Artigo de método

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

DOI:

10.3791/62554

⸱

11 de maio de 2021

 ,  ,  , 
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology), Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris, INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avanços recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e tecnologias de edição de genes permitem o desenvolvimento de novos modelos de doenças baseadas em células humanas para programas de descoberta de drogas fenotípicas (PDD). Embora esses novos dispositivos pudessem prever a segurança e a eficácia de drogas experimentais em humanos com mais precisão, seu desenvolvimento para a clínica ainda depende fortemente de dados de mamíferos, notadamente o uso de modelos de doenças em camundongos. Em paralelo aos modelos de doenças organoides ou organ-on-chip humanas, o desenvolvimento de modelos relevantes em camundongos in vitro é, portanto, uma necessidade não atendida para avaliar comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre espécies e condições in vivo e in vitro. Neste artigo, descreve-se um ensaio de brotamento vascular que utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários (EBs). EBs vascularizadas cultivadas em gel de colágeno 3D desenvolvem novos vasos sanguíneos que se expandem, um processo chamado angiogênese brotamento. Esse modelo recapitula as principais características da angiogênese germinada in vivo-formação de vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular pré-existente, incluindo seleção de células da ponta endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação celular, formação de tubos e recrutamento de células murais. É passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese e apresenta semelhanças com ensaios vasculares tridimensionais (3D) recentemente descritos baseados em tecnologias humanas de iPSC.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nas últimas três décadas, a descoberta de fármacos baseada em alvos (TDD) tem sido amplamente empregada na descoberta de fármacos pela indústria farmacêutica. A TDD incorpora um alvo molecular definido que desempenha um papel importante em uma doença e depende do desenvolvimento de sistemas de cultura celular relativamente simples e leituras para triagem de drogas1. A maioria dos modelos típicos de doenças usados em programas de TDD incluem métodos tradicionais de cultura de células, como células cancerosas ou linhagens celulares imortalizadas cultivadas em ambientes artificiais e substratos não fisiológicos. Embora muitos desses modelos tenham fornecido ferramentas viáveis para identificar candidatos a fármacos bem-sucedidos, o uso de tais sistemas pode ser questionável devido à sua baixa relevância para a doença2.

Para a maioria das doenças, os mecanismos subjacentes são realmente complexos e vários tipos celulares, vias de sinalização independentes e múltiplos conjuntos de genes são frequentemente encontrados para contribuir para um fenótipo específico da doença. Isso também é verdade para doenças hereditárias em que a causa primária é uma mutação em um único gene. Com o recente advento de tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) e ferramentas de edição gênica, agora é possível gerar organoides 3D e modelos de doenças organ-on-chip que poderiam recapitular melhor a complexidade humana in vivo 3,4. O desenvolvimento de tais tecnologias está associado ao ressurgimento do interesse em programas de descoberta de drogas fenotípicas (TID)1. O TID pode ser comparado ao rastreamento empírico, pois não depende do conhecimento da identidade de um alvo específico da droga ou de uma hipótese sobre seu papel na doença. A abordagem TID é hoje cada vez mais reconhecida por contribuir fortemente para a descoberta de drogas de primeira classe5. Como o desenvolvimento de tecnologias de organoides humanos e organ-on-chip ainda está engatinhando, espera-se que os modelos iPSC (complementados com ferramentas inovadoras de imagem e aprendizado de máquina6,7) forneçam, em um futuro próximo, vários novos modelos complexos de doenças baseadas em células para triagem de drogas e programas associados de TID para superar a baixa produtividade da abordagem TDD8, 9º.

Embora os modelos organoides humanos e organ-on-chip possam fornecer informações importantes sobre a complexidade da doença e para a identificação de novos medicamentos, trazer medicamentos para a nova prática clínica também depende fortemente de dados de modelos animais para avaliar sua eficácia e segurança. Entre eles, camundongos geneticamente modificados são certamente os modelos de mamíferos preferidos. Eles têm muitas vantagens, pois têm um tempo de geração relativamente curto para os mamíferos, têm muitos fenótipos semelhantes às doenças humanas e podem ser facilmente manipulados geneticamente. São, portanto, extensivamente utilizados em programas de descoberta de fármacos10. No entanto, fazer a ponte entre camundongos e humanos continua sendo um desafio importante11. O desenvolvimento de modelos in vitro de camundongos equivalentes a modelos organoides e organ-on-chip humanos poderia, pelo menos parcialmente, preencher essa lacuna, pois permitirá comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre dados in vivo de camundongos e in vitro em humanos.

