Artigo de método

Preparação amostral para análise bioinformática da metilação de DNA: Estratégia de Associação para Obesidade e Estudos de Traços Relacionados

DOI:

10.3791/62598

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6 de maio de 2022

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1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente estudo descreve o fluxo de trabalho para gerenciar dados de metilação de DNA obtidos por tecnologias de microarray. O protocolo demonstra passos desde a preparação da amostra até a análise de dados. Todos os procedimentos são descritos em detalhes, e o vídeo mostra os passos significativos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A obesidade está diretamente ligada ao estilo de vida e tem sido associada a alterações de metilação de DNA que podem causar alterações nos processos de adipogênese e armazenamento lipídeca contribuindo para o desenvolvimento da doença. Demonstramos um protocolo completo desde a seleção até a análise de dados epigenéticos de pacientes com e sem obesidade. Todas as etapas do protocolo foram testadas e validadas em estudo piloto. Participaram do estudo 32 mulheres, nas quais 15 indivíduos foram classificados com obesidade segundo o Índice de Massa Corporal (IMC) (45,1 ± 5,4 kg/m2); e 17 indivíduos foram classificados sem obesidade segundo o IMC (22,6 ± 1,8 kg/m2). No grupo com obesidade, 564 locais de IPC relacionados à massa gorda foram identificados por análise de regressão linear. Os locais do CpG estavam nas regiões promotoras. A análise diferencial encontrou 470 CpGs hipometilados e 94 sítios hipermetilados em indivíduos com obesidade. As vias enriquecidas mais hipometiladas foram no RUNX, sinalização WNT e resposta à hipóxia. As vias hipermetiladas estavam relacionadas à secreção de insulina, sinalização glucagon e Ca2+. Concluímos que o protocolo identificou efetivamente padrões de metilação de DNA e metilação de DNA relacionada a traços. Esses padrões podem estar associados à expressão genética alterada, afetando a adipogênese e o armazenamento lipídudo. Nossos resultados confirmaram que um estilo de vida obesogênico poderia promover mudanças epigenéticas no DNA humano.

Introdução

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As tecnologias de omics em larga escala têm sido cada vez mais utilizadas em estudos de doenças crônicas. Uma característica interessante desses métodos é a disponibilidade de uma grande quantidade de dados gerados para a comunidade científica. Por isso, surgiu uma demanda de padronização dos protocolos para permitir a comparação técnica entre os estudos. O presente estudo sugere a padronização de um protocolo para obtenção e análise de dados de metilação de DNA, utilizando um estudo piloto como exemplo aplicado.

O gasto energético negativo predomina nos estilos de vida humanos modernos, levando a um acúmulo excessivo de tecido adiposo e, consequentemente, ao desenvolvimento da obesidade¹. Muitos fatores têm aumentado as taxas de obesidade, como sedentarismo, dietas de alta caloria e rotinas estressantes. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que 1,9 bilhão de adultos eram obesos em 2016, o que significa que mais de 20% da população mundial tem mais de 30 kg/m2 de IMC. A atualização mais recente de 2018 revelou que a prevalência de obesidade nos Estados Unidos da América (EUA) foi superior a 42%3.

Epigenética é a adaptação estrutural das regiões cromossômicas para registrar, sinalizar ou perpetuar estados de atividade alterada4. A metilação do DNA é uma alteração química reversível nos sítios de dinucleotídeos citosina-guanosina (sítios CpG), formando 5-metilcittosina-pG (5mCpG). Pode modular a expressão genética regulando o acesso da máquina de transcrição ao DNA5,6,7,8. Nesse contexto, é essencial compreender quais locais de CpG estão associados a traços relacionados à obesidade9. Muitos fatores podem apoiar ou prevenir a metilação de DNA específica do local. Enzimas necessárias para esse processo, como metiltransferases de DNA10 (DNTMs) e dez e onze translocações (TETs), podem promover a metilação ou desmetilação do DNA sob exposições ambientais11.

Considerando o crescente interesse pelos estudos de metilação de DNA nos últimos anos, escolher a estratégia de análise mais adequada para responder com precisão a cada pergunta tem sido uma preocupação essencial dos pesquisadores12,13,14. A matriz de metilação de DNA de 450K é o método mais popular, usado em mais de 360 publicações14 para determinar o perfil de metilação de DNA. Pode determinar a metilação de até 485.000 CpGs localizados em 99% dos genes conhecidos15. No entanto, esta matriz foi descontinuada e substituída pelo EPIC, cobrindo 850.000 sites cpg. O presente protocolo pode ser aplicado tanto para 450K quanto para EPIC16,17,18.

O protocolo é apresentado passo a passo na Figura 1 e compreende as seguintes etapas: seleção populacional, amostragem, preparação de experimentos, pipeline de metilação de DNA e análise bioinformática. Um estudo piloto realizado em nosso laboratório é demonstrado aqui para ilustrar os passos do protocolo proposto.

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Figura 1: Esquema do protocolo apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

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O comitê de ética do Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCRP-USP) aprovou o estudo (CAAE:14275319.7.0000.5440). Os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, e todos os procedimentos foram realizados após a Declaração de Helsinque.

