Summary
脑中动脉阻塞（MCAo）的不同模型用于实验性中风研究。在这里，描述了通过颈外动脉（ECA）的短暂性MCAo的实验性中风模型，该模型旨在模仿人类中风，其中由于自发凝块溶解或治疗而切除脑血管血栓。
Abstract
在发达国家，卒中是第三大常见死亡原因，也是获得性成人残疾的主要原因。迄今为止，治疗选择仅限于中风后最初几个小时内的一小部分卒中患者。正在广泛研究新的治疗策略，特别是延长治疗时间窗口。目前的这些研究包括研究卒中后重要的病理生理学途径，如卒中后炎症、血管生成、神经元可塑性和再生。在过去十年中，人们越来越关注独立研究小组对实验结果和科学发现的可重复性差的担忧。为了克服所谓的"复制危机"，迫切需要所有程序的详细标准化模型。作为"免疫中风"研究联盟（https://immunostroke.de/）的一项努力，提出了一种短暂的脑中动脉阻塞（MCAo）的标准化小鼠模型。该模型允许在去除细丝时完全恢复血流，模拟在大部分人类中风中发生的治疗性或自发性凝块裂解。该"细丝"卒中模型的外科手术过程及其功能分析工具在随附的视频中进行了演示。
Introduction
中风是全世界最常见的死亡和残疾原因之一。虽然脑卒中主要有两种截然不同的形式，缺血性和出血性，但80-85%的卒中病例是缺血性1。目前，缺血性卒中患者只有两种治疗方法：重组组织纤溶酶原激活剂（rtPA）的药物治疗或机械血栓切除术。然而，由于治疗时间窗口狭窄和多种排除标准，只有少数患者可以从这些特定的治疗方案中受益。在过去的二十年中，临床前和转化卒中研究一直集中在神经保护方法的研究上。然而，到目前为止，所有进入临床试验的化合物都没有显示出对患者2的改善。
由于体外模型不能准确再现中风的所有大脑相互作用和病理生理机制，因此动物模型对于临床前卒中研究至关重要。然而，在单个动物模型中模拟人类缺血性卒中的各个方面是不可行的，因为缺血性卒中是一种高度复杂和异质性疾病。因此，随着时间的推移，不同物种中已经开发了不同的缺血性卒中模型。脑小动脉光血栓形成或大脑中动脉永久性远端闭塞（MCA）是常用的模型，可诱导新皮层中小而局部定义的病变3，4。除此之外，最常用的中风模型可能是所谓的"灯丝模型"，其中实现了MCA的瞬时闭塞。该模型包括将缝合线短暂引入MCA的起源，导致脑血流量突然减少以及随后皮质下和皮质脑区域的大梗死5。虽然大多数中风模型模仿MCA闭塞6，但"灯丝模型"允许精确地划定缺血时间。通过细丝去除进行再灌注，模拟自发性或治疗性（rtPA 或机械血栓切除术）裂解后脑血流恢复的人类临床情况。迄今为止，已经描述了这种"灯丝模型"的不同修改。在最常见的方法中，首先由Longa等人描述。在1989年5，一种硅涂层的长丝通过颈总动脉（CCA）引入MCA7的起源。虽然这是一种广泛使用的方法，但该模型不允许在再灌注期间完全恢复血流，因为CCA在去除细丝后永久结扎。
在过去的十年中，越来越多的研究小组对使用这种"细丝模型"对小鼠中风进行建模感兴趣。然而，该模型的相当大的可变性和程序缺乏标准化是实验结果和迄今为止报道的科学发现具有高变异性和较差再现性的一些原因2，8。当前"复制危机"的一个潜在原因，指的是研究实验室之间的低可重复性，是使用相同的实验方法的研究小组之间不具可比性的中风梗死体积9。事实上，在进行了第一项临床前随机对照多中心试验研究10后，我们能够证实，该实验中风模型缺乏足够的标准化以及随后的结果参数是独立实验室之间临床前研究再现性失败的主要原因11.尽管使用相同的卒中模型，但由此产生的梗死尺寸的这些巨大差异不仅对验证性研究构成威胁，而且由于缺乏稳健且可重复的模型，也对科学合作构成威胁。
