Summary
本論文は、ラットにおける部分的な異所性骨髄性骨切りばん移植プロトコルと、中期的なフォローアップにおけるその潜在的な結果を提示する。
Abstract
血管化複合同種移植(VCA)は、複雑な組織欠損後の自家外科的可能性のない患者にとって最も先進的な再建オプションを表す。顔と手の移植は、失踪した患者の生活を変え、新しい美的で機能的な社会的器官を与えました。有望な結果にもかかわらず、VCAは生涯にわたる免疫抑制の併存疾患および感染性合併症のために依然として不全である。ラットは、免疫経路と移植片拒絶メカニズムを調査する インビボ 研究のための理想的な動物モデルです。ラットはまた、灌流および凍結保存研究を含む新規複合組織移植片保存技術にも広く使用されている。ラットのVCAに使用されるモデルは、術後の罹患率と死亡率が低く、再現性、信頼性、効率的でなければなりません。異所性四肢移植手順はこれらの基準を満たし、整形性肢移植よりも容易に行うことができます。げっ歯類の微小外科モデルを習得するには、マイクロサージャストと動物ケアにおける確かな経験が必要です。本明細書では、ラットにおける部分的な異形性骨筋切裂フラップ移植、術後の転帰、および潜在的合併症の予防手段の信頼性と再現性モデルが報告されている。
Introduction
過去20年間、VCAは顔1、上肢切断2、陰茎3、その他の複雑な組織欠損4、5を含む重度の欠損に苦しむ患者のための革命的な治療法として進化してきました。しかし、生涯にわたる免疫抑制の結果は、依然としてこれらの複雑な再建手術のより広範な適用を妨げている。拒絶反応防止戦略を改善するには、基礎研究が不可欠です。VCA保存時間の増加は、移植物流を改善し、ドナープールを増やすためにも不可欠です(VCAドナーは、皮膚のトーン、解剖学的サイズ、性別を含む固体臓器提供者よりも多くの基準を満たす必要があります)。この文脈において、ラット四肢移植は、同種移植片6、7、新規耐性誘導プロトコル8、および保存研究9、10、11の免疫拒絶反応に関する研究で広く使用されている。したがって、これらのVCAモデルは、VCA翻訳研究のために習得する重要な要素です。
骨筋皮折れはラット8、12、13、14でVCAを研究する信頼性の高いモデルとして文献に記載されている。異形性外接合体全四肢移植は移植片機能の長期評価を可能にするが、術後の罹患率および死亡率14の上昇に伴う時間のかかる処置である。対照的に、異所性肢移植モデルは機能しないが、VCAに関する再現性のある研究を可能にする。術後の結果は、ラットVCA移植研究の開始前に確実に予想することができる。本研究は、ラットにおける部分的な異所性骨髄皮下フラップ移植モデルを報告し、3週間のフォローアップ期間中に術中および術後に起こり得る頻繁な結果および合併症を含む。
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Protocol
すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って人道的ケアを受けました。施設動物のケアと使用委員会(IACUCプロトコル2017N000184)と動物ケアと使用レビューオフィス(ACURO)は、すべての動物プロトコルを承認しました。全ての実験に対して、近親交配オスルイスラット(250〜400g)を用いた。
1. 手術
- イオブルラン吸入を使用してルイスラットを麻酔します。誘導室で5%イオブルランで麻酔を誘発し、呼吸コーンを通して1.5〜3%のイオブルラン吸入で麻酔を維持する。