1. População e amostragem

  1. Recrute participantes com IMC >30 kg/m2 para o estudo. Para o presente estudo, foram recrutadas 32 mulheres de uma população de mistura19 entre 18 e 60 anos.
    NOTA: No HCRP-USP, foram observadas maiores taxas de obesidade principalmente nas mulheres20. Participaram do ambulatório de Doenças Metabólicas, com IMC ≥ 30 kg/m2 (n = 15), no ambulatório de Doenças Metabólicas do HCRP-USP. Os participantes sem obesidade, com IMC entre 18,5 kg/m2 e 24,9 kg/m2 (n = 17), foram recrutados de outras clínicas e não apresentaram doenças graves; os dados clínicos são mostrados na Tabela 1.
  2. Exclua mulheres grávidas, amamentando mães, fumantes e consumam álcool.

2. Antropometria e composição corporal

  1. Meça o peso dos participantes utilizando uma escala antropométrica digital de 200 kg. Certifique-se de remover sapatos e excesso de roupas.
  2. Avalie a altura usando um stadiômetro com uma graduação de 0,5 cm. Os participantes foram instruídos a ficarem descalços, pés juntos e braços ao lado21.
  3. Coletar as informações de massa gorda (FM) utilizando uma bioimpedância elétrica. Após 12h de jejum, avalie com uma bexiga urinária vazia. Coloque os participantes na posição supina, com pernas separadas e braços paralelos sem tocar o corpo. Instrua os participantes a remover todos os acessórios metálicos22.
  4. Obtenha a circunferência da cintura (WC) utilizando uma fita de medição inestentível com uma graduação de 0,1 mm. A fita foi colocada horizontalmente ao redor da cintura média, logo acima dos ossos do quadril. A medição ocorreu logo após um respiro. De acordo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), o corte do CC para mulheres é de 88 cm23.

Tabela 1: Características populacionais. Todas as variáveis foram paramétricas (p > 0,05, Shapiro Wilk), e as diferenças foram avaliadas por meio de um Teste T Independente, no qual p < 0,05 foi considerado significativo. *p < 0,0001. Clique aqui para baixar esta Tabela.

3. Coleta de material biológico

  1. Coletar sangue periférico após 12h de jejum, como descrito anteriormente24.
  2. Colete 4 mL de amostras de sangue inteiros em tubos de coleta com anticoagulante (por exemplo, EDTA) e armazene-as no gelo para transporte.

4. Extração de DNA

  1. Centrifugar cada tubo contendo o sangue a 2.000 x g por 10 minutos. Colete cerca de 300 μL do casaco buffy (interfase branca).
  2. Extrair DNA do sangue periférico usando um instrumento comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), conforme descrito anteriormente25. Elute o DNA em 480 μL de ultrapure H2O.
  3. Avalie a concentração e a qualidade do DNA usando um fluorômetro. A integridade foi avaliada por meio de uma análise de gel de 1% agarose25. Guarde em um congelador a -80 °C.

5. Preparação antes da análise da metilação

  1. Certifique-se de que as amostras tenham a concentração mínima de DNA (500 ng é o insumo inicial ideal para começar), mas a diluição pode variar entre as amostras nesta etapa.
  2. Alguns reagentes não estão incluídos no kit de microarray26, por isso compre-os separadamente27.
  3. Verifique se o kit contém todos os reagentes utilizados durante o procedimento; eles são insubstituíveis. Verifique a data de validade de todos os reagentes. Certifique-se de que outros reagentes e soluções não fornecidos no kit também estão disponíveis (95% de formamide/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, etanol absoluto, 2-propanol).
    ATENÇÃO: Formamida é um reagente volátil; a qualidade dos resultados pode ser melhorada se o produto estiver fresco. A integridade e a qualidade do formamida e do etanol absoluto são considerados críticos porque podem afetar o processo de coloração proposto pelo fabricante. Os álcoois escolhidos devem ser produtos ultrauso específicos para análise de biologia molecular.
  4. Uma vez adquirido o kit de microarray, baixe os Chips Decode Maps (DMAPs). Esses arquivos estão disponíveis no site do fabricante 24-48 h após o envio do kit e são excluídos na data de validade28. Para baixar os arquivos mencionados, execute as etapas abaixo.
    1. Certifique-se de que um computador com acesso à internet está disponível. Realize o download usando o Cliente de Arquivo de Código de Software.
    2. Antes de instalar o programa, certifique-se de que o computador tenha acesso de saída e entrada concedido pela instituição; o Cliente de Arquivos decodificador não tem restrições de segurança.
    3. Faça login no software Decode File Client usando a opção Access by BeadChip. Este login é realizado usando O ID de usuário MyIllumina e senha. É necessária inscrição nesta página28.
    4. Após fazer login no Cliente de Arquivos decodificador, insira as informações listadas abaixo em seus respectivos campos na página inicial do software28: Lista de códigos de barras; Lista de IDs da Caixa; Número do pedido de compra (PO); e número de pedido de vendas (lembre-se de não incluir as letras que seguem os números).
    5. Selecione os DMAPs para baixar de acordo com o número de código de barras na caixa de compras e especifique o destino na caixa de diálogo para salvar os DMAPs.
    6. Clique no botão para iniciar o download.
      NOTA: No final do download, certifique-se de que as pastas baixadas não estejam vazias e armazene os arquivos com segurança, pois eles serão necessários para a etapa final para converter os experimentos em arquivos IDAT (Intensity Data Files). Após a data de validade, a Illumina pode remover os dados do DMAPs de seu banco de dados on-line.