Aqui, um ensaio de brotamento vascular em corpos embrionários (EBs) de camundongos é descrito. Os vasos sanguíneos são compostos por células endoteliais (revestimento interno das paredes dos vasos), células murais (células musculares lisas vasculares e pericitos)12. Esse protocolo baseia-se na diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em EBs vascularizadas utilizando gotículas pendentes que recapitulam a diferenciação de células endoteliais e murais de novo 13,14. CTEs de camundongos podem ser facilmente estabelecidas em cultura a partir de blastocistos isolados do dia 3,5 de camundongos com diferentes origens genéticas15. Também oferecem possibilidades de análise clonal, rastreamento de linhagens e podem ser facilmente manipulados geneticamente para gerar modelos de doenças13,16.

Como os vasos sanguíneos nutrem todos os órgãos, não é surpreendente que muitas doenças, se não todas, estejam associadas a alterações na microvasculatura. Em condições patológicas, as células endoteliais podem adotar um estado ativado ou podem se tornar disfuncionais, resultando em morte celular mural ou migração para longe dos vasos sanguíneos. Estes podem resultar em angiogênese excessiva ou em rarefação de vasos, podem induzir fluxo sanguíneo anormal e barreira vascular defeituosa levando ao extravasamento de células imunes e inflamação12,17,18,19. A pesquisa para o desenvolvimento de fármacos moduladores dos vasos sanguíneos é, portanto, alta, e múltiplos atores e conceitos moleculares já foram identificados para o direcionamento terapêutico. Nesse contexto, o protocolo descrito é particularmente adequado para a construção de modelos de doenças e para testes de drogas, pois recapitula as principais características da angiogênese em brotamento in vivo, incluindo seleção de células da ponta e do pedúnculo endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação de células endoteliais, formação de tubos e recrutamento de células murais. Também apresenta semelhanças com ensaios vasculares 3D recentemente descritos, baseados em tecnologias humanas iPSC20.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de mídia e cultura de mESC

  1. Preparar meio condicionado +/- (CM+/-) usando o suplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) com 10% (vol/vol) de Soro Fetal Bovino (FBS) inativado pelo calor, 0,05 mM β-mercaptoetanol, 1x aminoácidos não essenciais (NEAA 1x), 2 mM L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio.
  2. Preparar meio condicionado +/+ (CM+/+) utilizando o suplemento meio CM+/- com Fator Inibidor de Leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e β-mercaptoetanol 0,1 mM.
  3. Preparar meio condicionado +/+ na presença de dois inibidores (CM+/+ 2i) utilizando o suplemento meio CM+/+ com 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.
  4. Preparar solução de gelatina a 0,1% misturando 25 mL de solução de gelatina a 2% pré-aquecida em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (DPBS).
  5. Preparar 10x tampão de fosfato de tripsina versene (TVP 10x) misturando tripsina (2,5%) com TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% soro de frango, 0,01% tripsina (2,5%) em H2O) (proporção 1:10, vol/vol).
    NOTA: Filtrar todas as soluções através de um filtro de poros de 0,22 μm. Conservar o meio de cultura a -20 °C a longo prazo e manter outros reagentes a 4 °C até 3 semanas (ver Tabela de Materiais).
  6. Revestir duas placas de cultura celular de 12 poços com solução de gelatina a 0,1% (500 μL por poço) e incubá-las por 30 min em estufa CO 2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).
  7. Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.
  8. Descongelar dois frascos para injetáveis de 1 x 106 fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) irradiados criopreservados a 37 °C e transferir a suspensão celular para um tubo cônico com 5 mL de meio CM+/-.
  9. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (TR). Aspirar o meio e ressuspender suavemente o pellet de células em 12 mL de meio CM+/- na concentração de 1,67 x 10,5 células por mL.
  10. Semear 500 μL de MEF em uma placa de cultura celular de 12 poços (2,4 x 105 células por cm 2) e incubar a placa durante a noite (o/n) em uma incubadora de CO2.
  11. Descongelar um frasco para injetáveis de mESCs criopreservados (1 x 106) em meio CM+/+ 2i.
  12. Semeando a suspensão de mESC em uma placa de 12 poços pré-lavada com MEFs em 1 mL de meio CM+/+ 2i e transferindo a placa para uma incubadora de CO2 . Atualize o meio diariamente.
  13. Com 70% de confluência, lavar as colônias mESC com DPBS. Adicionar 150 μL de tampão TVP 10x quente e incubar em RT por 30 s para iniciar a dissociação enzimática.
  14. Remover cuidadosamente o tampão TVP, ressuspender as células em 1 mL de meio CM+/+ 2i e dissociar as colônias em células únicas por pipetagem suave.
  15. Passar as células transferindo-as para uma nova placa de cultura celular de 12 poços com MEFs (proporção de divisão: 1:3-1:5). Misture suavemente para distribuir as células e incube em uma incubadora de CO2 .
  16. Atualizar o meio de cultura (2-3 mL) e observar diariamente o crescimento/morfologia celular. Repita a passagem em série com 70% de confluência a cada 2 dias. Mude para o meio CM+/+ por duas passagens antes de iniciar a diferenciação celular.

