Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Resumo

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Resumo

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos. Apesar da extensa investigação para novas estratégias terapêuticas, permanecem opções terapêuticas limitadas para pacientes com AVC. Portanto, mais pesquisas são necessárias para vias fisiofisiológicas como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Dada a incapacidade de modelos in vitro para reproduzir a complexidade do cérebro, modelos experimentais de derrame são essenciais para a análise e posterior avaliação de novos alvos de drogas para esses mecanismos. Além disso, modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos são urgentemente necessários para superar a chamada crise de replicação. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa ImmunoStroke, um modelo de rato fototrombótico padronizado usando uma injeção intraperitoneal de Rose Bengala e a iluminação do crânio intacto com um laser de 561 nm é descrito. Este modelo permite o desempenho do AVC em camundongos com alocação para qualquer região cortical do cérebro sem cirurgia invasiva; assim, possibilitando o estudo do AVC em várias áreas do cérebro. Neste vídeo, são demonstrados os métodos cirúrgicos de indução de AVC no modelo fototrombótico, juntamente com a análise histológica.

Introdução

O AVC isquêmico continua sendo a principal causa de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos no século^XXI, representando aproximadamente 2,7 milhões de mortes em 2017 em todo o mundo¹. Mesmo com os imensos esforços da comunidade científica, poucos tratamentos estão disponíveis. Além disso, com critérios de exclusão tão elevados, essas opções já limitadas não são acessíveis a muitos pacientes, resultando em uma necessidade urgente de novos tratamentos para melhorar a recuperação funcional após o AVC.

Considerando a incapacidade dos modelos in vitro de replicar as interações complexas do cérebro, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. Os camundongos são o modelo animal mais usado no campo de pesquisa de derrame. A maioria desses modelos de camundongos visa induzir infartos bloqueando o fluxo sanguíneo dentro da artéria cerebral média (MCA) uma vez que a maioria das lesões de derrame humano estão localizadas no território^{mca 2}. Embora esses modelos recapitulem melhor as lesões de derrame humano, envolvem cirurgias convuladas com alta variabilidade de volume infarto.

Desde a proposta de Rosenblum e El-Sabban do modelo fototrombótico em 1977³, e mais tarde a aplicação deste modelo aos ratos Watson et al.⁴, tornou-se amplamente utilizado na pesquisa isquêmica de derrame^5,6. O modelo de derrame fototrombótico induz um infarto cortical local e definido como resultado da fotoativação de um corante sensível à luz previamente injetado no fluxo sanguíneo. Isso causa trombose local dos navios nas áreas expostas à luz. Brevemente, após a exposição à luz do corante fotossensível injetado, induzida a lesão oxidativa localizada da membrana celular endotelial é induzida, levando à agregação plaquetária e à formação de trombos, seguida pela interrupção local do fluxo sanguíneo cerebral⁷.

A principal vantagem dessa técnica reside na sua simplicidade de execução e na possibilidade de direcionar a lesão para a região desejada. Ao contrário de outros modelos experimentais de derrame, é necessário menor experiência cirúrgica para realizar o modelo de derrame fototrombótico, pois a lesão é induzida pela iluminação do crânio intacto. Além disso, as bordas bem delimitadas (Figura 2A e Figura 5B) e a flexibilidade para induzir a lesão a uma região cerebral específica podem facilitar o estudo das respostas celulares dentro da área cortical isquêmica ou intacta⁸. Por essas razões, essa abordagem é adequada para o estudo de mecanismos celulares e moleculares de plasticidade cortical.

Ao longo das últimas décadas, a crescente preocupação com a falta de reprodutibilidade entre os grupos de pesquisa foi cunhada da chamada crise de replicação⁹. Após a coordenação do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizado pré-clínico em 2015¹⁰, uma ferramenta proposta para melhorar a pesquisa pré-clínica^11,12,13, foi confirmado que uma das causas para a falha na reprodutibilidade entre estudos pré-clínicos de laboratórios independentes foi a falta de padronização suficiente de modelos experimentais de avc e parâmetros de desfecho¹⁴. Assim, quando o consórcio ImmunoStroke foi estabelecido (https://immunostroke.de/), uma colaboração que visa compreender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC, a padronização de todos os modelos experimentais de AVC entre cada grupo de pesquisa foi essencial.

Descrito aqui é o procedimento padronizado para a indução do modelo fototrombótico, conforme utilizado no consórcio de pesquisa acima mencionado. Resumidamente, um animal foi submetido a anestésicos, recebeu uma injeção de Bengala Rosa (10 μL/g) intraperitonalmente, e o crânio intacto, 3 mm restante de bregma, foi imediatamente iluminado por um laser de 561 nm por 20 min (Figura 1). Além disso, é relatado um método histológico e comportamental relacionado para analisar o desfecho do AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em laboratório.