6. Pipeline de metilação de DNA

NOTA: O experimento de metilação de DNA é dividido em 4 dias (Figura 1). Siga as recomendações e especificações do fabricante para obter resultados precisos.

  1. Dia 1: Tratamento bisulfita
    1. Comece desnaturando 500 ng de DNA genômico, em seguida, adicione os reagentes de conversão. Para realizar esta etapa, siga as recomendações dos kits bisullfita e microarray29.
    2. Trate o DNA desnaturado com 130 μL do reagente de conversão de bisullfita na concentração padrão fornecida pelo fabricante.
    3. Incubar o tubo em um termociclador para 16 ciclos a 95 °C para 30 s e 50 °C por 1h. Abaixe o termociclador para 4 °C por 10 min.
    4. Realize a etapa de lavagem adicionando 100 μL do tampão de lavagem e, em seguida, centrifugando a velocidade máxima por 30 s. A concentração não está prevista no guia do usuário, e o fabricante padroniza os volumes.
      NOTA: Este reagente vem com o kit e não precisa ser diluído ou preparado.
  2. Dia 2: Amplificação - Ensaio de Metilação, Protocolo Manual
    1. Pré-aqueça o forno de hibridização a 37 °C e deixe a temperatura equilibrar.
    2. Aplique um rótulo de código de barras a uma microplacão de 0,8 mL.
    3. Descongele os reagentes de amplificação (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix e Multi-Sample Amp Master Mix) à temperatura ambiente (esses reagentes vêm com o kit e não precisam ser diluídos ou preparados). Em seguida, realize uma inversão suave pelo menos 10x até que todo o conteúdo dos tubos seja misturado.
    4. Dispense 20 μL da Mistura de Amplificação Multi-Amostra 1 (MA1) nos poços da placa.
    5. Transfira 4 μL da amostra de DNA da placa convertida do bisulfito para os poços correspondentes na placa de 0,8 mL. Neste ponto, registo da amostra de DNA original no formulário de rastreamento laboratorial correspondente aos poços da placa.
    6. Dispense 4 μL de 0,1 N NaOH em cada poço da placa contendo a Mistura de Amplificação Multi-Amostra 1 (MA1) e a amostra de DNA.
    7. Sele a placa com um selo plástico.
    8. Vórtice a placa para misturar os reagentes com as amostras a 1.600 rpm por 1 min. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o selo.
    9. Pipeta 68 μL de Random Primer Mix (RPM) em cada poço da placa. Pipeta 75 μL de Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) em cada poço da placa (sem remover a solução anterior). Use um novo selo para cobrir a placa.
      NOTA: Tome cuidado para combinar os poços com a placa e orientá-lo corretamente.
    10. Vórtice a placa selada a 1.600 rpm por 1 min. Incubar no forno de hibridização por 20-24 h a 37 °C.
  3. Dia 3: Hibridização - Ensaio de Metilação, Protocolo Manual
    1. Pré-aqueça o bloco a 37 °C.
    2. Descongele o conteúdo do tubo à temperatura ambiente. Inverta cuidadosamente e suavemente os tubos da Solução de Fragmentação (FMS) pelo menos 10x para misturar completamente o conteúdo.
    3. Remova cuidadosamente a placa do forno de hibridização. Centrifugar o pulso da placa a 280 x g.
    4. Agora remova o selo da placa. Em cada poço da placa contendo uma amostra, adicione 50 μL de Solução de Fragmentação (FMS) e sele novamente a placa. Vórtice a placa a 1.600 rpm por 1 min.
    5. Centrifugar a placa a 280 x g por alguns segundos (realize a centrifugação de pulso). Em seguida, coloque a placa selada no bloco de aquecimento a 37 °C por 1h.
    6. Se foi decidido pausar o experimento e congelar a placa, descongelá-la à temperatura ambiente, e centrifuá-la a 280 x g. Se não estiver congelado, pule esta etapa e passe para a Etapa 6.3.7.
    7. Deixe o bloco de aquecimento pré-aquecer a 37 °C.
    8. Deixe o Tampão de lavagem descongelar em temperatura ambiente. Quando descongelado, inverta-o pelo menos 10x para misturar o conteúdo.
    9. Retire o selo da placa.
    10. Adicione 100 μL de Solução de Precipitação (PM1) a cada poço da placa contendo amostras.
    11. Sele novamente a placa com o selo.
    12. Vórtice a placa a 1.600 rpm por 1 min.
    13. Incubar a 37 °C por 5 min.
    14. Em seguida, coloque na centrífuga de pulso a 280 x g por 1 min.
      NOTA: Coloque a centrífuga a 4 °C para o próximo passo.
    15. Retire cuidadosamente o selo da placa e descarte-o.
    16. Adicione 300 μL de 2-propanol (100%) a cada poço contendo a amostra.
    17. Sele a placa com extremo cuidado usando um novo selo. Tome cuidado para não agitar o prato.
    18. Inverta a placa pelo menos 10x, misturando todo o conteúdo.
    19. Incubar a 4 °C por 30 min.
    20. Centrifugar a 3.000 x g a 4 °C por 20 min.
      NOTA: Ao final da etapa 6.3.20, remova imediatamente a placa centrífuga.
    21. Retire o selo da placa e descarte-o.
