Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Prøveforberedelse til bioinformatik Analyse af DNA-methylering: Foreningsstrategi for fedme og relaterede trækundersøgelser

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/62598
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 4, 5, 1, 1, 6, 7, 8, 9, 6
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Den foreliggende undersøgelse beskriver arbejdsgangen til styring af DNA-methyleringsdata opnået ved hjælp af mikroarray-teknologier. Protokollen demonstrerer trin fra prøveforberedelse til dataanalyse. Alle procedurer er beskrevet detaljeret, og videoen viser de væsentlige trin.

Abstract

Fedme er direkte forbundet med livsstil og har været forbundet med DNA-methyleringsændringer, der kan forårsage ændringer i adopogenese- og lipidlagringsprocesserne, der bidrager til udviklingen af sygdommen. Vi demonstrerer en komplet protokol fra udvælgelse til epigenetisk dataanalyse af patienter med og uden fedme. Alle trin fra protokollen blev testet og valideret i en pilotundersøgelse. 32 kvinder deltog i undersøgelsen, hvor 15 personer blev klassificeret med fedme i henhold til Body Mass Index (BMI) (45,1 ± 5,4 kg / m2); og 17 personer blev klassificeret uden fedme i henhold til BMI (22,6 ± 1,8 kg / m2). I gruppen med fedme blev 564 CpG-steder relateret til fedtmasse identificeret ved lineær regressionsanalyse. CpG-webstederne var i promotorregionerne. Differentialanalysen fandt 470 CpGs hypomethylerede og 94 hypermethylerede steder hos personer med fedme. De mest hypomethylerede berigede vejevar i RUNX, WNT-signalering og respons på hypoxi. De hypermethylerede veje var relateret til insulinsekretion, glucagonsignalering og Ca2+. Vi konkluderer, at protokollen effektivt identificerede DNA-methyleringsmønstre og egenskabsrelateret DNA-methylering. Disse mønstre kan være forbundet med ændret genekspression, der påvirker adopogenese og lipidopbevaring. Vores resultater bekræftede, at en obesogen livsstil kunne fremme epigenetiske ændringer i humant DNA.

Introduction

Store omics-teknologier er i stigende grad blevet anvendt i undersøgelser af kroniske sygdomme. Et interessant træk ved disse metoder er tilgængeligheden af en stor mængde genererede data til det videnskabelige samfund. Derfor er der opstået et krav om at standardisere protokollerne for at muliggøre teknisk sammenligning mellem undersøgelser. Den foreliggende undersøgelse antyder standardisering af en protokol til opnåelse og analyse af DNA-methyleringsdata ved hjælp af en pilotundersøgelse som et anvendt eksempel.

Negativt energiforbrug dominerer i moderne menneskelig livsstil, hvilket fører til en overdreven ophobning af fedtvæv og dermed udviklingen af fedme¹. Mange faktorer har øget fedme satser, såsom sedentarisme, højt kalorieindhold kostvaner, og stressende rutiner. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslog, at 1,9 milliarder voksne var overvægtige i 2016, hvilket betyder, at mere end 20% af verdens befolkning har over 30 kg / m2 BMI2. Den seneste opdatering af 2018 afslørede, at forekomsten af fedme i USA (USA) var højere end 42%3.

Epigenetik er den strukturelle tilpasning af kromosomale regioner til at registrere, signalere eller opretholde ændrede aktivitetstilstande4. DNA-methylering er en reversibel kemisk ændring i cytosin-guanosin-dinukleotiderne (CpG-steder), der danner 5-methylcytosin-pG (5mCpG). Det kan modulere genekspression ved at regulere transkriptionsmaskineriets adgang til DNA'et5,6,7,8. I denne sammenhæng er det vigtigt at forstå, hvilke CpG-steder der er forbundet med fedmerelaterede træk9. Mange faktorer kan understøtte eller forhindre stedsspecifik DNA-methylering. Nødvendige enzymer til denne proces, såsom DNA-methyltransferaser10 (DNTM'er) og ti-elleve translokationer (TET'er), kan fremme DNA-methylering eller demethylering under miljøeksponeringer11.

I betragtning af den stigende interesse for DNA-methyleringsundersøgelser i de seneste år har det været en væsentlig bekymring for forskere at vælge den mest hensigtsmæssige analysestrategi til præcist at besvare hvert spørgsmål12,13,14. 450K DNA-methyleringsarrayet er den mest populære metode, der anvendes i mere end 360 publikationer14 til bestemmelse af DNA-methyleringsprofilen. Det kan bestemme methyleringen af op til 485.000 CpG'er placeret i 99% af de kendte gener15. Dette array er imidlertid blevet afbrudt og erstattet med EPIC, der dækker 850.000 CpG-websteder. Den nuværende protokol kan anvendes til både 450K og EPIC16,17,18.

Protokollen præsenteres trin for trin i figur 1 og omfatter følgende trin: populationsudvælgelse, prøveudtagning, eksperimentforberedelse, DNA-methyleringsrørledning og bioinformatikanalyse. En pilotundersøgelse udført i vores laboratorium er demonstreret her for at illustrere trinnene i den foreslåede protokol.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over den præsenterede protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Den etiske komité for Ribeirão Preto Medical School University Hospital ved University of São Paulo (HCRP-USP) godkendte undersøgelsen (CAAE: 14275319.7.0000.5440). Deltagerne underskrev samtykkeerklæringen, og alle procedurer blev gennemført efter Helsinki-erklæringen.

