Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

Resumo

Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.

Resumo

Técnicas de microinjeção de embriões são essenciais para muitos estudos moleculares e genéticos de espécies de insetos. Eles fornecem um meio de introduzir fragmentos de DNA exógenos codificando genes de interesse, bem como traços favoráveis na germinação de insetos de forma estável e hereitária. As cepas transgênicas resultantes podem ser estudadas para alterações fenotípicas resultantes da expressão do DNA integrado para responder a perguntas básicas ou usadas em aplicações práticas. Embora a tecnologia seja simples, requer paciência e prática do investigador para alcançar um nível de habilidade que maximize a eficiência. Mostrado aqui é um método de microinjeção de embriões do mosquito africano da malária, Anopheles gambiae. O objetivo é entregar por microinjeção DNA exógeno ao embrião para que possa ser tomado nas células germinas em desenvolvimento (polo). A expressão do DNA injetado de transposases, integrases, recombinases ou outros nucleases (por exemplo, proteínas associadas ao CRISPR, Cas) pode desencadear eventos que levam à sua inserção covalente em cromossomos. A gambiae transgênica gerada a partir dessas tecnologias tem sido usada para estudos básicos de componentes do sistema imunológico, genes envolvidos na alimentação sanguínea e elementos do sistema olfativo. Além disso, essas técnicas têm sido utilizadas para produzir cepas de An. gambiae com características que podem ajudar a controlar a transmissão de parasitas da malária.

Introdução

Técnicas de microinjeção têm sido usadas para manipular experimentalmenteorganismos desde o início dos anos 1900. A microinjeção tem sido usada para estudar ambas as funções biológicas básicas e/ou introduzir mudanças importantes na biologia de um organismo desejado. A técnica de microinjeção tem sido de particular interesse para biólogos vetoriais e tem sido amplamente utilizada para manipular genomas vetoriais^2-11. Experimentos de transgênese em vetores de artrópodes muitas vezes visam tornar os vetores menos eficientes na transmissão de patógenos, promulgando alterações que diminuem a aptidão de um vetor ou aumentam a refratabilidade aos patógenos que transmitem. Os mosquitos transmitem uma variedade de patógenos humanos e têm um impacto significativo na morbidade e mortalidade em todo o mundo. O gênero Anopheles de mosquitos transmite os patógenos parasiticos da malária humana, Plasmodium spp. Experimentos de engenharia genética com Anopheles têm como objetivo entender melhor a biologia e reduzir a capacidade vectorial desses mosquitos nos esforços para desenvolver novas estratégias de eliminação da malária.

Os vetores de mosquitos que mais contribuem para as infecções por malária no mundo estão no complexo de espécies anopheles gambiae. No entanto, a maioria dos experimentos bem sucedidos de transgênese foram realizados no vetor da malária do subcontinente indiano, Anopheles stephensi. Embora existam muitas cepas de Anopheles gambiae adaptadas em laboratório, o número de linhas transgênicas de Anopheles gambiae spp. relatadas na literatura não se compara à de Anopheles stephensi. Acredita-se que o embrião anofelino gambiae é mais difícil de injetar e alcançar transgênese bem sucedida do que Anopheles stephensi, embora as razões para essas diferenças sejam desconhecidas. Este protocolo descreve um método que tem sido consistentemente bem sucedido na obtenção de transgênese de embriões anofelinos gambiae via microinjeção. O protocolo é baseado em um método anteriormente desenvolvido por Hervé Bossin e Mark Benedict¹² com alguns detalhes adicionais e alterações adicionadas que foram encontrados para aumentar a eficiência da transgênese.