    22. Inverta rapidamente a placa e escorra o líquido em uma almofada para descartar o supernatante. Em seguida, bata a placa em uma área seca em uma toalha de papel para drenar o líquido.
    23. Toque firmemente várias vezes por 1 min ou até que todos os poços estejam livres de qualquer líquido.
    24. Deixe a placa invertida e descoberta por 1h em temperatura ambiente.
      NOTA: Espera-se que veja pelotas azuis na parte inferior dos poços.
    25. Pré-aqueça o forno de hibridização a 48 °C.
    26. Ligue o bloco de calor para pré-aquecer. Permita 20 min para este processo.
    27. Descongele a Resuspensão, Hibridização e Solução de Lavagem à temperatura ambiente. Inverta pelo menos 10x. Verifique se não há sal precipitado na solução.
    28. Adicione 46 μL de Resuspensão, Hibridização e Solução de Lavagem (RA1) a cada poço da placa.
      NOTA: Quaisquer reagentes restantes devem ser reservados para as etapas de coloração e hibridização.
    29. Aplique o selo na placa. Use um selo de alumínio para cobrir a placa. Segure firme para realizar a vedação uniformemente.
    30. Verifique se todos os poços estão fechados com segurança para evitar a evaporação.
    31. Coloque cuidadosamente a placa recém-selada no forno de hibridização e incubar a 48 °C por 1h.
    32. Vórtice a placa a 1.800 rpm por 1 min.
    33. Centrifuagem de pulso a 280 x g.
    34. Transfira a placa para o bloco de calor a 95 °C por 1h.
    35. Prepare as Câmaras de Hibridização (Hyb) colocando-as juntas. Dispense 400 μL de Tampão Umidificador (PB2) nos reservatórios das Câmaras de Hyb. Coloque a tampa imediatamente.
    36. Carregue cada amostra da placa na abertura de entrada da amostra da microarray.
    37. Carregue as pastilhas da Câmara de Hyb contendo as microarrays na Câmara de Hyb. Feche a Câmara de Hyb transversalmente para evitar uma possível mudança da Câmara de Hyb.
      NOTA: As câmaras de hyb precisam ser incubadas a 48 °C por pelo menos 16 h, mas não mais de 24 h.
  4. Dia 4: Ensaio de Coloração - Metilação, Protocolo Manual
    1. Resuspene a Solução de Coloração 4 com 330 mL de 100% EtOH, obtendo um volume final de 350 mL. Agite a garrafa Staining Solution 4 vigorosamente para garantir a suspensão completa. Mantenha-se em temperatura ambiente.
      NOTA: A solução de coloração 4 pode ser armazenada por até 2 semanas a uma temperatura entre 2 °C e 8 °C.
    2. Retire as câmaras do forno de hibridização e deixe esfriar no banco por 30 minutos antes de abrir.
    3. Enquanto a Câmara hyb estiver esfriando, encha dois recipientes de lavagem com tampão de lavagem (200 mL por recipiente de lavagem). Lembre-se de rotular cada recipiente como "Tampão de lavagem" (PB1 e PB2).
    4. Encha os acessórios de alinhamento de microarray com 150 mL de tampão de lavagem.
    5. Separe os espaçadores de plástico e, se necessário, limpe o vidro.
    6. Para lavar os slides de microarray, conecte o laço de arame à grade e mergulhe o equipamento pingando nos recipientes com 200 mL de tampão de lavagem para um total de 10x.
    7. Remova todas as pastilhas da Câmara de Hibridização e remova cada matriz das pastilhas. Remova o selo.
      NOTA: Durante a remoção, não toque nas matrizes expostas.
    8. Ao remover os slides de microarray da Câmara de Hibridização, tenha cuidado para não derramar nada.
    9. Lave as microarrays na solução de tampão de lavagem (PB1) lentamente e levemente, movendo-se para cima e para baixo 10x. Mova-se para uma nova solução PB1 e realize a lavagem movendo lentamente as microarrays 10x para cima e para baixo na solução.
    10. Remova a microarray do recipiente e confirme a ausência de resíduo.
    11. Use um espaçador transparente na parte superior de cada microarray e guie os espaçadores para as posições correspondentes.
      NOTA: Tenha cuidado para usar apenas os espaçadores transparentes, não os brancos.
    12. Posicione a barra de alinhamento no acessório de alinhamento.
    13. Coloque uma placa traseira de vidro na parte superior do espaçador claro; tenha cuidado para cobrir toda a microarray. Em seguida, conecte os grampos metálicos às câmaras de fluxo. Se necessário, use uma tesoura para aparar as extremidades dos espaçadores da câmara de fluxo.
    14. Lave imediatamente os reservatórios da Câmara de Hibridização usando ddH2O e esfregue com uma pequena escova de limpeza. Não permita que nenhum buffer umidificador permaneça no reservatório.
    15. Passe para o próximo passo que é responsável pela Microarray De Extensão e Coloração.
      NOTA: Deixe todas as câmaras de fluxo montadas horizontalmente no banco do laboratório. Só reusutar quando toda a etapa de coloração estiver pronta. Aqueça a Solução de Ressuspensão, Hibridização e Lavagem a uma temperatura entre 20 °C e 25 °C. Misture suavemente até que nenhum cristal seja visto na solução.