鉴于这些挑战，我们旨在开发和详细描述标准化瞬态MCAo模型的程序，该模型用于"免疫中风"研究联盟（https://immunostroke.de/）内的合作研究工作。该联盟旨在了解中风恢复机制原理背后的脑免疫相互作用。此外，还介绍了用于卒中结果分析的组织学和相关功能方法。所有方法均基于ImmunoStroke联盟所有研究实验室中使用的既定标准操作程序。
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Protocol
本视频中报告的实验是按照国家实验动物使用指南进行的，并且协议得到了德国政府委员会（Regierung von Oberbayern，慕尼黑，德国）的批准。使用10周龄的雄性C57Bl / 6J小鼠并将其饲养在受控温度（22±2°C）下，具有12小时的明暗循环期，并随意获得颗粒食物和水 。
1. 材料和仪器的准备
- 连接热毯，将手术区域的温度和麻醉期间的小鼠体温保持在37°C。
- 高压灭菌剪刀和镊子，准备70%乙醇溶液，并保持可用的dexpanthenol眼膏，几块棉花和5-0涂层编织聚酯缝合线准备使用。准备一个1毫升注射器，含有0.9%盐水溶液（不含针头），以保持动物切口部位水分充足。准备麻醉气体（100%O2 +异氟醚）。
- 通过切割10μL移液器尖端（3-5mm长度）的支架，为激光多普勒探头准备支架。
注：所有器械均使用热珠灭菌器进行灭菌。手术前后还用微生物消毒剂喷雾对表面进行消毒。在手术前，用伤口消毒喷雾对小鼠头部和胸部周围的区域进行消毒。
2. 激光多普勒的制备
- 手术前30分钟向小鼠注射镇痛剂（4mg / kg卡洛芬和0，1mg / kg丁丙诺啡，腹膜内注射）。
- 通过将小鼠置于异氟醚流速为4%的诱导室中来麻醉小鼠，直到自发的身体运动和振动停止。
- 将鼠标放在手术区域的俯卧位置，鼻子放在麻醉面罩中。将异氟醚浓度再保持在4%，然后再降低并将其保持在2%。
- 设置相关的反馈控制加热垫，用于将小鼠体温保持在37°C，并轻轻插入直肠探头以监测整个手术过程中的温度。
- 在双眼上涂抹dexpanthenol眼药膏。
- 用70%乙醇消毒左眼和耳朵周围的皮肤和头发。
- 切开左耳和眼睛之间的头皮（1厘米长）以暴露颅骨。
- 切除并停用颞肌，以可视化颅骨下方的MCA。
- 用胶水将激光多普勒探头/光纤固定在左侧MCA顶部的尖端外部。然后，粘合皮肤以关闭尖端支架周围的伤口。涂抹2-3滴硬化剂胶水以加快工艺。确保激光多普勒光纤未粘合，并且可以随时从尖端支架上轻松取下。
3. 瞬态 MCAo 模型（遮挡）
- 将鼠标转至仰卧位。将鼻子放入麻醉锥中，并用胶带固定爪子。
- 对胸部周围的皮肤和头发进行消毒，并在颈部做一个2厘米长的中线切口。
- 使用镊子将皮肤和下颌下腺分开。使用牵开器固定胸骨瘤肌，暴露手术区域并找到左颈总动脉（CCA）。解剖不含结缔组织和周围神经的CCA（不损伤迷走神经），并在分叉前进行短暂结扎。
- 解剖颈外动脉（ECA），并在最远端可见部分打一个永久性的结。在ECA下放置另一条缝合线，靠近分叉处，并准备一个松散的结以供以后使用。
- 解剖颈内动脉（ICA）并在其上放置一个微血管夹，在分叉处5mm处。确保不要损伤迷走神经。
- 在紧固和松动的结扎之间在ECA上切一个小孔;注意不要削减整个ECA。
- 引入灯丝并将其推进到CCA。拧紧腔周围ECA中的松散结扎，以将细丝固定在该位置，并在取下微血管夹时避免出血。