- 生存手順で手術前に眼潤滑剤を塗布する。手術部位を剃り、脱毛クリームで治療し、スクラブし、滅菌ドレープでドレープします。
- 切開前および処置中に定期的につま先ピンチテストで全麻酔を確認します。全手順を通して心臓と呼吸の速度を監視します。すべての手術のために、無菌の器具、消耗品、ドレープ、手袋を使用して、無菌状態を維持します。手順に使用する計測器のリストについては、 材料表 を参照してください。
2. ドナー権利部分後肢調達
- 脚の遠位 3 分の 1 で足首の上の皮膚の周回切開を行います。
- 双極鉗子を用いて、伏在性動脈および大窩動脈の末端枝を骨格化し、焼灼する。発送し、脛骨が露出するまで胃腸、ソレウス、脛骨前、上腕二頭筋の筋肉を遮断する。
- 右のりぐるしで2.5cmの切開を行います。りうるう脂肪パッドを解剖し、遠ざけ、大腿骨の血管を露出させる。魚のフックレトラクターを使用して、イングイナル靭帯とクランプ鉗子を把握して、インジナル脂肪パッドを遠位に保持します。
注: このイングイナル脂肪パッドは、部分的な四肢の収穫に含まれる。 - 大腿血管を解剖し、マーフィーの枝(通常、りんぐりと上皮枝の中間に位置する深部筋側副枝)を個別化し、8-0でリゲートするナイロンネクタイ。
- ドナーラットを100 IU/kgヘパリンでヘパリン化し、27.5G針を使用して陰茎の側側静脈に注入する。
- 股関節の周りの皮膚切開を完了します。
- 双極鉗子を用いて二頭筋大腿筋及び臀部の表面筋を焼灼する。大腿骨の中枢で坐骨神経を焼灼して切る。大腿骨を後腿骨の頂上のレベルで近位に露出する。
注:内転筋と四頭筋は調達から取り残されます。ノミネートペディクルは保存されます。 - りぎりの靭帯のレベルで8/0ナイロンの結びつきを持つ大腿血管をリゲート。合字のすぐ下の大腿動脈に動脈管を行い、24Gの血管カテーテルを挿入できるように拡張する。
- ペディクルの下に残りの筋肉を焼灼して切断し、大腿骨の前側を露出させる。
- 骨カッターを使用して脛骨と大腿骨を、それぞれ可能な限り近位および遠位(中長)に切ります。
- ヘパリン生理食い (100 IU/mL) の 2 mL で部分後肢を洗い流して、明確な静脈流出を得る。微小血管移動まで滅菌ガーゼに氷の上に保管する(図1)。
- 動物が全身麻酔下にある間、動物が生命の兆候を示さないまで(呼吸運動も心拍もない)まで、興奮によって安楽死を行う。
図1:ラット部分後肢採取 24Gの血管カスが大腿動脈に挿入され、異所性微小血管移動の準備が整う。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. 受け取り手術
- 切開前に、首の後ろを剃り、ブプレノルフィン0.01-0.05mg/kgを皮下に投与する。ラットを加熱パッドの上の上のサピーヌの位置に置きます。
- 右のりぐるしに2.5cmの切開を行います。うっとりした脂肪パッドを解剖し、遠位にリクライニングして大腿骨の血管を露出させる。フックを使用して、イングイナル靭帯とクランプ鉗子を引き込み、イングイナル脂肪パッドを遠位に保持します。
- 大腿骨の血管を解剖し、マーフィーの枝を個別化し、8/0ナイロンタイでリゲートします。
- 8/0ナイロンタイを使用して、上頭血管の上に両方の容器をリゲートします。近似クランプを近位に配置し、容器の端部を拡張します。ヘパリン生理食糸ですすい。
- 腰の上の左側面に切開を行い、皮下の折り目に皮下トンネルを持つ皮下ポケットを作成します。