Protocolo

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Os camundongos utilizados neste estudo foram camundongos C57Bl/6J machos, de 10 a 12 semanas de idade, e despachados pela Alemanha do Rio Charles. Os animais foram alojados sob temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água.

1. Preparação do material e instrumentos

1. Dissolver Rose Bengala em solução salina de 0,9% para atingir uma concentração final de 10 mg/mL. Conecte a manta de calor para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 °C.
2. Prepare tesouras, fórceps, pedaços de algodão, pomada de olhos dexpanthenol e material de sutura. Prepare uma seringa com solução salina (sem agulha) para manter a área de operação hidratada. Prepare o gás anestesia (100% O₂ + isoflurane).

2. Preparação do animal

1. Injete analgesia 30 min antes da cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).
2. Registo o peso corporal do rato para ajustar a dose de Rose Bengala a ser injetada (10 μL/g i.e., 100 μg/g).
3. Coloque o rato na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibrissae parem.
4. Transfira o mouse para o quadro estereotático e coloque-o em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. Em seguida, reduza e mantenha a concentração de isoflurane em 2%.
5. Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associada para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C.
6. Aplique pomada ocular dexpanthenol em ambos os olhos e limpe a pele e a pele circundante com um agente desinfetante.

3. Modelo de fototrombose

1. Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.
2. Remova o periosteum suavemente com algodão e identifique as suturas coronais.
3. Coloque os óculos de proteção, ligue o laser de 561 nm e marque o bregma +3 mm à esquerda.
4. Desligue o laser, conecte um adesivo com um orifício de 4 mm de diâmetro colocado nas coordenadas marcadas acima mencionadas.
5. Injete o mouse com Bengal Rose (10 μL/g), intraperitonealmente. Coloque o raio laser a 4-5 cm do crânio, ligue o laser de 561 nm e ilumine o crânio por 20 minutos.
6. Aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.
7. Injete analgesia a cada 12 h durante 3 dias após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).

4. Operação Sham

1. Realizar dois procedimentos diferentes das operações de Sham, conforme descrito nas etapas 4.1.1 e 4.1.2.
   1. Realizar todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima. Injete Rose Bengala sem ligar o laser. Após 20 minutos sob anestesia, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.
   2. Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima, ligando o laser. Não injete Rose Bengala. Após 20 minutos de iluminação a laser, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem da anestesia, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.

5. Mancha laser

1. Conecte a manta aquecida para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura do corpo do rato durante a anestesia a 37 °C.
2. Coloque o mouse na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e vibrissae pare e, em seguida, transfira o mouse para o quadro estereotático.
3. Coloque o mouse em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. A galinha T reduza e mantenha-o em 2%.
4. Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associado para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C e aplique pomada dexpanthenol nos olhos em ambos os olhos. Limpe a pele e a pele ao redor com um agente desinfetante.
5. Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.
6. Coloque o quadro estotactic sob a mancha de laser e ajuste a altura para obter uma imagem nítida. Concentre a câmera de imagem de perfusão de manchas de laser (LSI) na janela craniana. Configure o sistema de câmera de imagem de manchas a laser (LSI) de alta resolução como descrito anteriormente¹⁵.
7. Adquira dados de um campo de visão de 1 cm x 1 cm usando um comprimento de onda de 785 nm e lasers de 80 mW com uma taxa de quadros de 21 imagens/s a uma distância de trabalho de 1 cm por 1 min.
8. Após a imagem, aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia por 1h. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.

6. Neuroscore

NOTA: Para a análise do déficit neurológico, utiliza-se¹⁵.

1. Pontuação dos animais para geral(Tabela 1) e déficits focais(Tabela 2). Esta escala composta varia de 0 (sem déficits) a 46 (prejuízos graves).
2. Realize o neuroscore ao mesmo tempo todos os dias e use roupas cirúrgicas para manter um cheiro neutro.
3. Habituar os ratos por 30 minutos na sala com uma gaiola aberta antes do teste e permitir que eles observem cada item por 30 s.

7. Perfusão

1. Prepare uma seringa de 20 mL contendo PBS-heparin (2 U/mL) e coloque-a 1 m acima do banco para facilitar/garantir a perfusão movida pela gravidade.
2. Injete intraperitoneally 100 μL de cetamina e xilazina (120/16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Aguarde 5 min e corroia a cessação do movimento espontâneo do corpo e da vibrissae.
3. Fixar o animal em uma posição supina e desinfetar a superfície abdominal do corpo com 100% de etanol. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento no abdômen; corte o diafragma e as costelas para visualizar completamente o coração.
4. Faça uma pequena incisão no átrio direito e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e perfuuse com 20 mL PBS-heparin.
5. Após a perfusão, decapite o animal e remova o cérebro, congele-o usando gelo seco e armazene-os a -80 °C até que use mais.