2. Formação de EB em gota suspensa

  1. Preparar o meio de diferenciação do mesoderma fresco suplementando o meio CM+/- com Fator de Crescimento de Fibroblastos (bFGF) básico (50 ng·mL-1) e com Proteína Morfogenética Óssea 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) e mantê-lo a 4 °C até o uso.
  2. Cobrir um poço da placa de cultura celular de 6 poços com 500 μL de solução de gelatina a 0,1% e colocá-lo em uma incubadora de CO2 por 30 min.
  3. Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.
  4. Para obter uma população pura de mESCs, tripsinize a placa de cultura celular com tampão TVP 10x por 30 s em RT, ressuspenda as células em meio de diferenciação de mesoderma de 1 mL e, em seguida, transfira-as para a placa de 6 poços revestida com gelatina por 30 min, permitindo que as MEFs se fixem enquanto as mESCs permanecem em suspensão.
  5. Coletar a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e contar as células usando um hemocitômetro de Neubauer e corante azul de Trypan para uma exclusão de células vivas/mortas.
  6. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min na RT. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de diferenciação mesodérmica para atingir 4,55 x 104 células por mL.
  7. Encha o fundo de placas de poliestireno de fixação baixa de 94 mm com 15 mL de água estéril.
    NOTA: Quatro pratos contendo gotas pendentes (1,6 x 105 células em 3,52 mL de meio) serão necessários para testar uma condição específica usando o ensaio de angiogênese de brotação 3D.
  8. Transfira a suspensão celular para um reservatório plástico estéril e carregue quatro posições de uma pipeta multicanal com 22 μL de suspensão celular por canal (1 x 103 células por gota de 22 μL).
  9. Levante e inverta a tampa da placa de 94 mm e coloque-a na superfície limpa do gabinete de fluxo com o lado interno voltado para cima.
  10. Depositar 40 gotas da suspensão celular na superfície interna de cada tampa. Inverta cuidadosamente a tampa sem perturbação e coloque-a de volta no prato, de modo que as gotas fiquem viradas para a água.
  11. Incube os pratos em uma incubadora de CO2 . Considere isso como dia de diferenciação 0. Manter as placas por 4 dias para formar EBs.

3. Ensaio de competição para a posição da célula de ponta

  1. Cultura: uma linhagem mESC fluorescente e outra não fluorescente, conforme descrito anteriormente13. Como exemplo, são usados mESCs 7ACS/EYFP rotulados em amarelo e mESCs R1.
  2. Prepare EBs em mosaico misturando quantidades iguais das duas linhas mESC (proporção 1:1) e incube as placas suspensas em uma incubadora de CO 2, conforme descrito na etapa2 .

4. Cultura de EBs flutuantes para diferenciação vascular

  1. Antes de coletar EBs das gotas pendentes, prepare o seguinte.
    1. Preparar solução de ágar a 5% em H2O e esterilizá-la em autoclave (20 min a 120 °C).
    2. Use a solução quente de ágar a 5% para preparar o meio G-MEM BHK-21 contendo ágar a 1% e despeje rapidamente 3 mL em uma das placas de poliestireno de 60 mm. Deixe o ágar solidificar por 1 h no RT. Guarde os pratos a 4 °C até usar.
  2. Preparar meio de diferenciação vascular fresco 2x suplementando o meio CM+/- com bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·mL-1). Conservar o meio a 4 °C até à utilização.
  3. Coletar as gotas pendentes em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação com EB.
  4. Ressuspender as EBs em 3 mL de meio de diferenciação vascular 2x, transferir a suspensão da EB para uma mão revestida em ágar, distribuir as EBs homogeneamente para evitar agregação.
  5. Incubar as placas em estufa CO 2 e refrescar o meio a cada2 dias até o dia 9 usando 1x meio de diferenciação vascular na presença de bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·mL-1).
  6. Alternativamente, adicione o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 no dia 4 e 5 ng·mL-1 no dia 6 e no dia 8) ao meio de diferenciação vascular para promover a diferenciação das células murais.