1. Befolkning og prøveudtagning

  1. Rekruttere deltagere med BMI >30 kg/m2 til undersøgelsen. Til denne undersøgelse blev 32 kvinder fra en blandingspopulation19 mellem 18 og 60 år rekrutteret.
    BEMÆRK: I HCRP-USP blev der observeret højere fedme hovedsageligt hos kvinder20. Deltagere med fedme med BMI ≥30 kg / m2 (n = 15) blev rekrutteret fra ambulatoriet for metaboliske sygdomme i HCRP-USP. Deltagerne uden fedme, med BMI mellem 18,5 kg/m2 og 24,9 kg/m2 (n = 17), blev rekrutteret fra andre klinikker og havde ikke alvorlige sygdomme; kliniske data er vist i tabel 1.
  2. Ekskluder kvinder, der er gravide, ammende mødre, rygere og indtager alkohol.

2. Antropometri og kropssammensætning

  1. Mål deltagernes vægt ved hjælp af en 200 kg digital antropometrisk skala. Sørg for at fjerne sko og overskydende tøj.
  2. Vurder højden ved hjælp af et stadiometer med en graduering på 0,5 cm. Deltagerne blev instrueret i at stå barfodet, fødderne sammen og armene ved deres sider21.
  3. Indsaml fedtmasse (FM) oplysninger ved hjælp af en elektrisk bioimpedans. Efter 12 timers faste vurderes med en tom urinblære. Placer deltagerne i liggende stilling med benene fra hinanden og armene parallelle uden at røre kroppen. Bed deltagerne om at fjerne alt metaltilbehør22.
  4. Få taljeomkredsen (WC) ved hjælp af et uudvideligt målebånd med en 0,1 mm graduering. Båndet blev placeret vandret omkring den midterste talje, lige over hoftebenene. Målingen skete lige efter en udånding. Ifølge Centers for Diseases Control and Prevention (CDC) er WC-afskæringen for kvinder 88 cm23.

Tabel 1: Befolkningskarakteristika. Alle variabler var parametriske (p > 0,05, Shapiro Wilk), og forskelle blev evalueret ved hjælp af en uafhængig t-test, hvor p < 0,05 blev betragtet som signifikant. *p < 0,0001. Klik her for at downloade denne tabel.

3. Indsamling af biologisk materiale

  1. Saml perifert blod efter 12 timers faste, som beskrevet tidligere24.
  2. Saml 4 ml af fuldblodsprøverne i opsamlingsrør med antikoagulerende middel (f.eks. EDTA) og opbevar dem på is til transport.

4. DNA-ekstraktion

  1. Centrifugering af hvert rør indeholdende blodet ved 2.000 x g i 10 minutter. Saml omkring 300 μL af buffy coat (hvid interfase).
  2. Uddrag DNA fra det perifere blod ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt instrument (se tabel over materialer), som beskrevet tidligere25. Elute DNA'et i 480 μL ultrarent H2O.
  3. Vurder DNA-koncentration og kvalitet ved hjælp af et fluorometer. Integriteten blev evalueret ved hjælp af en 1% agarosegelanalyse25. Opbevares i en fryser ved -80 °C.

5. Forberedelse inden methyleringsanalyse

  1. Sørg for, at prøverne har den mindste DNA-koncentration (500 ng er det ideelle indledende input til at starte), men fortyndingen kan variere mellem prøverne i dette trin.
  2. Nogle reagenser er ikke inkluderet i microarray kit26, så køb dem separat27.
  3. Kontroller, om sættet indeholder alle reagenser, der anvendes under proceduren; de er uerstattelige. Kontroller udløbsdatoen for alle reagenser. Sørg for, at andre reagenser og opløsninger, der ikke findes i sættet, også er tilgængelige (95% formamid/1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, absolut ethanol, 2-propanol).
    FORSIGTIG: Formamid er et flygtigt reagens; kvaliteten af resultaterne kan forbedres, hvis produktet er frisk. Integriteten og kvaliteten af formamid og absolut ethanol betragtes som kritisk, fordi de kan påvirke farvningsprocessen foreslået af producenten. De valgte alkoholer skal være ultrarene produkter, der er specifikke for molekylærbiologisk analyse.
  4. Når microarray-sættet er erhvervet, skal du downloade Chips Decode Maps (DMAP'er). Disse filer er tilgængelige på producentens websted 24-48 timer efter, at sættet er afsendt, og er udelukket på udløbsdatoen28. For at downloade de nævnte filer skal du udføre nedenstående trin.
    1. Sørg for, at der er en computer med internetadgang. Udfør overførslen ved hjælp af Software Decode File Client.
    2. Før du installerer programmet, skal du sikre dig, at computeren har udgående og indgående adgang, der er givet af institutionen; Decode File Client har ikke sikkerhedsbegrænsninger.
    3. Log ind på Decode File Client-softwaren ved hjælp af indstillingen Access by BeadChip. Dette login udføres ved hjælp af MyIllumina bruger-id og adgangskode. Tilmelding på denne side er påkrævet28.
    4. Når du er logget ind på Decode File Client, skal du indtaste nedenstående oplysninger i deres respektive felter på softwarens startside28: Liste over stregkoder; Liste over boks-id'er; Indkøbsordrenummer (PO); og salgsordrenummer (husk ikke at medtage de bogstaver, der følger tallene).
    5. Vælg de DMAP'er, der skal downloades i henhold til stregkodenummeret i købsfeltet, og angiv destinationen i dialogboksen for at gemme DMAP'erne.
    6. Klik på knappen for at starte overførslen.
      BEMÆRK: I slutningen af overførslen skal du sørge for, at de downloadede mapper ikke er tomme og gemme filerne sikkert, da de vil være nødvendige for det sidste trin til at konvertere eksperimenterne til intensitetsdatafiler (IDAT-filer). Efter udløbsdatoen kan Illumina fjerne DMAPs data fra sin online database.

