Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Resumo

O decote sob metas e tagmentação (CUT&Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.

Resumo

Regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. O decote sob alvos e tagmentação (CUT&Tag) é um método de enzimática em que a proteína específica da cromatina é primeiro reconhecida por seu anticorpo específico, e então o anticorpo amarra uma proteína de fusão A-transposase (pA-Tn5), que corta a cromatina alvo in situ pela ativação de íons de magnésio. Aqui, fornecemos nosso protocolo CUT&Tag publicado anteriormente usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allortetraploid com modificação. Este protocolo passo a passo pode ser usado para pesquisa epigenômica em plantas. Além disso, modificações substanciais para o isolamento dos núcleos vegetais são fornecidas com comentários críticos.

Introdução

Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente....

Protocolo

1. Prepare soluções de transposase e estoque (Dia 1)

NOTA: Nesta parte, os adaptadores de oligonucleotídeos são complexos com transposase Tn5 para fazer transposase ativa.

1. Primers diluídos (primer A, primer B e primer C) a 100 μM de concentração usando o buffer de renascimento (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (consulte a Tabela 1 para obter informações sequenciais de primers e Tabela 2 para as receitas para soluções de trabalho). Armazenar a -20 °C até usar.
2. Configure as seguintes reações em tubos PCR: Reaction 1 (adaptador AB), 10 μL de 100 μM primer A, 10 μL ....

Resultados

A Figura 1 retrata o fluxo de trabalho CUT&Tag. A Figura 2 mostra a coloração da DAPI dos núcleos intactos. O objetivo do passo do "isolamento dos núcleos" foi obter os núcleos intactos em uma quantidade suficiente para a reação subsequente da CUT&Tag. A Figura 3 mostra a eletroforese de gel agarose dos produtos PCR. O controle negativo do IgG é necessário em paralelo ao configurar o experimento. Em comparação com o grupo de.......

Discussão

Aqui, descrevemos a CUT&Tag, uma tecnologia para gerar bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com a imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Nosso sucesso com o perfil H3K4me3 em folhas de algodão sugere que a CUT&Tag, que foi projetada pela primeira vez para células animais, também pode ser usada para células vegetais. Tanto o sistema tampão Tris comumente usado para o ensaio ^ChIP8 quanto.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Coelho normal IgG	Millipore	12-370
Produtos químicos
Albumina de soro bovino (BSA)			Faça 10 mg/ml de solução estoque de BSA. Armazene a -20° D
digitonina (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Fazer solução estoque de digitonina a 5% (200 mg de digitonina [~50% de pureza] para 2 mL de DMSO). Nota: Esterilize usando um filtro de 0.22 mícron. Armazene a -20° C
dimetilsulfóxido (DMSO)
clorofórmio
etilenodiaminotetracético (EDTA)			Faça uma solução-mãe de EDTA 0,5 M (pH = 8,5). Nota: Fazer 100 mL de EDTA 0,5-M (pH = 8,5) requer aproximadamente 2 g de pellets de hidróxido de sódio (NaOH) para ajustar o pH
etanol
Coprecipitante GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
(MgCl2)			Fazer 1 M MgCl2 solução estoque
coquetel de inibidor de protease	Calbiochem	539133-1SET
cloreto de potássio (KCl)			Faça 1 M KCl solução estoque
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1,v:v:v)
cloreto de sódio (NaCl)			Faça 5 M NaCl solução estoque
espermidina			Faça 2 M solução estoque de espermidina, armazene a -20°C.
dodecil sulfato de sódio (SDS)			Faça uma solução estoque de SDS a 10%. Nota: Não autoclave; esterilizar usando um filtro de 0,22 mícron
Base			Tris Faça 1 M Tris (pH = 8,0) solução estoque
Triton X-100			Faça 20% Triton X-100 solução estoque
< forte > enzima < / forte >
hiperativa pG-Tn5 / pA-Tn5 transposase para CUT & Tag	Vazyme	S602 / S603	Verifique a afinidade do anticorpo da proteína A ou proteína G que está fundida com o Tn5. De um modo geral, as proteínas A e G têm ampla afinidade com anticorpos. No entanto, a proteína A tem uma afinidade relativamente maior com os anticorpos de coelho e a proteína G tem uma afinidade relativamente maior com os anticorpos de camundongo. Selecione os produtos de transposase apropriados que correspondam ao seu anticorpo.
TruePrep Amplify Enzyme	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Máquina de PCR	Applied Biosystems	ABI9700
Agitador orbital	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND-UM-W

Cloreto de magnésio