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Artigo de método

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

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DOI:

10.3791/62573

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24 de maio de 2021

 ,  , 
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Neste artigo

Resumo

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Resumo

O AVC é a terceira causa mais comum de mortalidade e a principal causa de incapacidade adulta adquirida nos países desenvolvidos. Até o momento, as opções terapêuticas são limitadas a uma pequena proporção de pacientes com AVC nas primeiras horas após o AVC. Novas estratégias terapêuticas estão sendo amplamente investigadas, especialmente para prolongar a janela de tempo terapêutico. Essas investigações atuais incluem o estudo de importantes vias fisiodicosiológicas após o AVC, como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Na última década, tem havido uma preocupação crescente com a baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e os achados científicos entre grupos de pesquisa independentes. Para superar a chamada "crise de replicação", são urgentemente necessários modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), propõe-se um modelo padronizado de camundongos de oclusão de artéria cerebral média transitória (MCAo). Este modelo permite a restauração completa do fluxo sanguíneo após a remoção do filamento, simulando a lise de coágulos terapêutico ou espontâneo que ocorre em grande proporção de derrames humanos. O procedimento cirúrgico deste modelo de avc "filamento" e ferramentas para sua análise funcional são demonstrados no vídeo que acompanha.

Introdução

O AVC é uma das causas mais comuns de morte e incapacidade em todo o mundo. Embora existam principalmente duas formas distintas de derrame, isquêmicas e hemorrágicas, 80-85% de todos os casos de acidente vascular cerebral são isquêmicos1. Atualmente, apenas dois tratamentos estão disponíveis para pacientes com AVC isquêmico: tratamento farmacológico com ativador de plasmininogen de tecido recombinante (rtPA) ou trombio mecânica. No entanto, devido à estreita janela de tempo terapêutico e aos critérios de exclusão múltipla, apenas um número seleto de pacientes pode se beneficiar dessas opções específicas de tratamento. Nas últimas duas décadas, a pesquisa de AVC pré-clínico e translacional se concentrou no estudo de abordagens neuroprotetoras. No entanto, todos os compostos que atingiram os ensaios clínicos não apresentaram até agora melhorias para o paciente2.

Uma vez que os modelos in vitro não podem reproduzir com precisão todas as interações cerebrais e mecanismos fisiodicos do AVC, modelos animais são cruciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. No entanto, imitar todos os aspectos do AVC isquêmico humano em um único modelo animal não é viável, pois o AVC isquêmico é uma doença altamente complexa e heterogênea. Por essa razão, diferentes modelos de avc isquêmico foram desenvolvidos ao longo do tempo em diferentes espécies. Fototrombose de arteriolas cerebrais ou oclusão distal permanente da artéria cerebral média (MCA) são modelos comumente utilizados que induzem lesões pequenas e localmente definidas no neocórtex3,4. Além desses, o modelo de traçado mais usado é provavelmente o chamado "modelo de filamento", no qual uma oclusão transitória de MCA é alcançada. Este modelo consiste em uma introdução transitória de um filamento de sutura à origem da AMC, levando a uma redução abrupta do fluxo sanguíneo cerebral e ao subsequente grande infarto das regiões cerebrais subcorticas e corticas5. Embora a maioria dos modelos de traçado imite oclusões MCA 6,o "modelo de filamento" permite a delimitação precisa do tempo isquêmico. A reperfusão por remoção de filamentos imita o cenário clínico humano de restauração do fluxo sanguíneo cerebral após espontâneo ou terapêutico (rtPA ou trombectomia mecânica) de lise de coágulos. Até o momento, foram descritas diferentes modificações deste "modelo de filamento". Na abordagem mais comum, descrita pela primeira vez por Longa et al. em 19895, um filamento revestido de silício é introduzido através da artéria carótida comum (CCA) à origem da MCA7. Embora seja uma abordagem amplamente utilizada, este modelo não permite a restauração completa do fluxo sanguíneo durante a reperfusão, uma vez que a CCA é permanentemente ligada após a remoção do filamento.

Na última década, um número crescente de grupos de pesquisa tem se interessado em modelar o avc em camundongos usando este "modelo de filamento". No entanto, a considerável variabilidade desse modelo e a falta de padronização dos procedimentos são algumas das razões para a alta variabilidade e baixa reprodutibilidade dos resultados experimentais e achados científicos relatados até agora2,8. Uma causa potencial da atual "crise de replicação", referindo-se à baixa reprodutibilidade entre os laboratórios de pesquisa, são os volumes infartos não comparáveis entre grupos de pesquisa utilizando a mesma metodologia experimental9. De fato, após a realização do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizadopré-clínico 10,pudemos confirmar que a falta de padronização suficiente deste modelo experimental de AVC e os parâmetros de desfecho subsequentes foram as principais razões para a falha da reprodutibilidade em estudos pré-clínicos entre laboratórios independentes11 . Essas diferenças drásticas nos tamanhos de infarto resultantes, apesar de usarem o mesmo modelo de AVC, representam justificadamente não apenas uma ameaça à pesquisa confirmatória, mas também às colaborações científicas devido à falta de modelos robustos e reprodutíveis.