注:インセット切開は、動物が正常な後肢運動を維持することを確実にするために、股関節の動きの範囲の上に作られています。さらに、移植片の差し込みと微小血管移動部位との間に切妻架橋を保つことで、移植片の固定性を向上できる(図2)。 - 微小血管移動のために、部分的な四肢の近位部分と皮下脂肪パッドを皮下トンネルに入れる。10/0ナイロン縫合糸を使用して静脈および動脈性アナストモーゼを行います。両方の近似クランプを取り外し、四肢の再血管化を観察する。両血管に対して「搾乳試験」を行い、各吻合の愛知を評価する。
注:静脈吻合には通常8~9本の縫合糸が必要で、動脈吻合では平均6縫合糸が必要です。 - 移植した四肢の内側側に縦方向皮膚切開を行い、移植片を挿入する。移植片の余分な皮膚を取り除き、吸収可能な4/0縫合糸を使用して別々の縫合糸とランニング縫合糸で創傷を閉じます。
- 移植された四肢のイングイナル脂肪パッドと2つの別々の吸収性縫合糸を使用してレシピエントを合わせて、微小血管性アナストモーセの最後の検査の後、最後の最後の端に歯深い折り目を閉じる。
注:インギナル脂肪パッドは、アナストモーゼの上に脂肪の保護層を追加し、移植片とそのペディクルの安全な位置を確保するためにしっかりと縫合されています。細心の注意を払った閉鎖は創傷治癒に適している。また、創傷からの残留出血を防ぎ、自己突然変異のリスクを減少させる。 - 周術期出血量に応じて、1-3 mLの生理食糸で皮下に水分損失を補償する。
- 動物の首の周りにエリザベスカラーを置き、正しい位置にそれを維持するために皮膚に2つの緩い縫合糸を適用します。
- イオブルラン吸入を停止し、完全に意識し、歩行するまで、温暖化パッド上で動物を継続的に監視します。
図2:骨筋皮切四肢の発症前の周術期画像 約1cmの切開ブリッジは、りとり折り目の切開と股関節上部の移植片の差との間に保存されます。移植片は橋の下に置かれ、微小血管移動のために安定した状態を保つ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
4. 術後ケア
- 動物を1日2回72時間監視し、術後日(POD)7まで1日1回、週に2回監視する。
注:モニタリングは、動物や移植片の状態に調整する必要があります(淡い目は、動物の痛みの指標として補充液、ポルフィリン染色、異常な移植片の色/温度を必要とする可能性があります)、獣医とさらなる注意を検討する必要があります。単一のハウジングは、移植片への損傷を避けるために、研究期間中にレシピエントラットに必要とされる。 - IACUC ガイドラインに従ってブプレノルフィンおよび/または非ステロイド抗炎症薬の皮下注射で鎮痛を行う.
- 移植片を評価し、同じ装置を使用して写真を使用して毎日身体検査を行います。
注:移植片の皮膚に脱毛クリームを使用すると、移植の皮膚の色をよりよく評価するのに役立ちます。
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Representative Results
本単一オペレータ研究では、30の異質性異重性局所的な四肢移植が行われた。成功は術後21日目にVCA障害または安楽死を必要とする合併症の欠如として定義された。移植片の正常な進化は 図3に示されている。レシピエントにおける部分的な四肢調達および移植片の差し込みのための平均持続時間は、それぞれ35と105分であった。平均虚血時間は105分であった。フォローアップ中に、2種類の合併症が発生した(表1)-早期または後期。いくつかの必要な安楽死、他のものは、救出され、すべてスタッフの獣医師と議論された(表2)。この研究は、げっ歯類のマイクロサージャリーの初心者のための著者の経験とアドバイスを報告します (補足表 1).