6. DNA-methyleringsrørledning

BEMÆRK: DNA-methyleringseksperimentet er opdelt i 4 dage (figur 1). Følg producentens anbefalinger og specifikationer for at opnå nøjagtige resultater.

  1. Dag 1: Bisulfitbehandling
    1. Start med at denaturere 500 ng genomisk DNA, og tilsæt derefter konverteringsreagenserne. For at udføre dette trin skal du følge anbefalingerne fra bisulfit- og mikroarray-sættene29.
    2. Det denaturerede DNA behandles med 130 μL af bisulfitkonverteringsreagenset i den standardkoncentration, som fabrikanten har angivet.
    3. Inkuber røret i en termocyklist i 16 cyklusser ved 95 °C i 30 s og 50 °C i 1 time. Ramp ned ad termocyklisten til 4 °C i 10 min.
    4. Udfør vasketrinnet ved at tilsætte 100 μL af vaskebufferen og derefter centrifugere ved fuld hastighed i 30 s. Koncentrationen findes ikke i brugervejledningen, og producenten standardiserer mængderne.
      BEMÆRK: Dette reagens leveres med sættet og behøver ikke at blive fortyndet eller tilberedt.
  2. Dag 2: Forstærkning - methyleringsassay, manuel protokol
    1. Forvarm hybridiseringsovnen til 37 °C, og lad temperaturen udligne.
    2. Påfør en stregkodeetiket på en 0,8 ml mikroplade.
    3. Optøning af forstærkningsreagenserne (Multi-Sample Amplification Mix 1, Random Primer Mix og Multi-Sample Amp Master Mix) ved stuetemperatur (disse reagenser følger med sættet og behøver ikke at blive fortyndet eller forberedt). Udfør derefter en blid inversion mindst 10x, indtil rørenes samlede indhold er blandet.
    4. Dispenser 20 μL af Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) i pladens brønde.
    5. Overfør 4 μL af DNA-prøven fra den bisulfitkonverterede plade til de tilsvarende brønde på 0,8 ml-pladen. På dette tidspunkt skal du registrere den originale DNA-prøves ID på laboratoriesporingsformularen svarende til pladebrøndene.
    6. Dispenser 4 μL 0,1 N NaOH i hver brønd på pladen, der indeholder Multi-Sample Amplification Mix 1 (MA1) og DNA-prøven.
    7. Forsegl pladen med en plastikforsegling.
    8. Vortex pladen for at blande reagenserne med prøverne ved 1.600 o / min i 1 min. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur og fjern forsigtigt tætningen.
    9. Pipette 68 μL Random Primer Mix (RPM) i hver brønd på pladen. Pipette 75 μL Multi-Sample Amp Master Mix (MSM) i hver brønd på pladen (uden at fjerne den tidligere opløsning). Brug en ny tætning til at dække pladen.
      BEMÆRK: Pas på at kombinere brøndene med pladen og orientere den korrekt.
    10. Vortex den forseglede plade ved 1.600 o / min i 1 min. Inkuber i hybridiseringsovnen i 20-24 timer ved 37 °C.
  3. Dag 3: Hybridisering - methyleringsassay, manuel protokol
    1. Forvarm blokken til 37 °C.
    2. Optø indholdet af røret ved stuetemperatur. Vend forsigtigt og forsigtigt FMS-rørene (Fragmentation Solution) mindst 10x for at blande indholdet grundigt.
    3. Fjern forsigtigt pladen fra hybridiseringsovnen. Pulscentrifugering af pladen ved 280 x g.
    4. Fjern nu tætningen fra pladen. I hver brønd på pladen, der indeholder en prøve, tilsættes 50 μL fragmenteringsopløsning (FMS) og forsegles pladen igen. Vortex pladen ved 1.600 omdr./min i 1 min.
    5. Centrifugering af pladen ved 280 x g i et par sekunder (udfør pulscentrifugering). Anbring derefter den forseglede plade på varmeblokken ved 37 °C i 1 time.
    6. Hvis det blev besluttet at sætte eksperimentet på pause og fryse pladen, optø den ved stuetemperatur og centrifugere den ved 280 x g. Hvis det ikke er frosset, skal du springe dette trin over og gå til trin 6.3.7.
    7. Lad varmeblokken forvarme til 37 °C.
    8. Lad vaskebufferen tø op ved stuetemperatur. Når det er optøet, skal du vende det mindst 10x for at blande indholdet.
    9. Fjern tætningen fra pladen.
    10. Der tilsættes 100 μL nedbørsopløsning (PM1) til hver brønd på pladen, der indeholder prøver.
    11. Forsegl pladen igen med tætningen.
    12. Vortex pladen ved 1.600 omdr./min i 1 min.
    13. Inkuber ved 37 °C i 5 min.
    14. Anbring derefter i pulscentrifugen ved 280 x g i 1 min.
      BEMÆRK: Indstil centrifugen til 4 °C for det næste trin.
    15. Fjern forsigtigt tætningen fra pladen og kassér den.
    16. Der tilsættes 300 μL 2-propanol (100 %) til hver brønd, der indeholder prøven.
    17. Forsegl pladen med ekstrem omhu ved hjælp af en ny tætning. Pas på ikke at ryste pladen.
    18. Omvendt pladen mindst 10x, bland hele indholdet.
    19. Inkuber ved 4 °C i 30 min.
    20. Centrifuge ved 3.000 x g ved 4 °C i 20 min.