Diante desses desafios, buscamos desenvolver e descrever detalhadamente o procedimento para um modelo de MCAo transitório padronizado como utilizado para os esforços de pesquisa colaborativa dentro do consórcio de pesquisa "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Este consórcio tem como objetivo entender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC. Além disso, são apresentados métodos funcionais histológicos e relacionados para análise de desfechos de acidente vascular cerebral. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão estabelecidos utilizados em todos os laboratórios de pesquisa do consórcio ImmunoStroke.

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Protocolo

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados seguindo as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Camundongos C57Bl/6J machos de dez semanas de idade foram usados e abrigados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água.

1. Preparação do material e instrumentos

  1. Conecte a manta de calor para manter a temperatura da área de operação e a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 °C.
  2. Tesoura autoclave e fórceps, prepare 70% de solução de etanol e mantenha disponível pomada de olhos dexpanthenol, vários pedaços de algodão, e 5-0 sutura de poliéster trançado revestido pronto para uso. Prepare uma seringa de 1 mL com solução salina de 0,9% (sem agulha) para manter o local de incisão do animal hidratado. Prepare o gás anestesia (100% O2 + isoflurane).
  3. Prepare um suporte para a sonda Doppler laser cortando a ponta de uma ponta de tubulação de 10 μL (comprimento de 3-5 mm).
    NOTA: Todos os instrumentos são esterilizados usando um esterilizador de contas quentes. As superfícies também são desinfetadas antes e depois da cirurgia com um spray desinfetante microbiano. Antes da cirurgia, as áreas ao redor da cabeça e peito de camundongos são desinfetadas com um spray de desinfecção de feridas.

2. Preparação do laser Doppler

  1. Injete analgesia no camundongo 30 min antes da cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina, intraperitoneally).
  2. Anestesiar o rato colocando-o na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% até a cessação do movimento espontâneo do corpo e vibrissae.
  3. Coloque o mouse em uma posição propensa na área de operação com o nariz na máscara de anestesia. Mantenha a concentração de isoflurane em 4% por mais um minuto, depois reduza-a e mantenha-a em 2%.
  4. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associado para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C e insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos.
  5. Aplique pomada dexpanthenol nos dois olhos.
  6. Desinfete a pele e o cabelo ao redor do olho esquerdo e orelha com 70% de etanol.
  7. Corte o couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho (1 cm de comprimento) para expor o osso do crânio.
  8. Corte e retire o músculo temporal para visualizar o MCA sob o crânio.
  9. Fixar com cola a parte externa da ponta segurando a sonda/fibra do Doppler laser em cima da MCA esquerda com cola. Em seguida, cole a pele para fechar a ferida ao redor do suporte da ponta. Aplique 2-3 gotas de cola endurecedora para acelerar o processo. Certifique-se de que a fibra do doppler laser não está colada e pode ser facilmente removida do suporte da ponta a qualquer momento.

3. Modelo de MCAo transitório (oclusão)

  1. Transforme o mouse na posição supina. Coloque o focinho no cone de anestesia e conserte as patas com fita adesiva.
  2. Desinfete a pele e o cabelo ao redor do peito e faça uma incisão midline de 2 cm de comprimento no pescoço.
  3. Use fórceps para puxar a pele e as glândulas submandibulares separadas. Use retráteis para segurar o músculo estemastoide, exponha o campo cirúrgico e encontre a artéria carótida comum esquerda (CCA). Disseque a CCA livre de tecido conjuntivo e nervos circundantes (sem prejudicar o nervo vagal) e realize uma ligadura transitória antes da bifurcação.
  4. Disseque a artéria carótida externa (ECA) e amarre um nó permanente na parte visível mais distal. Coloque outra sutura sob o ECA, perto da bifurcação, e prepare um nó solto para ser usado posteriormente.
  5. Disseca a artéria carótida interna (ICA) e coloque um clipe microvascular sobre ele, 5 mm sobre a bifurcação. Certifique-se de não danificar o nervo vagal.
  6. Corte um pequeno buraco no ECA entre as ligaduras apertadas e soltas; tenha cuidado para não cortar todo o ECA.
  7. Introduza o filamento e avance-o em direção à CCA. Aperte a ligadura solta no ECA ao redor do lúmen para fixar em breve o filamento nessa posição e evitar sangramento ao remover o clipe microvascular.
  8. Remova o clipe microvascular e insira o filamento através do ICA até que a origem do MCA seja atingida pela detecção de uma redução acentuada (>80%) no fluxo sanguíneo cerebral medido pelo laser Doppler. Fixar o filamento nesta posição apertando ainda mais o nó em torno do TCE.
    NOTA: Quando o filamento vai em direção adequada, ele avança suavemente, e nenhuma resistência deve ser observada.
  9. Registo do doppler laser antes e depois da inserção do filamento.
  10. Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide e as glândulas submandibulares antes de suturar a ferida. Remova a sonda Doppler laser e coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1 h (até a remoção do filamento).

