Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

Golnoush Madani; Erwin Lamping; Hee Ji Lee; Masakazu Niimi; Alok K. Mitra; Richard D. Cannon

doi:10.3791/62592

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Artigo de método

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

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DOI:

10.3791/62592

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13 de junho de 2021

Golnoush Madani^*¹ , Erwin Lamping^*¹ , Hee Ji Lee¹ , Masakazu Niimi¹^,² , Alok K. Mitra³ , Richard D. Cannon¹

¹Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, ²Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, ³School of Biological Sciences, University of Auckland

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Resumo

A caracterização bioquímica e biofísica bem sucedida dos transportadores abc depende fortemente da escolha do sistema de expressão heteróloga. Nas últimas duas décadas, desenvolvemos uma plataforma de expressão de proteína de membrana de levedura que tem sido usada para estudar muitas proteínas importantes da membrana fúngica. A expressão host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ é excluída em sete grandes transportadores endógenos ABC e contém o fator de transcrição Pdr1-3 com uma mutação de ganho de função que permite a superexpressão constitutiva de genes heterologos de proteína de membrana stably integrados como cópias únicas no lócus PDR5 genômico. A criação de vetores plasmídeos versáteis e a otimização de estratégias de clonagem de uma etapa permite a clonagem rápida e precisa, mutagênese e expressão de transportadores heterologos do ABC. Aqui, descrevemos o desenvolvimento e o uso de uma nova tag dupla mGFPHIs de protease-cleavable (ou seja, a levedura monomérica aprimida proteína fluorescente verde yEGFP3 fundida a uma etiqueta de purificação de afinidade de seis histidinas) que foi projetada para evitar possíveis interferências da tag com a proteína de interesse e aumentar a eficiência vinculante da Sua tag para resinas de afinidade de níquel. A fusão de mGFPHis à proteína de membrana ORF (quadro de leitura aberta) permite a fácil quantificação da proteína por meio da inspeção de géis de poliacrilamida e detecção de produtos de degradação que retêm a tag mGFPHis. Demonstramos como essa característica facilita o rastreamento de detergente para solubilização de proteínas de membrana. Um protocolo para o isolamento eficiente, rápido e confiável das preparações de membrana plasmática em pequena escala do C-terminal marcado Candida albicans multirug efflux transporter Cdr1 superexpresso em S. cerevisiae ADΔ Δ, é apresentado. Este protocolo de isolamento da membrana plasmática de pequena escala gera membranas plasmáticas de alta qualidade dentro de um único dia útil. As preparações da membrana plasmática podem ser usadas para determinar as atividades enzimáticas das variantes mutantes Cdr1 e Cdr1.

Introdução

A extração de proteínas de membrana integral de seu ambiente lipídico nativo pode afetar drasticamente sua estrutura e função^1,²^,³^,⁴. A complexa composição lipídica das membranas biológicas⁵ garante que interações proteína-lipídicas criticamente importantes possam ocorrer⁶. Os lipídios mantêm a integridade estrutural das proteínas da membrana, permitindo que funcionem corretamente em seu destino de compartimento de membrana⁷^,⁸. Portanto....