      BEMÆRK: I slutningen af trin 6.3.20 skal centrifugepladen straks fjernes.
    21. Fjern tætningen fra pladen og kassér den.
    22. Omvendt pladen hurtigt og tøm væsken på en pude for at kassere supernatanten. Tryk derefter på pladen i et tørt område på et papirhåndklæde for at dræne væsken.
    23. Tryk godt på flere gange i 1 min., eller indtil alle brøndene er fri for væske.
    24. Lad pladen være omvendt og afdækket i 1 time ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Det forventes at se blå pellets i bunden af brøndene.
    25. Forvarm hybridiseringsovnen til 48 °C.
    26. Tænd for varmeblokken for at forvarme. Tillad 20 minutter til denne proces.
    27. Optø resuspension, hybridisering og vaskeopløsning ved stuetemperatur. Inverter mindst 10x. Kontroller, at der ikke er udfældet salt i opløsningen.
    28. Tilsæt 46 μL Resuspension, Hybridisering og Vaskeopløsning (RA1) til hver brønd på pladen.
      BEMÆRK: Eventuelle resterende reagenser skal reserveres til farvnings- og hybridiseringstrinnene.
    29. Påfør tætningen på pladen. Brug en aluminiumsforsegling til at dække pladen. Hold godt fast for at udføre tætningen jævnt.
    30. Kontroller, om alle brønde er sikkert lukket for at undgå fordampning.
    31. Anbring forsigtigt den nyligt forseglede plade i hybridiseringsovnen og inkuber ved 48 ° C i 1 time.
    32. Vortex pladen ved 1.800 omdr./min i 1 min.
    33. Pulscentrifuge ved 280 x g.
    34. Overfør pladen til varmeblokken ved 95 °C i 1 time.
    35. Forbered hybridiseringskamrene (Hyb) ved at placere dem sammen. Dispenser 400 μL befugtningsbuffer (PB2) i hybkamrenes reservoirer. Sæt låget på med det samme.
    36. Læg hver prøve fra pladen i mikroarrayets prøveindgangsåbning.
    37. Læg Hyb Chamber-indsatserne, der indeholder mikroarrays, i Hyb Chamber. Luk Hyb Chamber på tværs for at undgå mulig forskydning af Hyb Chamber.
      BEMÆRK: Hybkamre skal inkuberes ved 48 °C i mindst 16 timer, men ikke over 24 timer.
  4. Dag 4: Farvning - methyleringsassay, manuel protokol
    1. Genophævning af farvningsopløsningen 4 med 330 ml 100% EtOH, hvilket opnår et endeligt volumen på 350 ml. Ryst staining Solution 4-flasken kraftigt for at sikre fuldstændig genopstredning. Opbevares ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Farvningsopløsning 4 kan opbevares i op til 2 uger ved en temperatur mellem 2 °C og 8 °C.
    2. Fjern kamrene fra hybridiseringsovnen, og lad dem køle af på bænken i 30 minutter, før de åbnes.
    3. Mens Hyb Chamber køler, skal du fylde to vaskebeholdere med wash buffer (200 ml pr. vaskebeholder). Husk at mærke hver beholder som "Vaskebuffer" (PB1 og PB2).
    4. Fyld tilbehøret til mikroarrayjustering med 150 ml vaskebuffer.
    5. Adskil plast afstandsstykkene og rengør om nødvendigt glasset.
    6. For at vaske mikroarray-diasene skal du fastgøre trådsløjfen til gitteret og nedsænke det dryppende udstyr i beholderne med 200 ml vaskebuffer i alt 10x.
    7. Fjern alle indsatser fra hybridiseringskammeret, og fjern hvert array fra indsatserne. Fjern forseglingen.
      BEMÆRK: Under fjernelse må du ikke røre ved de eksponerede matricer.
    8. Mens du fjerner mikroarray-diasene fra hybridiseringskammeret, skal du være forsigtig med ikke at spilde noget.
    9. Vask mikroarrays i vaskebufferopløsningen (PB1) langsomt og let, og bevæg dig op og ned 10x. Flyt til en frisk PB1-opløsning, og udfør vasken ved langsomt at flytte mikroarrays 10x op og ned i opløsningen.
    10. Fjern mikroarray fra beholderen og bekræft fraværet af rester.
    11. Brug et gennemsigtigt afstandsrum øverst i hvert mikroarray, og led afstandsopdelterne til de tilsvarende positioner.
      BEMÆRK: Pas på kun at bruge de gennemsigtige afstands afstandsstige, ikke de hvide.
    12. Placer justeringsbjælken på justeringstilbehøret.
    13. Anbring en glasbagplade på toppen af det klare afstandsstykke; Pas på at dække hele mikroarrayet. Fastgør derefter metalklemmer til strømningskamrene. Brug om nødvendigt en saks til at trimme enderne af flowkammerets afstandsopdelte.
    14. Vask straks hybridiseringskammerets reservoirer ved hjælp af ddH2O og skrub med en lille rengøringsbørste. Lad ikke nogen befugtningsbuffer forblive i beholderen.
    15. Gå til det næste trin, der er ansvarlig for extending and staining Microarray.
      BEMÆRK: Lad alle flowkamrene være vandret monteret på laboratoriebænken. Håndter dem kun igen, når hele farvningstrinnet er klar. Opvarm resuspension, hybridisering og vaskeopløsning til en temperatur mellem 20 °C og 25 °C. Bland forsigtigt, indtil der ikke ses krystal i opløsningen.