Protocolo

1. Preparação de mosquitos para microinjeção

1. Semente uma gaiola¹³ (~5000 cm³) com ~100 machos e 200-300 fêmeas 1-2 dias mosquitos pós-eclosão adultos e permitem que eles acasalem por 2 dias.
2. Após o período de acasalamento, forneça aos mosquitos uma refeição sanguínea usando 2 mL de sangue com um dispositivo de alimentação artificial ou animais anestesiados vivos, dependendo das práticas insetíduas¹⁴. No dia seguinte, forneça aos mosquitos uma segunda refeição de sangue para garantir que todas as fêmeas acasaladas tenham tido a oportunidade de se alimentar e que mosquitos parcialmente alimentados tenham se tornado totalmente engorgados.
3. Utilize os mosquitos para coletas de embriões 2-4 dias após a segunda refeição sanguínea.
   NOTA: A nutrição larval é importante para a robustez adulta e o condicionamento reprodutivo. Consulte Benedict et al. (2020) para obter informações sobre como criar insetos saudáveis¹⁴. Não foram observadas diferenças significativas na colocação de ovos quando os mosquitos são alimentados com um alimentador artificial ou animais anestesiados vivos. Use qualquer método que seja usado rotineiramente para Anopheles gambiae no inseto.

2. Preparação do embrião

1. Use um aspirador para colocar 20-30 fêmeas em um tubo cônico transparente de 50 mL que foi cortado (com uma serra de banda) para ser aberto em ambas as extremidades e é coberto com filme dental de látex em uma extremidade e malha de nylon e papel filtro na outra(Figura 1).
   NOTA: Os mosquitos depositarão seus ovos no papel do filtro e a malha de nylon manterá o papel do filtro firmemente no lugar. Os ovos de mosquito são cilíndricos em forma, ~500 μm de comprimento, ~200 μm de diâmetro em seu ponto mais largo, e afunilando nas extremidades anterior e posterior(Figura 2).
2. Coloque o tubo cheio de mosquitos em uma pequena placa de Petri (60 mm x 15 mm) cheia de água dupla destilada (ddH₂O). Coloque o tubo e o prato em uma incubadora a 28 °C por 45 min(Figura 3).
3. Retire o tubo da incubadora e insira o tubo em uma gaiola vazia. Bata suavemente no tubo para permitir que os mosquitos voem para fora e remova o tubo da gaiola uma vez que todos os mosquitos tenham voado para fora.
4. Quando o tubo estiver livre de mosquitos, desaparafusar o anel inferior, remover o nylon e usar fórceps para remover cuidadosamente o papel filtro com os ovos do tubo. Coloque o papel filtro em uma placa de Petri de plástico (100 mm x 15 mm) contendo uma camada de papel filtro umedecido com ddH₂O.
5. Observe os ovos. Os ovos que envelheceram até o ponto em que são de cor cinza claro(Figura 4) estão prontos para o alinhamento.
   1. Se os ovos ainda estiverem brancos, devolva-os à incubadora e verifique a cor a cada 5 minutos. Os ovos brancos são frágeis, rompem facilmente e não sobrevivem bem após o processo de injeção que resulta em baixa eclosão.
   2. Ovos que são cinza escuro ou preto envelheceram demais. Não os use.

3. Alinhamento embrionário

1. Corte um pedaço de membrana de mancha de nylon (2 cm x 1 cm) com uma lâmina de barbear, certificando-se de que a borda está bem aparada.
   NOTA: Se a borda não estiver reta, os ovos não permanecerão afixados na membrana corretamente durante o processo de injeção.
2. Coloque uma membrana em uma lâmina de vidro e cubra a membrana com um pedaço de papel filtro (2 cm x 2 cm), deixando ~1 mm do filtro de membrana descoberto(Figura 5).
   NOTA: Certifique-se de que as lâminas do microscópio estejam limpas antes do uso e use fórceps limpos para manipular o filtro de membrana.
3. Molhe o papel filtro com H₂O desionizado, pois os ovos morrerão se dessecados por longos períodos de tempo.
   NOTA: Não coloque muita água no papel porque os embriões se moverão durante o processo de injeção, mas certifique-se de que há o suficiente para evitar que o embrião seque(Figura 6A, B). O excesso de água pode ser removido absorvendo-o com um pedaço de papel filtro.
4. Transfira suavemente 30-50 embriões para a borda da membrana com um pincel (tamanho #0). Use a escova para alinhar os ovos verticalmente ao longo da membrana, enrolando-os suavemente sobre a lâmina para que o lado ventral (convexo) esteja voltado para cima.
5. Oriente todos os ovos na mesma direção para que quando os ovos são observados sob o microscópio de microinjeção, a extremidade posterior (mais pontiaguda, Figura 6A, B) esteja em posição de baixa e forme um ângulo de ~15° com a agulha(Figura 6C). Fore toda a borda da membrana com ovos (30-50) e coloque o slide sob o microscópio para injeção.
   NOTA: Escolha os ovos com cuidado. Descarte aqueles que são brancos (muito jovens ou não desenvolvidos) ou cinza escuro (muito velho e vai quebrar a agulha), e os anormais(Figura 7). Certifique-se de que o papel do filtro permaneça úmido o tempo todo.

