Técnicas de microinjeção são essenciais para introduzir genes exógenos nos genomas dos mosquitos. Este protocolo explica um método usado pelo laboratório James para microinjetar construções de DNA em embriões Anopheles gambiae para gerar mosquitos transformados.
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Artigo de método
Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae
Neste artigo
Resumo
Resumo
Técnicas de microinjeção de embriões são essenciais para muitos estudos moleculares e genéticos de espécies de insetos. Eles fornecem um meio de introduzir fragmentos de DNA exógenos codificando genes de interesse, bem como traços favoráveis na germinação de insetos de forma estável e hereitária. As cepas transgênicas resultantes podem ser estudadas para alterações fenotípicas resultantes da expressão do DNA integrado para responder a perguntas básicas ou usadas em aplicações práticas. Embora a tecnologia seja simples, requer paciência e prática do investigador para alcançar um nível de habilidade que maximize a eficiência. Mostrado aqui é um método de microinjeção de embriões do mosquito africano da malária, Anopheles gambiae. O objetivo é entregar por microinjeção DNA exógeno ao embrião para que possa ser tomado nas células germinas em desenvolvimento (polo). A expressão do DNA injetado de transposases, integrases, recombinases ou outros nucleases (por exemplo, proteínas associadas ao CRISPR, Cas) pode desencadear eventos que levam à sua inserção covalente em cromossomos. A gambiae transgênica gerada a partir dessas tecnologias tem sido usada para estudos básicos de componentes do sistema imunológico, genes envolvidos na alimentação sanguínea e elementos do sistema olfativo. Além disso, essas técnicas têm sido utilizadas para produzir cepas de An. gambiae com características que podem ajudar a controlar a transmissão de parasitas da malária.
Introdução
Técnicas de microinjeção têm sido usadas para manipular experimentalmenteorganismos desde o início dos anos 1900. A microinjeção tem sido usada para estudar ambas as funções biológicas básicas e/ou introduzir mudanças importantes na biologia de um organismo desejado. A técnica de microinjeção tem sido de particular interesse para biólogos vetoriais e tem sido amplamente utilizada para manipular genomas vetoriais2-11. Experimentos de transgênese em vetores de artrópodes muitas vezes visam tornar os vetores menos eficientes na transmissão de patógenos, promulgando alterações que diminuem a aptidão d....
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Protocolo
1. Preparação de mosquitos para microinjeção
- Semente uma gaiola13 (~5000 cm3) com ~100 machos e 200-300 fêmeas 1-2 dias mosquitos pós-eclosão adultos e permitem que eles acasalem por 2 dias.
- Após o período de acasalamento, forneça aos mosquitos uma refeição sanguínea usando 2 mL de sangue com um dispositivo de alimentação artificial ou animais anestesiados vivos, dependendo das práticas insetíduas14. No dia seguinte, forneça aos mosquitos uma segunda refeição de sangue para garantir que todas as fêmeas acasaladas tenham tido a oportunidade de se alimentar e que mosquitos parcialmente alimen....
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Resultados
Um exemplo representativo da aplicação do protocolo de microinjeção descrito pode ser encontrado em Carballar-Lejarazú et al5. A intenção aqui era inserir um sistema autônomo de acionamento genético na linha germinal de uma cepa de laboratório, G3, de An. gambiae. O sistema foi projetado para atingir o lócus ortolog cardeal (Agcd) no terceiro cromossomo desta espécie, que codifica uma peroxidase heme que catalisa a conversão de 3-hidroxiquilenrina para xanthommatina, o ú.......
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Discussão
Com o aumento da disponibilidade de tecnologias precisas e flexíveis de engenharia genética, como o CRISPR/Cas9, organismos transgênicos podem ser desenvolvidos de forma mais simples e estável do que antes possível. Essas ferramentas permitiram aos pesquisadores criar cepas transgênicas de vetores de mosquitos que estão muito perto de alcançar as propriedades desejadas de refratria a patógenos (modificação populacional) ou esterilidade heredital (supressão populacional). No entanto, para desenvolver os mosquitos genetica.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli pela criação de mosquitos. O financiamento foi fornecido pela Iniciativa irvine malária da Universidade da Califórnia. AAJ é um professor donald bren na Universidade da Califórnia, Irvine.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x tampão de microinjeção | - | 1 mM NaHPO4 tampão, pH 6,8, 50 mM KCl | |
| Membrana de mata-borrão (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Ordenadamente e retamente cortado em pedaços de 2x1 cm | |
| Tubos cônicos 50 ml (tubo de centrífuga descartável, polipropileno) | Fisher Brand | Ends cut | |
| Água desionizada ou bidestilada (ddH20) | Mili-Q | Em uma garrafa de lavagem | |
| Microscópio de dissecação | Leica | Leica MZ12 | Para alinhamento embrionário |
| Fórceps | Tamanho nº 5 | ||
| Recipiente de vidro | Deslizante de | Pyrex No. 3140 | 125 x 65 |
| Fisher Marca | No. 12-549-3 | 75x26 mm | |
| Incubadora | Barnsted Lab-line | Modelo No. 150 | 28 ° C |
| KCl | 50 mM | ||
| Filme dental de látex | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjetor | Sutter Instrumento | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipetas dicas | Eppendorf | 20 µ L microcarregador epT.I.P.S. | |
| Micromanipulador | Instrumento Sutter | XenoWorks | |
| Micromanipulador Micropipeta | Chuva | 20 µ L | |
| Extrator de micropipetas | Instrumento Sutter | Sutter P-2000 micropipeta extrator | |
| Microscópio | Leica | DM 1000 LED ou M165 FC | Para microinjeção |
| Papel de filtro de fibra mínima | Fisher Brand | No. 05-714-4 | , Espesso |
| Mosquitos | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, fêmeas adultas acasaladas, alimentadas com sangue 4-5 dias após a eclosão | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Pincel de malha | |||
| Blick | No. 05831-7040 | Fino, tamanho 4/0 | |
| Placa | Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Acetato | |||
| 3M Quartz glass capilares | Instrumento Sutter | No. QF100-70-10 | Com filamento, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm de comprimento |
| Grau PCR de água | Roche | nº 03315843001 |
Referências
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in ....
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Reimpressões e permissões