- 取下微血管夹并将细丝插入ICA，直到通过激光多普勒测量的脑血流量急剧减少（>80%）到达MCA的起源。通过进一步拧紧ECA周围的结，将灯丝固定在此位置。
注意：当灯丝朝向适当的方向时，它会平稳地前进，并且不应观察到阻力。 - 记录灯丝插入前后的激光多普勒值。
- 在缝合伤口之前，取出牵开器并重新定位胸骨瘤肌和下颌下腺。取出激光多普勒探针，并将动物置于37°C的恢复室中1小时（直到去除灯丝）。
4. 瞬态 MCAo 模型（再灌注）
- 通过将小鼠置于异氟醚流速为4%的诱导室中来麻醉小鼠，直到自发的身体运动和振动停止。
- 在双眼上涂抹dexpanthenol眼药膏。
- 将鼠标放在手术区域的俯卧位置，其鼻子放在麻醉面罩中。将异氟醚浓度再保持在4%，然后再降低并将其保持在2%。用胶带固定动物的爪子。
- 将激光多普勒探头插入探头支架。
- 取下伤口缝合线，用镊子将皮肤和下颌下腺分开。使用牵开器轻轻拉动胸骨肌并暴露手术区域。
- 松开拧紧细丝的ECA缝合线，然后轻轻拉动细丝。避免在去除过程中损坏长丝的硅橡胶涂层。
- 紧紧地系住 ECA 缝合线。
- 确认激光多普勒装置中脑血流量的增加（再灌注前初始值的>80%）。
- 记录去除灯丝之前和之后的激光多普勒值。
- 在与CCA分叉之前打开瞬态结扎。
- 取出牵开器，并在缝合伤口之前重新定位胸骨瘤肌和下颌下腺。将动物置于37°C的恢复室中1小时，以从麻醉中恢复。
- 恢复后，将小鼠放回温度受控室的笼子里。
- 通过在笼子地板上的小培养皿中加入湿的食物颗粒和水凝胶来照顾动物，直到手术后的第3天。
- 手术后每12小时注射一次镇痛药3天（4mg / kg卡洛芬和0.1mg / kg丁丙诺啡）。
5. 假操作
- 执行上述所有程序，包括动脉结扎和引入细丝（步骤1-3.7）。
- 插入后立即取下灯丝。然后，将动物置于恢复室中1小时。
- 再次将动物置于手术区，并去除CCA的瞬时结扎，以确保脑血流完全恢复。
- 缝合伤口，并将动物置于37°C的恢复室中1小时以从麻醉中恢复。恢复后，将小鼠放回温度受控室的笼子里。
- 通过在笼子地板上的小培养皿中加入湿的食物颗粒和水凝胶来照顾动物，直到手术后的第3天。
- 手术后每12小时注射一次镇痛药3天（4mg / kg卡洛芬和0.1mg / kg丁丙诺啡）。
6. 神经评分
- 始终在一天中的同一时间进行神经评分，并使用手术服在单个外科医生之间保持"中性气味"。
- 在测试之前，让小鼠在带有"开放"笼子的房间里休息30分钟。
- 观察 表1 和 表2 中的每个项目30秒。
7. 心内灌注
- 准备一个含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）-肝素（2 U / mL）的20 mL注射器，并将其放置在工作台上方1 m处，以促进重力驱动灌注。（可选：使用20 mL注射器进行4%多聚甲醛（PFA）的心内灌注，其中PBS中含有4%PFA，pH 7.4）。
- 腹膜注射100μL氯胺酮和木拉嗪（分别为120和16mg / kg体重）。等待5分钟，确认停止自发的身体运动和振动。
- 将动物固定在仰卧位，并用70%乙醇消毒腹部体表。
- 在腹部做一个3厘米长的切口;切开横膈膜、肋骨和胸骨，使心脏完全可视化。
- 在右心房做一个小切口，将灌注套管插入左心室。
- 用 20 mL PBS-肝素补液。
- 灌注后，将动物斩首并取出大脑。
- 将大脑冷冻在干冰粉上，储存在-80°C直至进一步使用。
8. 梗死容量试验