4. Preparação de DNA

1. Purifique DNAs plasmídeos para injeção, no mínimo, com um kit de maxiprep plasmídeo de DNA sem endotoxina seguindo os protocolos do fabricante.
2. Resuspenque o DNA em água de grau PCR e centrífuga a 17.100 x g em uma centrífuga refrigerada por 30 min a 4 °C. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo cônico limpo de 1,5 mL. Cuidadosamente micro-pipeta para evitar a transferência de material particulado indesejado da coluna.
3. Realize uma segunda precipitação de DNA usando um décimo de volume de acetato de sódio 3M e um volume de duas vezes de 100% de etanol.
4. Resuspend o DNA em 300-500 μL de água de grau PCR para uma concentração plasmida final de 1000 ng/μL. Misture o coquetel plasmídeo no tampão de injeção para uma concentração plasmida final de 300-400 ng/μL e faça 10-20 μL aliquots.
   NOTA: O DNA pode ser armazenado a -20 °C. As alíquotas de microinjeção de DNA podem ser armazenadas a -20 °C ou a -80 °C se usarem componentes de RNA. Não exceda 800 ng/μL de DNA na mistura de injeção porque a viscosidade fará com que as agulhas obstruam.

5. Preparação da agulha

1. Faça as agulhas puxando capilares de quartzo de 10 cm usando um puxador de micropipette programável.
2. Examine a agulha sob microscópio para garantir que a ponta esteja bem formada. Certifique-se de que a configuração da agulha no puxador programável produz uma ponta que começa a afunilar ~0,5 mm da extremidade do terminal e termina em um ponto fino (ver Figura 6). Agulhas que quebram facilmente geralmente têm muito tempo de uma fita.
   NOTA: As condições podem diferir dependendo do puxador de agulha (os autores disponibilizarão a pedido as configurações do puxador programável que utilizam. Restrições de revistas nos impedem de citar uma marca específica). Agulhas podem ser puxadas à mão, mas isso requer um conjunto de habilidades não disponível na maioria dos laboratórios.