    16. Anbring reagenserne i et stativ i rækkefølge. Hvis nogen er frosne, skal du lade dem stå ved stuetemperatur og derefter vende dem mindst 10x for at blande opløsningerne.
    17. Fyld vandcirkulationspumpen til det passende niveau.
    18. Tænd for pumpen, og indstil temperaturen til 44 °C.
    19. Fjern eventuelle bobler, der er fastgjort til kammerstativet.
    20. Udfør test på kammerstativet ved hjælp af en temperatursonde. Alle testede steder skal være mellem 44 °C ± 0,5 °C.
      BEMÆRK: Følgende trin skal udføres uden afbrydelse.
    21. Når stativet når en temperatur på 44 °C, skal du hurtigt placere hver enhed i flowkammeret.
      BEMÆRK: Til følgende trin pipetter alle reagenser i den bageste glasplade.
    22. Pipette 150 μL resuspension, hybridisering og vaskeopløsning (RA1). Derefter inkuberes i 30 minutter. Gentag dette trin i alt 5x.
    23. Pipette 450 μL af farvningsopløsning 1 (XC1) og inkuberes i 10 minutter.
    24. Pipette 450 μL farvningsopløsning 2 (XC2) og inkuberes i 10 minutter.
    25. Pipette 200 μL af Two-Color Extension Master Mix (TEM) og inkubere i 15 min.
    26. Pipette 450 μL af 95% formamid/1 mM EDTA og inkuberes i 1 min. Gentag to gange.
    27. Inkuber i 5 min.
    28. Sænk temperaturen på kammerstativet til 32 °C (angivet på Superior Two-Color Master Mix).
    29. Pipette 450 μL pletopløsning 3 (XC3) og inkuber i 1 min. Gentag 1x.
    30. Vent på, at stativet i kammeret når den korrekte temperatur.
      BEMÆRK: For at læse mikroarray-billedet umiddelbart efter farvelægningsprocessen skal du tænde scanneren på dette tidspunkt.
    31. Dispenser nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), efterfulgt af en 10 minutters inkubation.
    32. Derefter dispenseres 450 μL pletopløsning 3 (XC3) efterfulgt af 1 minuts inkubation. Gentag 1x.
    33. Vent i 5 minutter, og tilsæt derefter 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) og inkuber i 10 minutter.
    34. Dispenser nu 250 μL Superior Two-Color Master Mix (STM), efterfulgt af en 10 minutters inkubation.
    35. Derefter dispenseres 450 μL pletopløsning 3 (XC3) efterfulgt af 1 minuts inkubation. Gentag 1x.
    36. Vent i 5 minutter.
    37. Tilsæt 250 μL Anti-Stain 2-Color Master Mix (ATM) og inkuber i 10 minutter.
    38. Tilsæt 450 μL Stain Microarray Solution 3 (XC3), og inkuber i 1 min., og gentag derefter igen.
    39. Vent i 5 minutter.
      BEMÆRK: Gør følgende gentagelsesskema: Trin 6.4.34., Trin 6.4.35. og trin 6.4.36.; Trin 6.4.37., 6.4.38. og trin 6.4.39. Trin 6.4.34., trin 6.4.35. og trin 6.4.36.
    40. Fjern nu straks strømningskamrene fra stativet og læg dem forsigtigt vandret på laboratoriebænken. Sørg for, at temperaturen er omgivende.
    41. 6.4.41.Anbring 310 ml vaskeopløsning (PB1) for hver mikroarray i en vaskebeholder.
    42. Fjern metalklemmerne og glasset og til sidst mikroarrayet.
    43. Anbring mikroarrays på et farvningsstativ og læg dem i vaskebeholderen, der indeholder 10x PB1-opløsning. Sørg for, at stregkoderne vender væk fra den, der håndterer dem, og at alle mikroarrays er nedsænket.
    44. Bevæg dig langsomt og let med op og ned bevægelser 10x. Mikroarrayet skal fjernes helt fra opløsningen, før det nedsænkes igen. Lad det derefter forblive nedsænket i 5 minutter.
    45. Ryst pletopløsning 4 (XC4)-reagenset kraftigt for at sikre total resuspension. Anbring 310 ml XC4 i en vaskebeholder.
      BEMÆRK: Lad ikke opløsningen sidde i vaskebeholderen i mere end 10 minutter.
    46. Flyt farvningsstativet let til den anden beholder med XC4.
    47. Bevæg dig langsomt og let med op og ned bevægelser 10x. Sørg for, at mikroarrayet fjernes helt fra opløsningen, før det nedsænkes igen.
    48. Lad derefter mikroarrayet forblive nedsænket i 5 minutter.
    49. Flyt farvningen ud af opløsningen, og læg den i en rørholder med stregkoderne vendt op.
    50. Fjern forsigtigt mikroarrayet ved hjælp af låsepæl og læg dem på en hylde for at tørre.
    51. Tør dem med vakuumtørreren i 50-55 minutter ved 675 mm Hg (0,9 bar).
    52. Rengør bagsiden af hvert mikroarray ved hjælp af EtOH.
      FORSIGTIG: Undgå at røre ved striberne, og lad ikke EtOH dryppe på striberne på nogen måde.
    53. Fortsæt med at afbilde mikroarrayet.
    54. Opbevar forsigtigt mikroarrayet i en opbevaringsboks ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Microarray-billeder skal tages inden for 72 timer.