    16. Coloque os reagentes em um rack em sequência. Se algum estiver congelado, deixe-os à temperatura ambiente e, em seguida, inverta-os pelo menos 10x para misturar as soluções.
    17. Encha o circulador de água ao nível apropriado.
    18. Ligue a bomba e afina a temperatura para 44 °C.
    19. Remova todas as bolhas que estejam presas ao rack da câmara.
    20. Realize testes no rack de câmara usando uma sonda de temperatura. Todos os locais testados devem estar entre 44 °C ± 0,5 °C.
      NOTA: As seguintes etapas devem ser executadas sem interrupção.
    21. Quando o rack atingir uma temperatura de 44 °C, coloque rapidamente cada montagem na câmara de fluxo.
      NOTA: Para os seguintes passos, pipeta todos os reagentes na placa de vidro traseiro.
    22. Pipeta 150 μL de Ressuspensão, Hibridização e Solução de Lavagem (RA1). Em seguida, incubar por 30 minutos. Repita esta etapa um total de 5x.
    23. Pipeta 450 μL de Solução de Coloração 1 (XC1) e incubar por 10 min.
    24. Pipeta 450 μL de Solução de Coloração 2 (XC2) e incubar por 10 min.
    25. Pipeta 200 μL de Mix Master de Extensão de Duas Cores (TEM) e incubar por 15 min.
    26. Pipeta 450 μL de 95% de formamida/1 mM EDTA e incubar por 1 min. Repita duas vezes.
    27. Incubar por 5 minutos.
    28. Diminua a temperatura do rack de câmara para 32 °C (indicado em Mix Master Superior de Duas Cores).
    29. Pipeta 450 μL de Solução de Mancha 3 (XC3) e incubar por 1 min. Repita 1x.
    30. Espere o rack na câmara para atingir a temperatura correta.
      NOTA: Para ler a imagem de microarray imediatamente após o processo de coloração, ligue o scanner nesta fase.
    31. Agora dispense 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), seguido de uma incubação de 10 min.
    32. Em seguida, dispense 450 μL de Stain Solution 3 (XC3), seguido de incubação de 1 min. Repita 1x.
    33. Aguarde 5 min e adicione 250 μL de Anti-Mancha 2-Color Master Mix (ATM) e incubar por 10 minutos.
    34. Agora dispense 250 μL de Superior Two-Color Master Mix (STM), seguido de uma incubação de 10 min.
    35. Em seguida, dispense 450 μL de Stain Solution 3 (XC3), seguido de incubação de 1 min. Repita 1x.
    36. Espere por 5 min.
    37. Adicione 250 μL de Anti-Mancha 2-Color Master Mix (ATM) e incubar por 10 minutos.
    38. Adicione 450 μL de Stain Microarray Solution 3 (XC3) e incubar por 1 min, depois repita novamente.
    39. Espere por 5 min.
      NOTA: Faça o seguinte esquema de repetição: Passo 6.4.34., Passo 6.4.35. e Passo 6.4.36.; Passo 6.4.37., 6.4.38., e Passo 6.4.39.; Passo 6.4.34., Passo 6.4.35., e Passo 6.4.36.
    40. Agora, remova imediatamente as câmaras de fluxo do rack e coloque-as cuidadosamente horizontalmente no banco do laboratório. Certifique-se de que a temperatura está ambiente.
    41. 6.4.41.Coloque 310 mL de Solução de Lavagem (PB1) para cada microarray em um recipiente de lavagem.
    42. Remova os grampos metálicos e o vidro e, finalmente, a microarray.
    43. Coloque as microarrays em um rack de coloração e coloque-as no recipiente de lavagem contendo solução PB1 10x. Certifique-se de que os códigos de barras estão voltados para longe de quem está manuseando-os e que todas as microarrays estão submersas.
    44. Mova-se lentamente e levemente com movimentos para cima e para baixo 10x. A microarray deve ser removida inteiramente da solução antes de ser submersa novamente. Então, deixe-o ficar submerso por 5 minutos.
    45. Agite vigorosamente o reagente Stain Solution 4 (XC4) para garantir a ressuspensão total. Coloque 310 mL de XC4 em um recipiente de lavagem.
      NOTA: Não deixe que a solução fique no recipiente de lavagem por mais de 10 minutos.
    46. Mova levemente a posição de coloração para o outro recipiente com XC4.
    47. Mova-se lentamente e levemente com movimentos para cima e para baixo 10x. Certifique-se de que a microarray seja totalmente removida da solução antes de ser submersa novamente.
    48. Então, deixe a microarray permanecer submersa por 5 minutos.
    49. Mova a mancha para fora da solução e coloque-a em um suporte de tubo com os códigos de barras voltados para cima.
    50. Remova cuidadosamente a microarray usando fórceps de bloqueio e coloque-as em uma prateleira para secar.
    51. Seque-os utilizando o desiccador de vácuo por 50-55 min a 675 mm Hg (0,9 bar).
    52. Limpe a parte de trás de cada microarray usando EtOH.
      ATENÇÃO: Evite tocar nas listras e não permita que o EtOH escorra nas listras de forma alguma.
    53. Vá para a imagem da microarray.
    54. Armazene cuidadosamente a microarray em uma caixa de armazenamento à temperatura ambiente.
      NOTA: As imagens de microarray devem ser tiradas dentro de 72 h.