図3:研究終了までの異所性後肢モデルの正常な進化毛髪の再成長は、術後の最初の週に観察されます。2週間後に皮の引き込みが現れる。略語: POD = 術後日。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
周術期合併症の管理
動脈性または静脈血栓症は、最も一般的な周術期合併症である。これを克服し、手術を成功に変える最も重要なヒントは、早期診断、すなわち、フラップ色/出血および再発性開腸検査の継続的なモニタリングは、アナストモーゼ外科部位を閉鎖する前に基本的である。この合併症の予防は、切開が行われるとすぐに外科医の心の中にあるはずです。ドナーは、移植片動脈虚血の前にヘパリン100 IU /kg 5分のIV注入でヘパリン化する必要があります。一度収穫すると、静脈流出が明らかになるまで、移植片はヘパリン生理(100 IU/mL)で洗い流す必要があります。本研究では、周術期動脈血栓症は10%の症例で起こった。
出血は発生頻度が低く、移植片の筋肉の慎重な焼灼とレシピエント部位の徹底的な解剖で容易に軽減される。出血の主な原因は、動脈の鼻血性漏れである。これは3分以内に、またはそうでなければ、漏れた吻当の再クランプと改訂が必要な場合は、それ自体で解決する必要があります。症例の6.7%で起こった麻酔関連合併症は、訓練を受けていない微小外科医でより頻繁である。イオブルランを使用すると、ラットを麻酔する信頼性の高い方法であり、麻酔の長さはリアルタイムで調整することができます。外科医は、機械を正しく使用し、誘導および維持計画のガイドラインに従い、手術中の心臓および呼吸速度を注意深く監視するように訓練されなければならない。動物の種、年齢、または重量に応じて、必要なイオブルランの量は異なる場合があります。予測不能な動物の損失はまれな出来事であり、通常、麻酔または外科的ミスによって説明されません。
初期合併症 (
VCA障害は、微小血管血栓症(静脈血栓症は動脈よりも頻繁に)のために術後1週間の間に起こり得る。鼠径部レベルの周術ペディクルのインセットは非常に重要なステップです。血統に対する動きの効果を模倣するためにラットの後肢を動かすことは非常に重要です。ペディクルは決して緩いし、きつすぎることはありません。集約的なモニタリングは、VCA障害診断が行われるとすぐに壊死を実行しなければならないため、基本的な要件です。壊死の間、血行性(キンキングまたは張力)の位置と血栓性の吻合(後壁縫合、イントラレンスフラップ)の質の分析は、次の手順の間に改善することができるものに関する多くの情報を提供し、したがって、手術外科医によって行われるべきである。静脈血栓症は、20%の症例で早期安楽死の原因であり、そのすべてがPOD5の前に起こった(図4)。
図4:術後静脈血栓症 肌は青く見え、毎日暗くなります。略語: POD = 術後日。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
自己突然変異(またはオートファジア)は、非感性移植片において深刻な懸念事項である。それは、多くの場合、POD2とPOD7の間で発生します。移植片表面の3分の1以下に限定し、皮膚のみに関する場合、非吸収性縫合糸を用いた外科的脱除剤および縫合糸は、スタッフ獣医師と議論することができる(図5A-C)。予防は、POD7まで首に縫い付けたE-首輪の使用と、動物の外科的創傷に対する血液または地殻の洗浄に依存する。繰り返しオートファジアまたは深部突然変異は安楽死を必要とする(図5D)。
図5:非感性移植片の術後自家突然変異(A-C)(A)POD2での自動突然変異の限られた表面。(B) 外科的に残骸を残し、再縫合した;(C)POD21での側面。(D) 動物の安楽死につながる移植片の複数の層の重度のオートファジア。略語: POD = 術後日。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
後期合併症 (>POD7)
頻度が低く、致死性が低く、これらの合併症は、適切な治療を提供するために獣医の相談を必要とします。まず、このモデルでは、通常、第3週の手術後に最初の治癒後に骨暴露が観察される。予防は慎重な骨切断(滑らかなエッジを作成する骨カッターの使用)に基づいています。後の筋肉の萎縮を考慮しながら、周囲の筋肉で骨の縁をカバーすることは有用です.早期に検出され、動物が良好な状態にある場合、外科的改訂は獣医師と議論することができる。第二に、真皮嚢胞は2週間後に外科部位の周りに起こり得る(図6)。彼らは通常、ラットや移植片の状態を妨げないが、皮膚に瘻を与え、感染する可能性がある。創傷の残った毛髪を避けるために移植片の入り込みの外科的部位を洗浄することは、嚢胞の作成を妨げる。外科的排液の適応は獣医と評価することができる。
図6: 皮膚嚢胞 真皮嚢胞が現れる(A)後POD14の後、(B)時々瘻の前に皮膚壊死中心を有する。略語: POD = 術後日。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
錯綜 | 解決 | 予防 | |