6. Microinjeção de embriões

1. Use uma ponta de microcarregador para encher as agulhas com 2 μL de mistura de DNA. Insira a agulha no suporte da agulha e conecte o tubo automatizado da bomba de pressão(Figura 8).
2. Importante: Alinhe a agulha para que ela faça um ângulo de 15° com o plano do slide(Figura 8).
3. Abra a ponta da agulha tocando cuidadosamente o primeiro ovo e injete-o inserindo a ponta da agulha ≤ 10 μm no poste posterior. Uma injeção bem sucedida levará a um pequeno movimento do citoplasma dentro do ovo.
4. Use os controles de estágio coaxial do microscópio para mover-se para o próximo ovo para continuar a injeção.
   1. Para garantir que a ponta da agulha permaneça aberta e não tenha entupido, pressione o botão Injetar antes de inserir outro embrião e visualize a pequena gota na abertura da agulha.
   2. Se a agulha ficar entupida, pressione o botão Limpar para limpar a agulha e repetir o teste de visualização de gotículas. Ajuste a pressão conforme necessário se a abertura da ponta da agulha ficar ligeiramente maior para garantir que o tamanho da gota permaneça pequeno.
   3. Injete ~40-50 ovos com uma agulha.
      NOTA: Certifique-se de que o papel do filtro permaneça úmido o tempo todo. Mantenha pressão suficiente na agulha para mantê-la limpa. Uma agulha que não pode ser desocupada deve ser substituída por uma nova agulha. Colocação embrionária, inserção de agulhas e injeção são facilitam com microscópios que possuem controles coaxiais para o movimento horizontal do palco(Figura 9).
5. Após as injeções completas, enxágue os ovos em um recipiente de vidro forrado com papel filtro e preenchido com 50 mL de H₂O desionizado(Figura 10).
   NOTA: Os embriões começarão a eclodir 2 dias após a injeção e podem levar até 3-5 dias. As primeiras larvas instar eclodidas devem ser transferidas imediatamente (verifique 2 vezes por dia) para um recipiente limpo com água e alimentos.

Resultados

Um exemplo representativo da aplicação do protocolo de microinjeção descrito pode ser encontrado em Carballar-Lejarazú et al⁵. A intenção aqui era inserir um sistema autônomo de acionamento genético na linha germinal de uma cepa de laboratório, G3, de An. gambiae. O sistema foi projetado para atingir o lócus ortolog cardeal (Agcd) no terceiro cromossomo desta espécie, que codifica uma peroxidase heme que catalisa a conversão de 3-hidroxiquilenrina para xanthommatina, o ú...

Discussão

Com o aumento da disponibilidade de tecnologias precisas e flexíveis de engenharia genética, como o CRISPR/Cas9, organismos transgênicos podem ser desenvolvidos de forma mais simples e estável do que antes possível. Essas ferramentas permitiram aos pesquisadores criar cepas transgênicas de vetores de mosquitos que estão muito perto de alcançar as propriedades desejadas de refratria a patógenos (modificação populacional) ou esterilidade heredital (supressão populacional). No entanto, para desenvolver os mosquitos genetica...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x tampão de microinjeção	-		1 mM NaHPO4 tampão, pH 6,8, 50 mM KCl
Membrana de mata-borrão (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Ordenadamente e retamente cortado em pedaços de 2x1 cm
Tubos cônicos 50 ml (tubo de centrífuga descartável, polipropileno)	Fisher Brand		Ends cut
Água desionizada ou bidestilada (ddH20)	Mili-Q		Em uma garrafa de lavagem
Microscópio de dissecação	Leica	Leica MZ12	Para alinhamento embrionário
Fórceps			Tamanho nº 5
Recipiente de vidro	Deslizante de	Pyrex No. 3140	125 x 65
	Fisher Marca	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubadora	Barnsted Lab-line	Modelo No. 150	28 ° C
KCl			50 mM
Filme dental de látex	Crosstex International	No. 19302
Microinjetor	Sutter Instrumento		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipetas dicas	Eppendorf		20 µ L microcarregador epT.I.P.S.
Micromanipulador	Instrumento Sutter	XenoWorks
Micromanipulador Micropipeta	Chuva		20 µ L
Extrator de micropipetas	Instrumento Sutter	Sutter P-2000 micropipeta extrator
Microscópio	Leica	DM 1000 LED ou M165 FC	Para microinjeção
Papel de filtro de fibra mínima	Fisher Brand	No. 05-714-4	, Espesso
Mosquitos	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, fêmeas adultas acasaladas, alimentadas com sangue 4-5 dias após a eclosão
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
Pincel de malha
	Blick	No. 05831-7040	Fino, tamanho 4/0
Placa			Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm)
Acetato
3M Quartz glass capilares	Instrumento Sutter	No. QF100-70-10	Com filamento, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm de comprimento
Grau PCR de água	Roche	nº 03315843001