7. Análise bioinformática

NOTA: É necessário alterar alguns atributos do tipo de microarray (por exemplo, arraytype = "450k" deve ser substituído por arraytype = "EPIC"). O autor do pipeline ChAMP descreve detalhadamente todos os campos que devem ser modificados para analisar matrizes na página Bioconductor do pacote30.

  1. Folha de amostra
    1. Transfira os arquivos IDAT para o computador para prosseguir com a análise bioinformática31. Crie uma folha de amostra para realizar a análise de dados31.
      NOTA: Três colunas são essenciais para este arquivo de planilha. O primeiro é Sample_name. Esta coluna deve incluir os nomes ou códigos usados para identificar as amostras. O segundo é o Sentrix_position. Esta coluna coloca o R01C01 correspondente das amostras, sendo r01 responsável pela linha de chip e a coluna sendo referida como C01. A terceira coluna essencial é a Sentrix_ID, e é responsável por receber o número que identifica a microarray. Certifique-se de colocar os números corretos. É possível adicionar outras informações na folha de amostra como valores variáveis. No presente experimento, foram incluídos dados da análise metálica.
  2. Gasoduto ChAMP
    1. Instale o RStudio (V.4.0.2) no computador para realizar a análise30.
      NOTA: Certifique-se de que o computador tenha um mínimo de 8 G de RAM. A análise de dados vai lutar ou colidir com uma quantidade menor de RAM.
    2. Após a instalação, abra o RStudio e instale o pacote de Biocondutores ChAMP30 utilizando a respectiva linha de comando (ver Material Suplementar 1).
      NOTA: Se houver algum erro no final da instalação, instale manualmente as bibliotecas ChAMP necessárias, uma a uma26.
    3. Agora, importe os dados brutos e realize a análise. Consulte Material Suplementar 1.
      champ.load() importa os dados brutos e faz o processo de filtragem, excluindo sondas com pval de baixa detecção, sites multihit, sondas não-CG, locais de CpG próximos a SNPs e CpGs localizados em cromossomos sexuais.
      champ.impute() executa a imputação KNN como padrão.
      Campeão. O QC recupera gráficos de qualidade de dados (por exemplo, gráfico de gráfico de densidade).
      Campeão. O SVD avalia os efeitos do lote com base nos metadados fornecidos na folha de amostra.
      champ.refbase() realiza estimativa e correção do tipo celular.
      Campeão. O DMP recupera posições diferencialmente metiladas e associações de traços como massa gorda para verificar a metilação de DNA entre os grupos e alterar os parâmetros, como mostrado no Material Suplementar 1.
  3. Enriquecimento (String DB)
    NOTA: O enriquecimento funcional é usado para inferir as funções biológicas de um conjunto de genes.
    1. Para enriquecer os dados em uma sequência, selecione a lista de destinos para enriquecer e usar como entrada de: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. Para organismo, selecione homo sapiens e pressione o botão Pesquisar.
    3. Para navegar pelo enriquecimento, clique no botão Análise.
  4. Submissão GEO
    1. Deposite os dados em um repositório público como o GEO da NCBI. Para isso, cadastre-se para a conta do inscrito.
      NOTA: Complete o envio GEO (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) baixando a folha de metadados com informações descritivas e protocolos para o experimento geral e amostras individuais. Os envios de arquivamento GEO podem ser criados em qualquer software de planilha. Em segundo lugar, adicione o arquivo de dados bruto gerado a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório. IDAT e arquivos associados ou uma planilha de matriz contém dados não normalizados. A terceira pasta são os arquivos de dados processados. A tabela matricial é uma planilha contendo os valores finais, normalizados comparáveis entre linhas e amostras e preferencialmente processados conforme descrito em qualquer manuscrito que acompanha.
    2. Coloque arquivos de dados processados gerados a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório. Use as credenciais do servidor FTP do submissão GEO para transferir o diretório contendo os três componentes.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Após o uso do pipeline ChAMP, 409.887 sondas foram consideradas na análise após todos os filtros (CpGs não qualificados, sondas não-CG, CpG perto de SNPs, sites multihit e CpGs relacionados ao XY); um esquema é representado na Figura 2.

figure-results-1
Figura 2: Pipeline da análise bioinformática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, o gráfico de densidade revelou que todas as amostras tinham densidades semelhantes da distribuição beta relacionadas às etapas de controle de qualidade. Esta análise avalia a distribuição dos valores beta e aponta se há alguma amostra que precisa ser excluída. Neste lote, nenhuma amostra foi excluída com base nesta análise.

figure-results-2
Figura 3: Gráfico de densidade de valores beta obtido com o pacote ChAMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise de decomposição de valor singular (SVD) foi utilizada para verificar os principais componentes que influenciaram significativamente a variabilidade dos dados de metilação do DNA. Os dados revelaram que o IMC, o WC (p < 1e10-5) e fm (p < 0,05) tiveram um efeito significativo na variabilidade dos dados (Figura 4).

figure-results-3
Figura 4: Análise de decomposição de valor singular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A estimativa do tipo celular revelou que ambas as células assassinas naturais (NK) e B foram mais elevadas em mulheres obesas (Figura 5).