ペリオペレーティブ | 微小血管血栓症 | 血管をすすいで終わり、良好な流れを証明した後、迅速に吻合をやり直します。 | ドナーをヘパリン化し、フラップを洗い流し、吻合技術を習得し、適切な器具と縫合を使用します。 |
出血 | 筋肉から場合は焼灼し、吻合から3分以内に自発的に停止しない場合はクランプします。 | 移植片の収穫の間の徹底的な焼灼 | |
麻酔関連死 | 獣医のスタッフと遭遇した問題について話し合います。 | 麻酔装置の使用と周術期ラットモニタリングの訓練 | |
アーリー ( |
微小血管血栓症 | 血栓症の原因を明らかにする早期安楽死と壊死 | 原因によって異なります |
自動突然変異 | 最初の事象および移植片への表面的損傷がある場合は、獣医と外科的修復について話し合う。 | POD-2からPOD7へのEカラー | |
レイト (>POD7) | 骨暴露 | 獣医と外科的改訂について話し合う。 | 骨カッターで骨をカットし、エッジが滑らかであることを確認し、周囲の筋肉で回復し、後の筋肉萎縮を説明します(短くカット)。 |
皮膚嚢胞 | 獣医と外科的排出と抗生物質治療について話し合う | 差し込み場所を水で洗います。外科部位に髪を残さないようにしてください。 |
表1:潜在的な結果。 予防と解決策。
研究終了
このモデルの研究の終わりはPOD21で設定されました;動物はCO2 窒息または排泄によって安楽死させた。非機能的な移植片として、筋萎縮および脂肪変性は、再インナーブの欠如の結果として観察された。皮膚と筋肉の生検は、組織学的分析のために保存されます。研究終了前に安楽死が行われた場合、血管ペディクルの評価(配置、開口)のために、インギナル折り目が再開されます。
スタッフの獣医に相談する5つの理由 |
1)研究の開始前に、あなたの研究の性質、計画された鎮痛、およびフォローアップ戦略と期待される結果を彼女/彼に知らせる |
2)研究中に動物の状態を改善するのに役立つ特別な食事または補足栄養素 |
3)予期せぬ麻酔関連死 |
4)動物の状態の原因不明の悪化 |
5)安楽死の可能性または適応症を評価するための外科的合併症 |
表2:獣医を呼ぶタイミング。インビボ研究の実施には、スタッフとのコミュニケーションが不可欠です。
補足表1:「ドス&ドント」 若い微小外科研修生へのアドバイス。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
げっ歯類における異形肢移植モデルは文献15,16,17に記載されている。しかし、彼らは神経修復、筋肉の再付着、および非常に困難なステップである大腿骨の完璧な骨合成を必要とします。これらのモデルはまた、げっ歯類14におけるより高い罹患率および死亡率と関連しており、特に移植後肢の正常な機能の回復には数ヶ月かかる可能性がある18の短期的なフォローアップにおいてである。しかし、それらは成功した場合の移植片機能のより長期的な評価を可能にする。異所性四肢移植の主な制限は、移植片の再インナーブの欠如によって誘発される筋萎縮である。文献に既に掲載されているように、筋線維損傷は、脱化後5日で起こり得る。これは、1ヶ月後に有意な筋肉萎縮および脂肪変性を引き起こし、3週間以上続くインビボ研究のためにこのモデルの使用を妨げる。この観点から、部分異形性骨筋皮折れフラップモデルは、組織保存10、組織バイオエンジニアリング、および免疫抑制戦略20に関する短期研究に最適である。
提案されたモデルでは、外科的および術後合併症の両方が限られており、微小外科研究者によって容易かつ迅速に対処することができる。我々は、彼らが基本的なマイクロサージャスコースを受けていることを考えると、若い外科医のための3-6移植後にこのモデルで成功を達成することができると推定する。また、2時間未満の虚血時間で3時間以内に単一のオペレータによって行うことができる手順でもある。このモデルは、2つのオペレータによっても実行することができ、微小血管性血管系の時間のみに虚血時間を短縮する。このモデルの重要なステップは、移植片の差し込みであり、微小血管血栓症を引き起こす可能性のある任意のキンキングまたは緊張を避けるためにペディクルの良好な配置を確保することです。このため、大腿骨血管の解剖は、ドナーとレシピエントにおいて、それぞれ可能な限り近位および遠位的に進行すべきである。皮膚血管化は、移植片の再血管化まで皮膚を手足に巻き付けておき、動脈皮膚穿塞や皮膚壊死を引き起こす可能性のある動脈皮膚穿塞に対する剪断効果を避けることによって、十分に保存するべきである。
文献では、げっ歯類のVCAモデルの合併症は十分に報告されていません。合併症を予防し、予測するためには、あらゆる可能な結果の知識が不可欠です。この研究は、スタッフの獣医師との良好なコミュニケーションの必要性を強調しています。ラットの取り扱いと身体検査のスキルを習得することは、動物の幸福と研究の適切な実施にとって非常に重要です。この技術を習得すれば、このモデルは100%近い成功率のVCA研究に使用することができる。非機能的モデルは長期評価には適していませんが、完全ミスマッチVCA移植や虚血再灌流傷害の評価に関する免疫学的研究において早期移植検査に大きな関心を持っています。本モデルは、パンチ生検を用いて繰り返しサンプリングできる大きな皮膚成分及び筋肉容積を提供し、いくつかの組織学的および免疫学的アッセイならびに画像評価技術13を生成する。この正確なプロトコルは可能な合併症が予見され、積極的に防がされれば減少した罹患率のラットで再現可能で信頼できるVCAモデルを提供する。