5. Análise por citometria de fluxo

  1. Coletar os EBs de 9 dias em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e lavá-los uma vez com PBS quente.
  2. Adicionar 1mL de meio G-MEM BHK-21 contendo 0,2 mg·mL-1 de colagenase A e incubar as células em incubadora de CO2 por 5 min.
  3. Dissociar os EBs pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000.
  4. Interromper a atividade da colagenase adicionando 1 mL de meio G-MEM BHK-21 frio com 10% de FBS.
  5. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min no TR.
  6. Ressuspender as células em 500 μL de PBS com SFB a 2%.
  7. Conte as células usando um hemocitômetro de Neubauer.
  8. Ressuspender 400.000 células em 100 μL de PBS com 2% de FBS por condição de coloração.
  9. Incubar as células durante 45 minutos a 4 °C com os seguintes anticorpos: APC conjugado de rato anti-rato PECAM-1 (clone MEC13.3) e FITC conjugado de rato anti-rato CD45 (clone 30-F11) ou anticorpos de controlo isotípico.
  10. Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS contendo FBS a 2%.
  11. Ressuspender as células para atingir uma concentração final de 5 x 106 células por mL.
  12. Filtre as células usando um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo, com uma tampa de encaixe do filtro de células.
  13. Analisar 20.000 eventos PECAM-1 (+) por citometria de fluxo.

6.3D ensaio de angiogênese por brotamento e coloração por imunofluorescência

  1. No dia 9, preparar um meio de brotação adicionando 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoetina humana recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleucina-6 humana (IL-6) (10 ng·mL-1), β-mercaptoetanol 0,05 mM, NEAA (1x), L-glutamina (1x), piruvato de sódio (1x), colágeno de cauda de rato tipo I (1,25 mg·mL-1), e NaOH (3,1 mM) para GMEM em meio BHK-1.
  2. Para evitar a gelificação do colágeno, mantenha o meio de brotação no gelo até o uso.
  3. Para avaliar o efeito de moléculas pró/antiangiogênicas, adicione o fármaco ou veículo selecionado ao meio de brotação na concentração selecionada.
  4. Coletar EBs de 9 dias de uma placa de ágar de 60 mm em um tubo cônico de 15 mL (equivalente a uma condição) e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação.
  5. Cobrir o fundo de uma placa de cultura de 35 mm com 1 mL do meio de brotação e incubar a 37 °C por 5 min para induzir a gelificação.
  6. Ressuspender as EBs em 2 mL de meio de brotação a frio.
  7. Transfira a suspensão para a placa de cultura de 35 mm revestida com a primeira camada de meio de brotação.
  8. Distribua os EBs por toda a placa e certifique-se de que eles estejam a uma distância igual um do outro. Incubar o prato em uma incubadora de CO2 . A primeira formação de brotos acontece dentro de 24-48 h.
  9. No 12º dia, o gel de colágeno contendo EBs é cuidadosamente transferido para uma lâmina de vidro (75 x 26 mm) usando uma espátula.
  10. Retire o excesso de líquido usando uma pipeta (P1000) e desidrate o gel colocando uma folha de gaze de linho de nylon e cartões de filtro absorvente (gel blotting paper) sobre o gel. Aplique pressão colocando um peso (250 g) por 2 min. Retire cuidadosamente os papéis de nylon/filtro e deixe as lâminas secarem ao ar por 30 min no RT.
  11. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min no RT.
  12. Fixar os EB utilizando solução de zinco (ver Tabela de Materiais) o/n a 4 °C. Alternativamente, fixar os EBs fluorescentes em mosaico com Paraformaldeído (PFA) (4%) o/n a 4 °C no escuro.
  13. Remova o fixador. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min no RT.
  14. Permeabilizar os EBs em PBS contendo Triton-X100 a 0,1% por 15 min no TR.
  15. Remova a solução de permeabilização. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.
  16. Incubar os EBs no tampão de bloqueio (PBS com 2% de Albumina de Soro Bovino, BSA) por 1 h no TR.
  17. Para corar os brotos endoteliais, use um anticorpo primário anti-PECAM-1 de rato (diluição de 1:100) no tampão de bloqueio o/n a 4 °C.
  18. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.
  19. Incubar as lâminas com o anticorpo secundário Alexa 555 anti-rato de cabra em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) e, quando necessário, com o anticorpo anti-α-SMA conjugado com FITC em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) para corar as células murais por 2 h no RT no escuro.
  20. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min e uma vez com H20 antes de montá-las.