- 对于冷冻切片，使用低温恒温器将大脑切成每400μm一次的20μm厚切片。将切片放在载玻片上，并将载玻片储存在-80°C直至使用。
- 甲酚紫（CV）染色
- 通过搅拌并将0.5gCV醋酸盐在500mL H2O中加热（60°C）直到晶体溶解来制备染色溶液。溶液冷却后，将其存放在深色瓶子中。每次使用前重新加热至60°C并过滤。
- 让载玻片在室温下干燥30分钟。将它们浸入95%乙醇中15分钟，在70%乙醇中浸泡1分钟，然后在50%乙醇中浸泡1分钟。
- 将载玻片浸入蒸馏水中2分钟;刷新蒸馏水，将载玻片放入水中1分钟。之后，将载玻片浸入预热的染色溶液中，在60°C下浸泡10分钟。 在蒸馏水中洗涤载玻片两次1分钟。
- 将载玻片浸入95%乙醇中2分钟。将它们置于100%乙醇中5分钟;刷新100%乙醇，并将载玻片再次置于乙醇中2分钟。之后，用安装介质盖住载玻片。
- 分析（图4C）
- 扫描载玻片，并使用斯旺森方法12 分析间接梗死体积，以使用以下等式纠正水肿：
（缺血区） = （缺血区）-（（同侧半球）-（对侧半球））
- 扫描载玻片，并使用斯旺森方法12 分析间接梗死体积，以使用以下等式纠正水肿：
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Representative Results
这里描述的模型是对常用的"灯丝"行程模型的修改，该模型包括通过ECA引入硅涂层灯丝以暂时阻断MCA的起源（图1）。去除细丝后，只有ECA中的血流永久停止，允许CCA和ICA完全再通。这允许对大脑进行充分的再灌注（图2），类似于在人类患者中成功进行药物溶栓或机械血栓切除术后观察到的情况。此外，这项工作还描述了一种在闭塞和再灌注过程中测量脑血流量的方法，方法是将连接到激光多普勒探针的套管固定在MCA区域的颅骨上。
当由训练有素的外科医生进行时，外科手术的总死亡率为<5%。在MCAo之后的早期时间点，动物通常表现出严重的姿势和运动缺陷，全身无力和体重减轻13。这些严重的缺陷是短暂的，动物在大约1周后表现出改善的活动;因此，这些缺陷对局灶性神经系统症状更具特异性。
MCA闭塞后的行为缺陷通过复合神经评分14进行评估;手术后24小时和3 d测量全身和局灶性缺陷。一般神经评分综合了5个项目（表1），包括对皮毛，耳朵，眼睛，姿势和自发活动的评估，最高得分为18。焦点神经评分包括7个项目（表2），包括身体对称性，步态，攀爬，盘旋行为，前肢对称性，强制循环和胡须反应的评估，最高得分为28分。综合比额表的范围从0（无缺陷）到46（严重损伤）。与假动物相比，中风动物在复合和局灶性神经评分中呈现显着变化，但在一般神经评分中没有显着变化（图3）。
在中风诱导后24小时，还使用冠状连续脑切片的Cresyl紫罗兰染色进行梗死体积测定。梗死体积平均值为61.69 mm3，占受影响脑半球的48%（图4）。当由训练有素的外科医生进行时，该卒中模型的总体变异性较低，变异系数为<6%。病变区域包括躯体感觉和运动皮层以及皮质下结构，如纹状体（图4）。
图1：进入和腔内MCA闭塞的方案。将细丝（虚线）插入ECA的近端和远端缝合结之间，并沿着ICA向前推进，直到到达MCA的起源（见插图）。一旦到位，ECA用缝合线连接以固定细丝。缩写：ACA =大脑前动脉;BA = 基底动脉;CCA =颈总动脉;ECA = 颈外动脉;ICA = 颈内动脉;MCA = 大脑中动脉;PCA = 后交通动脉;PTG = 翼腭动脉。这个数字是从杰克曼等人修改而来的。15.请单击此处查看此图的放大版本。