7. Analyse af bioinformatik

BEMÆRK: Det er nødvendigt at ændre nogle attributter af typen af mikroarray (f.eks. arraytype = "450k" skal erstattes af arraytype = "EPIC"). Forfatteren af ChAMP-rørledningen beskriver detaljeret alle felter, der skal ændres for at analysere arrays på siden Bioconductor i pakken30.

  1. Eksempelark
    1. Overfør IDAT-filerne til computeren for at fortsætte med bioinformatikanalyse31. Opret et eksempelark for at udføre dataanalysen31.
      BEMÆRK: Tre kolonner er vigtige for denne regnearksfil. Den første er Sample_name. Denne kolonne skal indeholde de navne eller koder, der bruges til at identificere prøverne. Den anden er Sentrix_position. Denne kolonne placerer den tilsvarende R01C01 af prøverne, hvor R01 er ansvarlig for chiprækken, og kolonnen kaldes C01. Den tredje væsentlige kolonne er Sentrix_ID, og den er ansvarlig for at modtage det nummer, der identificerer mikroarrayet. Sørg for at sætte de korrekte tal. Det er muligt at tilføje andre oplysninger på prøvearket som variable værdier. I det foreliggende eksperiment blev data fra metalanalysen inkluderet.
  2. ChAMP-rørledning
    1. Installer RStudio (V.4.0.2) på computeren for at udføre analysen30.
      BEMÆRK: Sørg for, at computeren har mindst 8 G RAM. Dataanalyse vil kæmpe eller gå ned med en lavere mængde RAM.
    2. Efter installationen skal du åbne RStudio og installere ChAMP Bioconductor-pakken30 ved hjælp af den respektive kommandolinje (se Supplerende materiale 1).
      BEMÆRK: Hvis der er nogen fejl i slutningen af installationen, skal du installere de nødvendige ChAMP-biblioteker manuelt, en efter en26.
    3. Importer nu de rå data, og udfør analysen. Se supplerende materiale 1.
      champ.load () importerer de rå data og udfører filtreringsprocessen, undtagen sonder med lav detektionspval, multihit-steder, ikke-CG-sonder, CpG-steder tæt på SNP'er og CpG'er placeret i seksuelle kromosomer.
      champ.impute() udfører KNN-imputation som standard.
      Champ. QC henter datakvalitetsgrafer (f.eks. tæthedsdiagram).
      Champ. SVD evaluerer batcheffekter baseret på de metadata, der er angivet i eksempelarket.
      champ.refbase () udfører celletypeestimering og korrektion.
      Champ. DMP( ) henter differentielt methylerede positioner og egenskabsforeninger såsom fedtmasse for at kontrollere DNA-methyleringen mellem grupper og ændre parametrene, som vist i supplerende materiale 1.
  3. Berigelse (string DB)
    BEMÆRK: Funktionel berigelse bruges til at udlede de biologiske funktioner i et sæt gener.
    1. Hvis du vil forbedre data i en streng, skal du vælge listen over mål, der skal forbedres og bruges som input fra: https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. For organisme skal du vælge homo sapiens og trykke på knappen Søg.
    3. For at navigere gennem forbedringen skal du klikke på knappen Analyse.
  4. GEO indsendelse
    1. Deponer dataene til et offentligt lager som NCBI's GEO. Til dette skal du registrere dig for indsenderkontoen.
      BEMÆRK: Udfyld GEO-indsendelsen (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) ved at downloade metadataarket med beskrivende oplysninger og protokoller for det samlede eksperiment og individuelle prøver. GEO-arkivindsendelser kan oprettes i enhver regnearkssoftware. For det andet skal du tilføje den rå datafil, der er genereret fra cell-ranger-optællingsscriptet for alle biblioteker, i mappen. IDAT og tilknyttede filer eller et matrixregneark indeholder ikke-normaliserede data. Den tredje mappe er de behandlede datafiler. Matrixtabellen er et regneark, der indeholder de endelige, normaliserede værdier, der kan sammenlignes på tværs af rækker og prøver og fortrinsvis behandles som beskrevet i ethvert ledsagende manuskript.
    2. Placer behandlede datafiler, der er genereret fra cell-ranger-optællingsscriptet for alle biblioteker, i mappen. Brug GEO-indsenderens FTP-serverlegitimationsoplysninger til at overføre den mappe, der indeholder alle tre komponenter.

Representative Results

Efter brug af ChAMP-rørledningen blev 409.887 sonder overvejet i analysen efter alle filtre (ukvalificerede CpG'er, ikke-CG-sonder, CpG nær SNP'er, multihit-steder og CpG'er relateret til XY); en ordning er repræsenteret i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Pipeline af bioinformatikanalysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Desuden afslørede densitetsplottet, at alle prøver havde lignende tætheder af beta-fordelingen relateret til kvalitetskontroltrinnene. Denne analyse evaluerer fordelingen af betaværdier og påpeger, om der er nogen prøver, der skal udelukkes. I dette parti blev ingen prøver udelukket på grundlag af denne analyse.