8. Volumetria infarto

1. Criosectioning: Corte o cérebro em série em um criostat para seções de 20 μm de espessura a cada 120 μm e monte em slides. Armazene os slides a -80 °C até que seja mais processamento.
2. Mancha de cresyl violeta (CV)
   1. Para preparar a solução de coloração, misture 0,5 g de acetato cv em 500 mL de H₂O. Mexa e aqueça (60 °C) até dissolver os cristais. Deixe a solução esfriar e armazená-la em uma garrafa escura. Reaqueça a 60 °C e filtro (filtro de papel) antes de cada uso.
   2. Seque os slides à temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque-os em 95% de etanol por 15 min, seguido por 70% de etanol por 1 min, e depois em 50% de etanol por 1 min.
   3. Coloque os slides em água destilada por 2 minutos, refresque a água destilada e coloque os slides na água novamente por 1 min. Em seguida, coloque os slides na solução de coloração pré-aquecida por 10 min a 60 °C. Lave os slides duas vezes em água destilada por 1 min.
   4. Coloque os slides em 95% de etanol por 2 minutos. Em seguida, coloque-os em 100% etanol por 5 min, refresque o etanol 100% e coloque os slides em 100% etanol novamente por 2 min. Depois, cubra os slides com um meio de montagem.
   5. Análise: Escaneie os slides e analise o volume indireto de infarto pelo método Swanson¹⁶ para corrigir o edema: Área isquêmica = (região isquêmica)-((hemisfério ipsilateral) - (hemisfério contralateral)).

9. Coloração de tunel(in situ kit de detecção de apoptose)

1. Seque os slides, pós-fixação em 4% de paraformaldeído em PBS (ph 7.4) por 10-20 min na RT. Lave em PBS, pós-fixação em etanol pré-cozido: ácido acético 2:1 por 5 min a -20 °C.
2. Lave em PBS e aplique tampão de equilíbrio (10 s a um máximo de 60 min no RT) e aplique enzima TdT de força de trabalho (1 h a 37 °C em câmara umidificada)
3. Aplique força de trabalho parar/lavar enzima (10 min no RT), lavar em PBS e aplicar a força de trabalho aquecida (RT) conjugado anti-digoxigenina (30 min em RT no escuro)
4. Lave em PBS, incuba com DAPI por 5 minutos no RT e monte os slides com mídia fluoromount.

Resultados

O modelo descrito aqui é um modelo de derrame fototrombótico pela injeção de Rose Bengala e iluminação intacta do crânio por 20 minutos, em um comprimento de onda constante de 561 nm e 25 mW de potência de saída na fibra. Embora a cirurgia fototrombótica completa dure 30 minutos, o animal é mantido sob baixa anestesia e o dano cerebral é moderado. Aproximadamente 10 minutos após a transferência para suas gaiolas, todos os animais estavam acordados, movendo-se livremente na gaiola, e interagindo com os companheiros de lix...

Discussão

O protocolo apresentado descreve o modelo experimental de derrame de fototrombose iluminando o crânio intacto com um laser de 561 nm, com uma injeção intraperitoneal anterior de Rose Bengala. Até recentemente, o uso desse modelo tem sido baixo, mas está aumentando constantemente.

A mortalidade por indução de AVC neste modelo está ausente. A mortalidade geral de menos de 5% surge durante a operação devido a complicações anestesiológicas ou sacrifício após o cumprimento dos critérios de exclusão...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laser de comprimento de onda de 561 nm	Solna	Cobolt HS-03
Ácido acético	Sigma Life Science	695092
Sistema de anestesia para isoflurano	Drager
ApopTag Peroxidase Kit de detecção de apoptose in situ	Millipore	S7100
Bepanthen pomada	Bayer	1578681
C57Bl / 6J camundongos	Colimetro	de 000664
	Thorlabs	F240APC-A
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Etanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Etanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Etanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Papel de filtro	Macherey-Nagel	432018
Tesoura fina	FST	15000-00
Fórceps	FST	11616-15
Manta de aquecimento	FHC DC Controlador de temperatura	40-90-8D
Isoflurano	Abbot	B506
Isopentano	Fluka	59070
Cetamina	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle	Perimed PeriCam	PSI HR
Mayor Tesoura	FST	1410-15
Fosfato Tampolado Solução Salina PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni München	P32799
Óculos de proteção	Laser 2000	NIR-ZS2-38
Rose Bengal	Sigma Aldrich	198250-5G
Roti-Histokit meio de montagem	Roth	6638.1
Solução salina	Braun	131321
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Quadro	estereotáxicoStoelting	51500U
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Xylacine	Albrecht

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