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Disclosures
著者は開示を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、賞No.の下で議会主導の医学研究プログラムを通じて保健問題担当国防次官補室によって支援されました。W81XWH-17-1-0680.意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるとは限りません。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24 GA angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381412 | |
4-0 suture Black monofilament non absorbable suture | Ethicon | 1667 | Used to suture the E-collar to the back of the neck |
4-0 suture Coated Vicryl Plus Antibacterial | Ethicon | VCP496 | |
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
Black Polyamide Monofilament USP 10-0, 4 mm 3/8c | AROSurgical | T04A10N07-13 | Used to perform the microvascular anastomoses |
Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
Dissecting Scissors 15 cm, Round Handle 8 mm diameter, Straight Slender Tapered Blade 7 mm, Lipshultz Pattern | ASSI | ASSI.SAS15RVL | |
Double Micro Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 18040-22 | |
Elizabethan collar | Braintree Scientific | EC-R1 | |
Forceps 13.5 cm long, Flat Handle, 9 mm wide Straight Tips 0.1 mm diameter (x2) | ASSI | ASSI.JFL31 | |
Halsey Micro Needle Holder | Fine science tools (FST) | 12500-12 | |
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
Lone Star Elastic Stays | CooperSurgical | 3314-8G | Used to retract the inguinal ligament for femoral vessels dissection |
Lone Star Self-Retaining Retractors | CooperSurgical | 3301G | |
Micro-Mosquito Hemostats | Fine science tools (FST) | 13010-12 | Used to retract the inguinal fat pad distally |
Needle Holder, 15 cm Round Handle, 8 mm diameter, Superfine Curved Jaw 0.2 mm tip diameter, without lock | ASSI | ASSI.B1582 | |
Nylon Suture Black Monolfilament 8-0, 6.5 mm 3/8c | Ethilon | 2808G | Used to ligate collateral branches on the femoral vessels |
Offset Bone Nippers | Fine science tools (FST) | 16101-10 | |
S&T Vascular Clamps 5.5 x 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 00398-02 | |
Walton scissors | Fine science tools (FST) | 14077-09 |
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