagmentação

1. Faça recentemente 2 mL do buffer de tagmentação (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, 10 mM _MgCl2, 0,05% w/v digitonin) misturando 2 mL de tampão de lavagem IP com 60 μL de 5 M NaCl e 20 μL de 1 M _MgCl2.
2. Resuspenda os núcleos com 300 μL de tampão de tagmentação.
3. Misture a solução e incuba em um banho de água de 37 °C por 1h para tagmentação.
4. Pare a tagmentação com 10 μL de 0,5 M EDTA (concentração final ~15 mM) e 30 μL de 10% SDS (concentração final 1%).

6. Extração de DNA e construção de biblioteca NGS

1. Adicione 300 μL de tampão de extração de DNA CTAB conforme ^descrito7. Incubar os tubos em um banho de água de 65 °C por 30 minutos. Inverta para misturar cada ~10 min.
2. Adicione 600 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamyl (25:24:1) a cada tubo. Homogeneizar.
3. Pré-centrifugar os tubos de gel de bloqueio de fase por 2 min a 13.000 rcf a 4 °C. Transfira a solução acima para tubos de gel de bloqueio de fase.
4. Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
5. Transfira o supernatante (~600 μL) para um novo tubo de 1,5 mL.
6. Adicione 600 μL de clorofórmio a cada tubo. Homogeneizar.
7. Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
8. Transfira o supernante (~600 μL) para um novo tubo de 1,5 ml.
9. Adicione 12 μL de 100% de etanol e 2 μL de GlycoBlue Coprecipitant. Misture bem e armazene a -20 °C por 1h.
10. Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
11. Decantar o supernatante. Lave a pelota de DNA usando 75% (v/v) etanol e centrífuga por 5 min a 13.000 rcf a 4 °C.
12. Decantar o supernatante. Seque a pelota de DNA e resuspenja o DNA em 25 μL de _ddH2O.
13. Configure a reação do PCR da seguinte forma. Para um total de 50 μL de reação, adicione 24 μL de DNA, 11 μL de _ddH2O, 10 μL de tampão TAE 5x, 2 μL de primer P5 (10 μM), 2 μL de primer P7 (10 μM) e 1 μL de Enzima Amplify TruePrep Amplify. Programa PCR: 72 °C para 3 min, 98 °C para 30 s; em seguida, 14 ciclos de 98 °C para 30 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 30 s, seguido por 72 °C para 5 min.
    NOTA: Os primeiros 72 °C para 3 min de extensão não podem ser ignorados. A superamplificação da biblioteca levará a um alto nível de duplicatas pcr no NGS. Comece a partir de 12-14 ciclos PCR em reação PCR para H3K4me3 ao usar ~1 μg de cromatina em cada reação.
14. Carregar 2 μL dos produtos PCR em gel de 1,5% de agarose para eletroforese.
15. Purifique os produtos PCR usando contas magnéticas de purificação de DNA comercial.
16. Quantifique a biblioteca com um fluorômetro e eletroforese de gel de agarose.
    NOTA: A concentração efetiva da biblioteca deve ser >2 nM por qPCR para garantir uma boa qualidade.
17. Realizar sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise de dados.

A Figura 1 retrata o fluxo de trabalho CUT&Tag. A Figura 2 mostra a coloração da DAPI dos núcleos intactos. O objetivo do passo do "isolamento dos núcleos" foi obter os núcleos intactos em uma quantidade suficiente para a reação subsequente da CUT&Tag. A Figura 3 mostra a eletroforese de gel agarose dos produtos PCR. O controle negativo do IgG é necessário em paralelo ao configurar o experimento. Em comparação com o grupo de controle IgG, a maior parte dos fragmentos de DNA puxados com a amostra de anticorpos H3K4me3 variou de ~280 a 500 pares de base. A Figura 4 mostra o sequenciamento resultante da próxima geração para o anticorpo anti-H3K4me3 em comparação com os grupos de controle negativos do IgG.

Figura 1: O fluxo de trabalho da CUT&Tag. Este número foi de Tao et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Coloração da DAPI de núcleos intactos isolados de folhas de algodão. Barra de escala = 20 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Eletroforese de gel agarose de 2 μL de produtos PCR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Captura de tela do IGV representativo para sinais H3K4me3. (A) Visão geral do IGV representativo dos sinais CUT&Tag em uma grande região do genoma. ~1500 kb regiões de genoma foram selecionadas aleatoriamente. (B) A captura de tela IGV representativa para genes com níveis variados de expressão mostrou alta resolução de sinais CUT&Tag. Os arquivos bigWig normalizados gerados a partir de bamCompare comparando o arquivo bam de tratamento (reação anti-H3K4me3 da CUT&Tag) e o arquivo bam de controle (IgG) foram usados. TPM, transcrições por quilobase de modelo de exon por milhão de leituras mapeadas. Este valor é modificado de Tao et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Sequências de primer. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Receitas tampão e solução. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Todos os autores não têm conflitos de interesse com qualquer empresa negociando um dos produtos mencionados acima.