图2：闭塞和再灌注过程中的血流。 在细丝插入之前和之后以及去除灯丝之前和之后记录血流量。在闭塞期间观察到血流量减少，在再灌注期间血流恢复。每种颜色代表一种动物。缩写：MCA =大脑中动脉;CBF = 脑血流量;A.U. = 任意单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：tMCAo后功能缺陷的神经评分。（A）总分，（B）局灶性，以及（C）tMCAo之前和24小时和3 d后的一般神经评分。开放式酒吧：假;黑条：tMCAo。n=每组 10。*p < 0.05。缩写：tMCAo =短暂的脑中动脉阻塞;BL = 在 tMCAo 之前。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：tMCAo后24小时的体积性梗死分析和梗死结果（A）在tMCAo后24小时每400μm进行一次代表性的甲酚紫染色冠状脑切片。虚线划定病变区域。（B） tMCAo后24小时10个脑（每个点代表一个单独的脑）的梗死体积分析。水平红线表示平均值（61.69 mm3），误差条表示标准偏差（3.78 mm3）。（C） 从甲状紫罗兰色冠状截面计算梗死体积的代表性图像。蓝色 = 对侧半球;红色 = 同侧半球;苍白条纹区域 = 缺血区域。请点击此处查看此图的放大版本。
| 得分的时间点 | 得分 | ||
| 一般神经评分 | 毛 | 0.头发整洁干净 | |
| 1. 2个身体部位（鼻子和眼睛）的局部毛发和脏毛 | |||
| 2. >2个身体部位的毛发脱落和脏毛 | |||
| 耳朵 （鼠标放在打开的台面上） | 0.正常（耳朵横向和向后伸展，它们通过拉直以下噪音来做出反应） | ||
| 1.横向拉伸但不在后面（一个或两个），它们对噪音有反应 | |||
| 2. 与 1 相同。对噪音没有反应。 | |||
| 眼睛 （将鼠标放在 OBT 上） | 0.打开，清洁并快速跟随周围环境 | ||
| 1.开放，以水性粘液为特征。慢慢跟随周围的环境 | |||
| 2.开放，以深色粘液为特征 | |||
| 3.椭圆形，以深色粘液为特征 | |||
| 4. 已关闭 | |||
| 姿势 （将鼠标放在手掌上，轻轻摆动） | 0.鼠标直立，背部平行于手掌。在摆动过程中，它迅速站立。 | ||
| 1.鼠标站立驼背。在挥杆过程中，它会使身体变平以获得稳定性。 | |||
| 2.躯干的头部或部分位于手掌上。 | |||
| 3.鼠标位于一侧，几乎无法恢复直立位置。 | |||
| 4.鼠标处于俯卧位置，无法恢复直立位置。 | |||
| 自发性 （OBT上的小鼠） | 0.鼠标是警觉的，并主动探索。 | ||
| 1.鼠标看起来很警觉，但它平静而迟钝。 | |||
| 2.鼠标间歇性地缓慢地探索。 | |||
| 3.鼠标昏昏欲睡，麻木，现场动作少。 | |||
| 4.No 自发运动 | |||
| 一般评分的总分 | |||
| （正常 =0 最大值=18） | |||
表1：一般神经评分。根据严重程度，动物在所测量的五种一般缺陷中的每一种都获得了0到4分。然后将不同领域的分数相加，以提供从0到18的一般总分。此表已从 Clark 等人14 修改而来 。缩写：OBT = 开放式台式。
| 得分的时间点 | 得分 | ||
| 局灶性神经评分 | 身体对称性 （将鼠标放在OBT上，观察鼻子 - 尾巴线） | 0.正常（身体：姿势正常，躯干从长凳上抬起，前肢和后肢倾斜在身体下方。尾部：直） | |