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Figura 5: Frações celulares estimadas pelo método de Houseman. Gran: granulocyte. CD4T: célula auxiliar T, linfócito. CD8T: célula T citotóxica, linfócito. Mono: monócito. Célula B: Linfócito B. Células assassinas naturais, linfócitos. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os níveis de metilação de DNA entre mulheres obesas e não obesas diferiram antes e depois da correção do tipo celular. Antes da correção dos dados de metilação do DNA para tipos celulares, foram observadas 43.463 posições diferencialmente metiladas (DMPs) e 3.329 CpGs permaneceram significativas depois. 445 locais de GDS estavam em regiões intergênicas (IGR), e 2.884 estavam em regiões gênicas, com a maioria na região promotora (n = 1.438). A distribuição em todas as regiões foi de TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), primeiro exon (n = 273), corpo (n = 724) e 3'UTR (n = 59). Considerando os valores Δβ <-0,05 e >0,05, 162 CpGs foram hipometilados e 576 foram hipermetilados em obesos em comparação com indivíduos não obesos (Figura 6). Os dados estão disponíveis no banco de dados GEO sob o código de registro GSE166611.

figure-results-5
Figura 6: Posições metiladas diferencialmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É possível avaliar a diferente metilação entre grupos e encontrar locais de CpG associados a traços específicos em estudos de metilação. Para estudos de massa gorda, foram encontrados 13.222 locais de CpG. 6.159 CpGs na região promotora foram relacionados à massa gorda, com 470 hipermetilados e 94 hipometilados (Figura 7), e os respectivos genes foram enriquecidos (Tabela 2).

figure-results-6
Figura 7: Regiões promotoras de genes hipometilados e hipermetilados, independentemente relacionados à massa gorda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Enriquecimento funcional dos genes dos sítios cpG diferencialmente metilados. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Material Suplementar 1: Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As matrizes de metilação de DNA são os métodos mais utilizados para acessar a metilação de DNA devido à sua relação custo-benefício14. O presente estudo descreveu um protocolo detalhado utilizando uma plataforma de microarray comercialmente disponível para avaliar a metilação de DNA em um estudo piloto realizado em uma coorte brasileira. Os resultados obtidos pelo estudo piloto confirmaram a eficácia do protocolo. A Figura 3 mostra a comparabilidade da amostra e a conversão completa de bisullfita32.

Como uma etapa de controle de qualidade, o algoritmo ChAMP recomendou a exclusão de sites de CpGs durante o processo de filtragem. O objetivo da exclusão das sondas é melhorar a análise de dados e eliminar o viés. Os CpGs de baixa qualidade (valores p inferiores a 0,05) foram removidos para eliminar ruídos experimentais no conjunto de dados. Os alvos permaneceram passados na análise da parcela de densidade. Zhou33 descreveu a importância de filtrar CpGs perto de SNPs para evitar incompatibilidades, má interpretação da metilação de citosinas polimórficas e causar a cor do switch do design da sonda tipo I34. Além disso, como os cromossomos XY são diferencialmente impactados pela impressão, Heiss e Just35 reforçaram a importância de filtrar essas sondas porque, nas fêmeas, os problemas com a hibridização podem ser fatores confusos35.

A data de validade do DMAPs, a data de abertura do formamida, a qualidade analítica do etanol absoluto e a contagem total de leucócitos são consideradas etapas críticas no protocolo.

Além disso, de acordo com nossas observações, a estimativa do tipo celular é essencial na realização da análise bioinformática. O método Houseman realiza a estimativa do tipo celular, conforme descrito no estudo de Tian30. Este método é baseado em 473 locais específicos de CpG que podem prever as porcentagens dos tipos celulares mais importantes, como granulócitos, monócitos, células B e células T36. Usamos a função recomendada "myRefbase" do pacote ChAMP. Após a estimativa, o algoritmo ChAMP ajusta os valores beta e elimina esse viés do conjunto de dados. Essa etapa é crucial em estudos focados na obesidade porque essa população tem uma diferença considerável nos glóbulos brancos devido ao seu estado inflamatório crônico.

Nós apenas mudamos o mapa original da tampa para o selo PCR comum em relação à modificação do método e solução de problemas. Após cada processo de centrifugação, o selo foi trocado por um novo. Não pudemos usar a vedação de calor padrão e adaptá-lo usando papel alumínio ao redor da placa.

Embora os ensaios comerciais tenham sido considerados padrão-ouro para estudos epigenéticos, uma limitação do protocolo pode ser a especificidade dos reagentes e equipamentos de uma marca única37,38,39,40. Outra limitação é a falta de indicadores que permitam identificar o correto progresso do experimento41.

A padronização do presente protocolo representa um grande guia para a pesquisa epigenética, reduzindo erros humanos durante o processo e permitindo a análise e comparabilidade bem-sucedidas de dados entre diferentes estudos.

De acordo com nossos resultados, experimentos de metilação de DNA são adequados para estudos que comparam indivíduos com e sem obesidade43. Além disso, a análise bioinformática proposta forneceu dados de alta qualidade e poderia ser considerada em estudos de grande escala.