7. Imagem confocal, morfométrica e análise quantitativa de brotos endoteliais de EB

  1. Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas por fusão no plano focal (z-stacking) usando um microscópio confocal. Use a objetiva de ampliação de 10x para criar imagens de EBs inteiras.
  2. Analisar as imagens adquiridas no ImageJ para avaliar a morfologia e quantificar as características dos brotos endoteliais positivos para PECAM-1 de acordo com métodos de quantificação estabelecidos13,14,21.
    1. Calcular o número médio de brotos endoteliais por EBs contando manualmente o número total de brotos por EBs individuais.
    2. Meça os comprimentos individuais dos brotos usando a ferramenta de desenho ImageJ. Definir a base do broto endotelial a partir da área central da EB e traçar manualmente uma linha até o final da ponta do broto.
    3. Calcule o número médio de células da ponta por broto contando manualmente o número de células da ponta por broto individual e, em seguida, calcule a média por EB.
    4. Calcule a orientação dos filópodes determinando manualmente o eixo do broto pai e meça o ângulo agudo entre eles usando a ferramenta de ângulo do software ImageJ. Calcule o número de brotos com orientação >50° e divida pelo número total de brotos do EB de interesse.
      OBS: Os ângulos sempre variaram de 0° a 90°.
  3. Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas usando um microscópio confocal. Use a objetiva de aumento de 40x para obter imagens de alta resolução de brotos endoteliais únicos.
  4. Quantifique a cobertura vascular de brotos CE positivos para PECAM-1 circundados por MCs positivos para α-SMA usando o software ImageJ.
    1. Divida as imagens mescladas em canais vermelhos e verdes separados.
    2. Converta as imagens em sua forma binária.
    3. Medir a área celular total do broto ocupada separadamente por células positivas para PECAM-1 (células endoteliais marcadas em vermelho) e por células positivas para α-SMA (células murais marcadas em verde).
    4. Gere a imagem mesclada usando a função de calculadora de imagem e o operador AND. Meça a área celular total da imagem. Para calcular a cobertura, divida a área da imagem colocalizada pela área da imagem binária PECAM-1.
  5. Para analisar a competição celular pela posição das células da ponta/pedúnculo endotelial de brotos desenvolvidos por EBs em mosaico, pontuar manualmente o número de células da ponta e marcar sua origem genotípica com base no sinal de fluorescência. Calcular os valores médios por EB.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A visão geral do protocolo do ensaio de brotamento de vasos sanguíneos é mostrada na Figura 1. EBs de nove dias de idade derivadas de três linhagens independentes de 129/Ola mESC (Z/Red, R1 e E14) foram enzimaticamente dissociadas em células únicas usando colagenase A. As células foram coradas para PECAM-1 e analisadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) conforme descrito. Todas as linhagens celulares exibiram diferenciação endotelial robusta, e não foram observadas di...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um ensaio vascular de brotamento baseado em EB 3D imparcial, robusto e reprodutível, passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese. Este método oferece vantagens sobre muitos ensaios bidimensionais (2D) amplamente utilizados usando culturas de células endoteliais, como as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para monitorar a migração (ensaio de scratch lateral ou o ensaio da câmara de Boyden)22,23 ou proliferação (contagem do número de células, detecção de sín...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e pela Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-mercaptoetanolMilipore, Merck805740Biohazard: instruções de segurança adequadas devem ser seguidas ao manusear
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 cabra anti-rato IgGLife technologiesA21434
APC anticorpo conjugado anti-rato PECAM-1 de rato (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
Rato APC IgG2a κ Controle de Isotipo (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 microscópio de cultura de tecidos de contraste de fase invertidaZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Centrífuga de bancada, Allegra X-15RBeckman Coulter392932 Gabinete de
biossegurança BioVanguard (Linha Verde)Telstar133H401001
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA9418
Câmara de contagem de células, Buerker, 0,100 mmMarienfeld640211
Placas de cultura de células 60 x 15 mmCorning353802
Placas de cultura de células, 35 x 10 mmCorning353801
Placas de cultura de células 12 poçosCorning3512
Sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96 TouchBiorad1855196
soro de frangoSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Colágeno I, alta concentração, cauda de rato, 100mgCorning354249
colagenase ARoche10103586001
Varredura a laser confocal Microscópio, TCS SP5Leica
Óculos de cobertura, 24 &vezes; 50 mmVwr631-0146
DAPT γ? inibidor de secretaseSigma AldrichD5942
DC101 anti camundongo VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotipo rato IgG1BioXcellBP0290
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: instruções de segurança adequadas devem ser tomadas ao manusear