| 1.轻微不对称（身体：一侧倾斜，前肢和后肢倚靠在身体下方。尾巴：略微弯曲） | |||
| 2.中度不对称（身体：一侧倾斜，前肢和后肢伸展。尾巴：略微弯曲） | |||
| 3.明显的不对称性（身体：弯曲，一侧位于OBT上。尾巴：弯曲） | |||
| 4.极端不对称（身体：高度弯曲，一侧不断位于OBT上。尾巴：高度弯曲） | |||
| 步态 （在OBT上鼠标。未受干扰地观察到） | 0.正常（步态灵活，对称且快速） | ||
| 1.僵硬，不灵活（驼背行走，比正常鼠标慢） | |||
| 2.跛行，运动不对称 | |||
| 3.颤抖，漂移，跌倒 | |||
| 4.不自发行走（当受到轻轻推鼠刺激时，行走不超过3步） | |||
| 攀爬 （鼠标在45o 表面上。将鼠标放在夹持表面的中心） | 0. 正常（鼠标爬升很快） | ||
| 1. 攀爬伴有拉伤，肢体无力 | |||
| 2.保持斜坡，不会滑倒或攀爬 | |||
| 3.滑下斜坡，不成功防止失败 | |||
| 4.立即滑动，无需努力防止失败 | |||
| 盘旋行为 （鼠标在OBT上，自由观察） | 0. 不存在盘旋行为 | ||
| 1. 主要是单侧转弯 | |||
| 2.一侧的圆圈，尽管不是经常 | |||
| 3. 不断向一侧循环 | |||
| 4. 旋转、摇摆或无移动 | |||
| 前肢对称性 （小鼠由尾巴悬挂） | 0. 正常 | ||
| 1.轻度不对称：对侧前肢轻度屈曲 | |||
| 2.明显的不对称性：对侧肢体明显屈曲，身体在同侧略微弯曲 | |||
| 3.明显的不对称性：对侧前肢粘附在躯干上 | |||
| 4.轻微不对称，无身体/肢体运动 | |||
| 强制盘旋 （长凳上的前肢，尾巴悬垂的后肢：显示对侧肢瘫的存在） | 0. 缺席。两个前肢正常伸展 | ||
| 1.倾向于转向一侧（鼠标伸展两个前肢，但开始转向一侧更好） | |||
| 2.向一侧转圈（与健康小鼠相比，鼠标向一侧转动较慢） | |||
| 3.缓慢地向一侧旋转（鼠标转向一侧无法执行完整的圆圈） | |||
| 4.不前进（后备箱前部位于长凳上，动作缓慢而短暂） | |||
| 晶须响应 （鼠标在 OBT 上） | 0. 正常 | ||
| 1.光不对称（当对侧刺激时，鼠标缓慢退出） | |||
| 2.明显的不对称性（对侧刺激时无反应） | |||
| 3.对侧无反应，同侧刺激反应缓慢 | |||
| 4. 双侧无反应 | |||
| 局灶性缺陷总分 | |||
| （正常 =0 最大值 =28） | |||
表2：局灶性神经评分。动物接受0到4分，具体取决于所测量的七种一般缺陷中每种缺陷的严重程度。然后将不同区域的分数相加，以提供从0到28的总焦点分数。此表已从 Clark 等人14 修改而来 。缩写：OBT = 开放式台式。
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Discussion
本方案描述了一种实验性卒中模型，该模型基于德国多中心研究联盟（"ImmunoStroke"）的共识协议，以建立标准化的瞬态MCAo模型。通过将硅涂层灯丝通过ECA引入MCA的起源而建立的瞬态MCAo模型是使用最广泛的卒中模型之一，用于在限定的闭塞期后实现动脉再灌注。因此，此过程可以被视为与翻译相关的笔画模型。