Utilizando a análise do SVD, identificamos que os traços relacionados à obesidade (IMC, CC e FM) influenciaram a variabilidade nos dados de metilação de DNA. Como resultado significativo, a estimativa do tipo celular indica que ambas as células assassinas naturais (NK) e B foram mais elevadas em mulheres com obesidade do que em mulheres sem obesidade (Figura 5). As maiores contagens dessas células poderiam ser explicadas pelo estado inflamatório de baixo grau desses indivíduos44. Observou-se que pacientes com obesidade possuem CpGs hipoetiladas e hipermetiladas em regiões promotoras de genes associados à massa gorda. A maioria dos locais eram hipometilados, o que poderia estar relacionado ao aumento natural dos níveis reativos de oxigênio (ROS) nesses indivíduos. Esta condição de estresse oxidativo pode promover perturbação guanina no local do dinucleotídeo, formando 8-hidroxi-2'-desoxyguanosine (8-OHdG), resultando em um local de dinucleotídeo de 5mCp-8-OHdG, e causando o recrutamento de enzimas TET. Todos esses eventos podem ser responsáveis por promover hipometilação de DNA e hipermetilação por diferentes mecanismos de ação45.

Além disso, a taxa de adipogênese parece aumentar em indivíduos com obesidade, com aproximadamente 10% de novas células para células antigas46,47. Contribuições epigenéticas, enfatizando o ambiente obesogênico, podem alterar as taxas de proliferação e diferenciação das células, favorecendo o desenvolvimento da massa gorda48. Mudanças epigenéticas também podem afetar programas adipogênicos, facilitando ou restringindo seu desenvolvimento. Fatores de transcrição primária (PPARγ ou C / EBPα) ou a montagem de complexos multiproteínas, posicionados em regiões promotoras a jusante operadas incluindo ou excluindo enzimas modificadores epigenéticas, regulam a expressão genética através de hiper ou hipometilação45. A via PPARγ foi descrita anteriormente para alterar a via WNT, que teve genes enriquecidos neste estudo. Embora ainda não se saiba como a sinalização do WNT ocorre durante a adipogênese, estudos recentes relataram que ela pode ter papéis essenciais no metabolismo adipócito, particularmente sob condições obesogênicas49.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores deste artigo não têm conflitos de interesse e não têm nenhuma divulgação financeira para declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) por estar disponível para responder a todas as dúvidas sobre o pacote ChAMP. Agradecemos também a Guilherme Telles, msc. por sua contribuição tanto para as questões técnicas quanto científicas deste artigo; fez considerações importantes sobre epigenética e técnicas de captura e formatação de vídeo (guilherme.telles@usp.br). Financiamento de Materiais De Consumo: Fundação de Pesquisa de São Paulo (FAPESP) (nº 2018/24069-3) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq: #408292/2018-0). Financiamento pessoal: (FAPESP: nº 2014/16740-6) e Programa de Excelência Acadêmica da Coordenação de Desenvolvimento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES:88882.180020/2018-01). Os dados serão disponibilizados publicamente e livremente sem restrições. Endereço correspondência para NYN (e-mail: nataliayumi@usp.br) ou CBN (e-mail: carla@fmrp.usp.br).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol absolutoJ.T. BakerB5924-03
Gel de agaroseKasviK9-9100
Bioimpedância elétricaQuantum BIA 450 Q - Sistema
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Corning46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kitZymoResearch, Irvine, CA, EUAD5001
FormamidaSigmaF9037
FMS— Solução de fragmentaçãoIllumina11203428Reagentes Fornecidos
HumanMethylation450 BeadChipIllumina
Maxwell InstrumentPromega, BrasilAS4500
MA1— Amplificação Multi-Amostra 1 MixIllumina11202880Reagentes Fornecidos
Filme Adesivo Óptico MicroAmpThermo Fisher Scientific201703982
MSM— Amplificação Multi-Sample Master MixIllumina11203410Reagentes Fornecidos
NaOHF. MAIA114700
PB1— Reagente usado para preparar BeadChips para hibridizaçãoIllumina11291245Reagentes Fornecidos
PB2— Tampão umidificador usado durante a hibridizaçãoIllumina11191130Reagentes Fornecidos
2-propanolEmsure10,96,34,01,000
RA1— Solução de ressuspensão, hibridização e lavagemIllumina11292441Reagentes Fornecidos
RPM— Mistura de Primer AleatórioIllumina15010230Reagentes Fornecidos
STM— Reagentes Fornecidos pela 11288046 Master Mix Illumina de Duas Cores
TEM— Extensão de Duas Cores Master MixIllumina11208309Reagentes
Fornecidos EDTA UltrapuroInvitrogen155576-028
Placa de Reação de 96 Poços com Código de Barras (0.1mL)ByoSystems4346906
Placa de Reação de 96 Poços com Código de Barras (0.8mL)Thermo Fisher ScientificAB-0859
XC1— XStain BeadChip solução 1Illumina11208288Reagentes Fornecidos
XC2— XStain BeadChip solution 2Illumina11208296Reagentes Fornecidos
XC3— Solução XStain BeadChip 3Reagentes Fornecidos11208392Illumina
XC4— Solução XStain BeadChip 4Reagentes Fornecidos11208430Illumina
RJL

Referências

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