Figure 3
Figur 3: Betaværdier tæthedsplot opnået med ChAMP-pakken.

SVD-analysen (singular value decomposition) blev brugt til at verificere de vigtigste komponenter, der signifikant påvirkede DNA-methyleringsdatavariabiliteten. Dataene afslørede, at BMI, WC (p < 1e10-5) og FM (p < 0,05) havde en signifikant effekt på datavariabiliteten (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Ental værdi nedbrydning analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Celletypeestimering afslørede, at både naturlige dræberceller (NK) og B-celler var højere hos overvægtige kvinder (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Cellefraktioner estimeret ved Housemans metode. Gran: granulocyt. CD4T: hjælper T-celle, lymfocyt. CD8T: cytotoksisk T-celle, lymfocyt. Mono: monocyt. B-celle: B-lymfocyt. NK: naturlige dræberceller, lymfocytter. *p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

DNA-methyleringsniveauer mellem overvægtige og ikke-overvægtige kvinder varierede før og efter celletypekorrektion. Før DNA-methyleringsdatakorrektion for celletyper blev der observeret 43.463 differentielt methylerede positioner (DMP'er), og 3.329 CpG'er forblev signifikante efter. 445 CpG-steder var i intergene regioner (IGR), og 2.884 var i geniske regioner, med de fleste i promotorregionen (n = 1.438). Fordelingen langs alle regioner var TSS1500 (n = 612), TSS200 (n = 826), 5'UTR (n = 390), første exon (n = 273), krop (n = 724) og 3'UTR (n = 59). I betragtning af Δβ-værdier <-0,05 og >0,05 blev 162 CpG'er hypomethyleret, og 576 blev hypermethyleret hos overvægtige sammenlignet med ikke-overvægtige individer (figur 6). Dataene er tilgængelige i GEO-databasen under registerkoden GSE166611.

Figure 6
Figur 6: Differentielt methylerede positioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det er muligt at evaluere de forskellige methylering mellem grupper og finde CpG-steder forbundet med specifikke træk i methyleringsundersøgelser. Til fedtmasseundersøgelser blev der fundet 13.222 CpG-steder. 6.159 CpG'er i promotorregionen var relateret til fedtmasse, med 470 hypermethylerede og 94 hypomethylerede (figur 7), og de respektive gener blev beriget (tabel 2).

Figure 7
Figur 7: Promotorregioner af hypomethylerede og hypermethylerede gener, uafhængigt relateret til fedtmasse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 2: Funktionel berigelse af generne fra de differentielt methylerede CpG-steder. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende materiale 1: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

DNA-methyleringsarrays er de mest anvendte metoder til at få adgang til DNA-methylering på grund af deres cost-benefit-forhold14. Den foreliggende undersøgelse beskrev en detaljeret protokol ved hjælp af en kommercielt tilgængelig mikroarray-platform til evaluering af DNA-methylering i en pilotundersøgelse udført i en brasiliansk kohorte. De opnåede resultater fra pilotundersøgelsen bekræftede protokollens effektivitet. Figur 3 viser prøvens sammenlignelighed og den fuldstændige bisulfitkonvertering32.

Som et kvalitetskontroltrin anbefalede ChAMP-algoritmen udelukkelse af CpGs-websteder under filtreringsprocessen. Formålet med at udelukke sonder er at forbedre dataanalysen og eliminere bias. CpG'erne af lav kvalitet (p-værdier lavere end 0,05) blev fjernet for at eliminere eksperimentel støj i datasættet. Målene forblev bestået i tæthedsplotanalysen. Zhou33 beskrev vigtigheden af at filtrere CpG'er nær SNP'er for at undgå uoverensstemmelser, fejlfortolkning af polymorfe cytosiners methylering og forårsage switchfarve af type I-sondedesign34. Da XY-kromosomer påvirkes forskelligt af prægning, forstærkede Heiss og Just35 også vigtigheden af at filtrere disse sonder, fordi problemerne med hybridisering hos kvinder kan være forvirrende faktorer35.

DMAP'ernes udløbsdato, formamidåbningsdatoen, den analytiske kvalitet af den absolutte ethanol og det samlede leukocytantal betragtes som kritiske trin i protokollen.

Desuden er celletypeestimeringen ifølge vores observationer afgørende for at udføre bioinformatikanalysen. Houseman-metoden udfører celletypeestimeringen som beskrevet i Tians undersøgelse30. Denne metode er baseret på 473 specifikke CpG-steder, der kan forudsige procentdelen af de vigtigste celletyper, såsom granulocytter, monocytter, B-celler og T-celler36. Vi brugte den anbefalede funktion "myRefbase" fra ChAMP-pakken. Efter estimeringen justerer ChAMP-algoritmen betaværdierne og eliminerer denne bias fra datasættet. Dette trin er afgørende i undersøgelser med fokus på fedme, fordi denne befolkning har en betydelig forskel i hvide blodlegemer på grund af deres kroniske inflammatoriske tilstand.

Vi ændrede kun det originale hættekort til den fælles PCR-forsegling vedrørende metodeændring og fejlfinding. Efter hver centrifugeringsproces blev forseglingen ændret til en ny. Vi kunne ikke bruge standard varmeforseglingen og tilpassede den ved hjælp af aluminiumsfolie omkring pladen.

Selvom kommercielle assays er blevet betragtet som en guldstandard for epigenetiske undersøgelser, kan en begrænsning af protokollen være specificiteten af reagenser og udstyr fra et unikt mærke37,38,39,40. En anden begrænsning er manglen på indikatorer, der gør det muligt at identificere eksperimentets korrekte fremskridt41.