与前面描述的其他卒中模型相比，视频中介绍的"灯丝模型"具有一些优点，例如不需要开颅术和实现短暂闭塞血管的完全再灌注。然而，手术干预的复杂性可以被认为是一个限制，因为它包括侵入性手术和对靠近气管和迷走神经的不同动脉的精确操作。动物长时间暴露于麻醉剂也可能是一个需要考虑的关键因素，因为麻醉剂对神经保护和中风结果的影响已经得到充分记录16。最后，尽管这种外科手术很复杂，但由训练有素的外科医生进行，可以在大约20分钟内完成。
与前面描述的"细丝"卒中方案17相反，这里描述的方法还允许测量阻塞和再灌注阶段的脑血流量。再灌注期间的血流监测可能是预防卒中再灌注损伤的重要参数18，已知中风再灌注损伤会对接受药物或血管内干预以重新通血栓血管的患者造成有害后果。尽管MCAo19后脑血流恢复的后果存在差异，但中风后血流恢复的变异性可能会影响脑中的病理生理和生化事件，以及中风小鼠20的梗死体积和神经功能障碍。因此，在该模型中，完全恢复血流及其记录是确保小鼠中可重复性梗死的要求，特别是在转化性卒中研究中。
手术过程中的总死亡率低于 5%，主要由麻醉并发症、出血或预定义的排除标准导致的牺牲引起。然而，该卒中模型在中风诱导后的前24-48小时内呈现出中等死亡率，这可能会增加每个实验所需的动物数量，以实现足够的中风小鼠队列。就梗死体积而言，该模型可诱发大面积梗死，病变覆盖半球的50%。它还会产生脑水肿，影响不同的大脑区域，包括皮质和皮质下区域。
为了实现冲程模型的低变异性和高再现性，应考虑几个排除标准，包括：1）操作时间>20分钟;2）结扎CCA时>20%的血流量减少（步骤3.3）;3）闭塞时血流量减少<初始预闭塞值的80%;4）再灌注后10 min血流量增加，与再灌注前值相比，<80%。对于经验丰富且训练有素的外科医生，由于手术时间标准，不会排除任何动物。然而，10-15%的动物在CCA结扎时血流量减少20%，5-10%的动物在闭塞或再灌注期间血流量没有充分减少或增加。因此，根据这些标准排除动物后的成功率约为75-85%。
此外，在MCAo（体重，体温和基本生理行为）后每天检查动物，以控制疾病，疼痛或不适行为。除了这种一般护理外，尽管所有已知的测试都用于评估感觉运动功能障碍，例如Rotarod测试21，粘性标签测试22，角落测试23或圆柱体测试24，但已经开发了几种用于局灶性脑缺血后特定行为分析的测试。在这里，选择用于建立该中风模型的动物被评估为局灶性和一般缺陷，因为细丝模型还诱导独立于局灶性（感觉或运动）缺陷的细胞因子疾病行为25。综上所述，这里描述的"细丝"卒中模型是基础和转化卒中研究的宝贵模型。该模型被提议作为标准化的中风模型，用于协调实验室之间的卒中模型。
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Disclosures
作者没有竞争利益可披露。
Acknowledgments
我们感谢免疫中风联盟（FOR 2879，从免疫细胞到中风恢复）的所有合作伙伴的建议和讨论。这项工作由德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）资助，在慕尼黑系统神经病学集群（EXC 2145 SyNergy - ID 390857198）的框架内，根据德国卓越战略，并根据资助LI-2534 / 6-1，LI-2534 / 7-1和LL-112 / 1-1资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
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