4. Modelo de MCAo transitório (Reperfusion)

  1. Anestesiar o rato colocando-o na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% até a cessação do movimento espontâneo do corpo e vibrissae.
  2. Aplique pomada dexpanthenol nos dois olhos.
  3. Coloque o mouse em uma posição propensa na área de operação com seu focinho na máscara de anestesia. Mantenha a concentração de isoflurane em 4% por mais um minuto, depois reduza-a e mantenha-a em 2%. Conserte as patas do animal com fita adesiva.
  4. Insira a sonda Doppler laser no suporte da sonda.
  5. Remova a sutura da ferida, use fórceps para puxar a pele e as glândulas submandibulares separadas. Use retráteis para puxar suavemente o músculo estemastoide e expor o campo cirúrgico.
  6. Solte a sutura ECA que aperta o filamento e puxe suavemente o filamento. Evite danificar o revestimento de borracha de silicone do filamento durante a remoção.
  7. Amarre firmemente a sutura do ECA.
  8. Confirme o aumento do fluxo sanguíneo cerebral no dispositivo Doppler laser (>80% do valor inicial antes da reperfusão).
  9. Registos do doppler laser antes e depois da remoção do filamento.
  10. Abra a ligadura transitória antes da bifurcação da CCA.
  11. Remova o retrátil e realoque o músculo estemastoide e as glândulas submandibulares antes de suturar a ferida. Coloque o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1h para se recuperar da anestesia.
  12. Após a recuperação, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.
  13. Cuide dos animais adicionando pelotas de comida molhada e hidrogel em pequenas placas de Petri no chão da gaiola até o dia 3 após a cirurgia.
  14. Injete analgesia a cada 12 h para 3 d após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).

5. Operação Sham

  1. Realizar todos os procedimentos conforme descrito acima, incluindo a ligadura das artérias e a introdução do filamento (etapas 1-3.7).
  2. Remova o filamento imediatamente após sua inserção. Em seguida, coloque o animal na câmara de recuperação por 1h.
  3. Coloque o animal na área de operação novamente, e remova a ligadura transitória da CCA para garantir a restauração completa do fluxo sanguíneo cerebral.
  4. Suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C por 1h para se recuperar da anestesia. Após a recuperação, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.
  5. Cuide dos animais adicionando pelotas de comida molhada e hidrogel em pequenas placas de Petri no chão da gaiola até o dia 3 após a cirurgia.
  6. Injete analgesia a cada 12 h para 3 d após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).

6. Neuroscore

  1. Realize o Neuroscore sempre na mesma hora do dia, e use roupas cirúrgicas para manter um "cheiro neutro" entre cirurgiões individuais.
  2. Deixe os ratos descansarem por 30 minutos na sala com uma gaiola "aberta" antes do teste.
  3. Observe cada item na Tabela 1 e Tabela 2 para 30 s.

7. Perfusão de Intracardiac

  1. Prepare uma seringa de 20 mL contendo soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS)-heparina (2 U/mL) e coloque-a 1 m acima do banco para facilitar a perfusão movida pela gravidade. (OPCIONAL: Realizar perfusão intracardiac com 4% de paraformaldeído (PFA) utilizando uma seringa de 20 mL contendo 4% de PFA em PBS, pH 7,4).
  2. Injete intrperitoneally 100 μL de cetamina e xilazina (120 e 16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 min e confirme a cessação do movimento espontâneo do corpo e da vibrissae.
  3. Fixar o animal em uma posição supina, e desinfetar a superfície abdominal do corpo com 70% de etanol.
  4. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento no abdômen; corte o diafragma, as costelas e o esterno para visualizar completamente o coração.
  5. Faça uma pequena incisão no átrio direito e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo.
  6. Perfuse com 20 mL de PBS-heparin.
  7. Após a perfusão, decapite o animal e remova o cérebro.
  8. Congele o cérebro em gelo seco em pó e armazene a -80 °C até que use mais.