DPBS (10x), sem cálcio, sem magnésioGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Células-tronco embrionárias Fetal Bovine SerumGibco, Thermofisher scientific16141-079Deve ser testado por lote para máxima viabilidade e crescimento de células ES. Inativar o calor a 60° C e armazenar em &menos; 20 ° C por até 1 ano
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG 
Eritropoietina humana (hEPO), 250 U (2,5 µ g) (1 mL)Proteína
ESGRO (10? unidades    1 mL)Milipore, tubos MerckESG1107
Falcon 15 mLGreiner Bio-One188271
Tubos Falcon 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Ponta do filtro, transparente, estéril F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugado anti-&alfa; Actina de músculo liso (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC conjugado rato anti-camundongo CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo (clone RTK4530)Biolegend400605
Mídia de montagem fluorscenteDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gaze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Papel mata-borrão em gel, Grau GB003WhatmanWHA10547922
Solução de gelatina, tipo BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Fixador de ZincoBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubadoraPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleucina-6, humano (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamina 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Caixa de lâminas de microscópioKartell Labware278
Lâmina de microscópio, vidro StarfrostKnittelVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG Ensaio de Primer QuantiTectQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG Ensaio de Primer QuantiTectQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG Ensaio de Primer QuantiTectQT00154014
Mm_Flt1_1_SG Ensaio de Primer QuantiTectQT00096292
Mm_Flt4_1_SG Ensaio de Primer QuantiTectQiagen
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect PrimerAssay QiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Camundongo (ICR) Fibroblastos Embrionários Inativados  (2 milhões)Gibco, Thermofisher scientificA24903Armazene frascos em nitrogênio líquido (195,79 ° C) linha
de células-tronco embrionárias de camundongo indefinidamente 7AC5 / EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mecanismos de Desenvolvimento. 76 (1– 2), 79– 90 (1998)].
Linhagens de células-tronco embrionárias de camundongo Acvrl1 +/- e Acvrl1 +/+Geradas no Centro Médico da Universidade de Leiden [Thalgott, J.H. et al. Circulação. 138 (23), 2698– 2712 (2018)].
Células-tronco embrionárias de camundongo linhagem E14Fornecido pelo laboratório M Letarte e gerado de acordo com Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635– 3642 (2001).
Células-tronco embrionárias de camundongo linhagem R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá. [Nagy, A., et al. Procedimentos da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América. 90 (18), 8424-ndash; 8428 (1993)].
Linha de células-tronco embrionárias de camundongo Z / Red (cepa 129 / Ola)Gerado pelo Dr. A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontário, M5G 1X5, Canadá [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241– 246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS EspectrofotômetroThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB,Peprotech100-14B
, Rato Anti-RatoBD Biosciences550274
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific
placa de Petri, PS, 94/16 mm, padrão, com aberturas, estérilGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multicanal P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Kit de pipeta, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
BMP-4 humano recombinante ProteínaR& Mini314-BP
QIAGEN74134
Pipetas sorológicas, 10 mLde pipetas sorológicas Greiner Bio-One607 180
, 25 mLde pipetas sorológicas Greiner Bio-One760 180
, 5 mLde Greiner Bio-One606 180
Hidróxido de sódio (NaOH)Merck106498
Piruvato de sódio 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Tubos de ensaio 5ml fundo redondo com tampa de filtro de célulasCorning352235
Termociclador, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco, Thermofisher scientific
Tripsina (2,5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Sistema de Filtro a Vácuo/Garrafa de Armazenamento, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , água murina recombinantePeprotech450-32
estérilFresenius-KabiB230531
Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A
Z605212 LIF de camundongo recombinante Roche 11120166001 QT00099064 anticorpo Pecam-1 humano recombinante15140122 kit RNeasy Plus da D Systems15250061, banho-maria,

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215(2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678(2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147(2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002(2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17(2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Sprouting AngiogenesisThree Dimensional AssayEmbryoid BodiesCollagen Gel CultureEndothelial Tip CellsDrug Testing AssayGenetic ScreeningMural Cell Recruitment

Artigos relacionados