8. Volumetria infarto

  1. Para criocessão, use um criostat para cortar o cérebro em seções de 20 μm de espessura a cada 400 μm. Coloque as seções em slides e armazene os slides a −80 °C até usar.
  2. Mancha de cresyl violeta (CV)
    1. Prepare a solução de coloração mexendo e aquecendo (60 °C) 0,5 g de acetato cv em 500 mL de H2O até que os cristais sejam dissolvidos. Depois que a solução esfriar, armazene-a em uma garrafa escura. Reaqueça a 60 °C e filtre antes de cada uso.
    2. Deixe os slides secarem à temperatura ambiente por 30 minutos. Mergulhe-os em 95% de etanol por 15 min, em 70% de etanol por 1 min, e depois em 50% de etanol por 1 min.
    3. Mergulhe os slides em água destilada por 2 minutos; refrescar a água destilada e colocar os slides na água por 1 min. Depois, mergulhe os slides na solução de coloração pré-aquecida por 10 min a 60 °C. Lave as lâminas duas vezes em água destilada por 1 min.
    4. Mergulhe os slides em 95% de etanol por 2 min. Coloque-os em 100% etanol por 5 min; refrescar o etanol 100% e colocar os slides novamente no etanol por 2 min. Depois, cubra os slides com um meio de montagem.
    5. Análise (Figura 4C)
      1. Escaneie os slides e analise o volume indireto de infarto pelo método Swanson12 para corrigir o edema usando a seguinte equação:
        (Área isquêmica) = (região isquêmica)-((hemisfério ipsilateral)-(hemisfério contralateral))

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Resultados

O modelo descrito aqui é uma modificação do modelo de traçado de "filamento" comumente utilizado, que consiste em introduzir um filamento revestido de silício através do ECA para bloquear transitoriamente a origem da MCA (Figura 1). Após a remoção do filamento, apenas o fluxo sanguíneo no TCE é permanentemente cessado, permitindo a recanalização completa do CCA e do ICA. Isso permite uma reperfusão adequada do cérebro (Figura 2), semelhante à situação observada ...

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Discussão

O presente protocolo descreve um modelo experimental de avc baseado no acordo de consenso de um consórcio alemão de pesquisa multicêntrico ("ImmunoStroke") para estabelecer um modelo de MCAo transitório padronizado. O modelo transitório de MCAo estabelecido pela introdução de um filamento revestido de silício através do ECA até a origem do MCA é um dos modelos de traçado mais utilizados para alcançar a reperfusão arterial após um período de oclusão delimitado. Portanto, este procedimento pode ser considerado um modelo de...

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Divulgações

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os nossos parceiros de colaboração do ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, das células imunes à recuperação do AVC) por sugestões e discussões. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha no âmbito do Cluster de Munique para Neurologia de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e sob as bolsas LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.1.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
45° rampaH& S Kunststofftechnikaltura: 18 cm
5/0 ameaçaPearsalls10C103000
SeringaBraun
Ácido AcéticoSigma Ciências da Vida695092
Sistema de anestesia para isofluranoDrager
Bepanthen pomadaBayer
C57Bl/6J camundongosCharles Braçadeira de000664
FST12500-12
ClipeFST18055-04
Suporte de clipeFST18057-14
CotonsNOBA Verbondmitel Danz974116
Cresyl violetSigma Life ScienceC5042-10G
CryostatThermo Scientific CryoStarNX70
Etanol 70%CLN Chemikalien Laborbedorf521005
Etanol 96%CLN Chemikalien Laborbedorf522078
Etanol 99%CLN Chemikalien LaborbedorfETO-5000-99-1
FilamentosDoccol602112PK5Re
Pinça angular fina45 FST11251-35
Pinça finaFST11252-23
Tesoura FinaFST14094-11
ColaOrechselnBSI-112
Endurecedor ColaDrechseln & MehrBSI-151
Manta de aquecimentoFHC DC Controlador
IsofluranoAbbotB506
IsopentanoFluka59070
CetaminaInresa Arzneimittel GmbH
Laser DopplerPerimedPF 5010 LDPM, Sistema de Perifluxo 5000
Sonda Laser DopplerPerimed91-00123
Tamponamento de fosfato pH salino: 7.4Apotheke Innestadt Uni MünchenP32799
Câmara de recuperaçãoMediheat
Roti-Histokit meio de montagemRoth6638.1
Solução salinaBraun131321
BisturiFeather02.001.30.011
Filamentos revestidos de siliconeDoccol602112PK5Re
StereomicroscópioLeicaM80
Superfrost Plus SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Vannas Spring ScissorsFST15000-00
XylacineAlbrecht
Riverde temperatura

Referências

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