Standardiseringen af denne protokol repræsenterer en god vejledning til epigenetisk forskning, hvilket reducerer menneskelige fejl under processen og muliggør vellykket dataanalyse og sammenlignelighed mellem forskellige undersøgelser.

Ifølge vores resultater er DNA-methyleringsforsøg velegnede til undersøgelser, der sammenligner personer med og uden fedme43. Den foreslåede bioinformatikanalyse gav også data af høj kvalitet og kunne overvejes i store undersøgelser.

Ved hjælp af SVD-analysen identificerede vi, at de fedmerelaterede træk (BMI, WC og FM) påvirkede variabiliteten i DNA-methyleringsdata. Som et signifikant resultat indikerer celletypeestimatet, at både naturlige dræberceller (NK) og B-celler var højere hos kvinder med fedme end hos kvinder uden fedme (figur 5). De højere tællinger af disse celler kunne forklares ved disse individers lavgradige inflammatoriske tilstand44. Vi observerede, at patienter med fedme har hypo- og hypermethylerede CpG'er i promotorområder af gener forbundet med fedtmasse. De fleste af stederne var hypomethylerede, hvilket kunne relateres til den naturlige stigning i reaktive iltarter (ROS) niveauer hos disse individer. Denne oxidative stresstilstand kan fremme guanin perturbance på dinukleotidstedet, danne 8-hydroxy-2'-deoxyguanosin (8-OHdG), hvilket resulterer i et 5mCp-8-OHdG dinukleotidsted og forårsager rekruttering af TET-enzymer. Alle disse hændelser kan være ansvarlige for at fremme DNA-hypomethylering og hypermethylering ved hjælp af forskellige virkningsmekanismer45.

Derudover synes hastigheden af adopogenese at stige hos personer med fedme, med ca. 10% af nye celler til gamle celler46,47. Epigenetiske bidrag, der understreger det obesogene miljø, kan ændre cellernes sprednings- og differentieringshastigheder, hvilket favoriserer udviklingen af fedtmasse48. Epigenetiske ændringer kan også påvirke adibiogene programmer, lette eller begrænse deres udvikling. Primære transkriptionsfaktorer (PPARγ eller C / EBPα) eller samlingen af multiproteinkomplekser, der er placeret i downstream-promotorregioner, der drives ved at inkludere eller udelukke epigenetiske modificerende enzymer, regulerer genekspression gennem hyper- eller hypomethylering45. PPARγ-vejen er tidligere blevet beskrevet for at ændre WNT-vejen, som havde gener beriget i denne undersøgelse. Selvom det stadig er ukendt, hvordan WNT-signalering forekommer under adopogenese, har nylige undersøgelser rapporteret, at det kan have væsentlige roller i adipocytmetabolisme, især under obesogene forhold49.

Disclosures

Forfatterne af denne artikel har ingen interessekonflikter og har ingen finansielle oplysninger at erklære.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Yuan Tian, Ph.D. (tian.yuan@ucl.ac.uk) for at være tilgængelig for at besvare al tvivl om ChAMP-pakken. Vi takker også Guilherme Telles, Msc. for hans bidrag både til de tekniske og videnskabelige spørgsmål fra denne artikel; han gjorde vigtige overvejelser vedrørende epigenetik og videooptagelses- og formateringsteknikker (guilherme.telles@usp.br). Finansiering af forbrugsstoffer: São Paulo Research Foundation (FAPESP) (#2018/24069-3) og National Council for Scientific and Technological Development (CNPq: #408292/2018-0). Personlig finansiering: (FAPESP: #2014/16740-6) og Academic Excellence Program fra Coordination for Higher Education Staff Development (CAPES: 88882.180020/2018-01). Dataene vil blive gjort offentligt og frit tilgængelige uden begrænsning. Adressekorrespondance til NYN (e-mail: nataliayumi@usp.br) eller CBN (e-mail: carla@fmrp.usp.br).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol J.T. Baker B5924-03
Agarose gel Kasvi K9-9100
Electric bioimpedance Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Corning 46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit ZymoResearch, Irvine, CA, USA D5001
Formamide Sigma F9037
FMS—Fragmentation solution Illumina 11203428 Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip Illumina
Maxwell Instrument Promega, Brazil AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix Illumina 11202880 Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix Illumina 11203410 Supplied Reagents
NaOH F. MAIA 114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization Illumina 11291245 Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization Illumina 11191130 Supplied Reagents
2-propanol Emsure 10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution Illumina 11292441 Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix Illumina 15010230 Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix Illumina 11288046 Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix Illumina 11208309 Supplied Reagents
Ultrapure EDTA Invitrogen 155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) ByoSystems 4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) Thermo Fisher Scientific AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1 Illumina 11208288 Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2 Illumina 11208296 Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3 Illumina 11208392 Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4 Illumina 11208430 Supplied Reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148 (2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3 (2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855 (2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699 (2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099 (2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762 (2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123 (2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15 (2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86 (2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64 (2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670 (2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078 (2020).

Tags

Genetik udgave 183 DNA-methylering fedme ChAMP bioinformatik epigenetik fedtmasse body mass index
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues,… More

Noronha, N. Y., da Silva Rodrigues, G., de Souza Pinhel, M. A., Cazier, J. B., Watanabe, L. M., Menezes, A. N., Bueno, C. R., Nicoletti, C. F., de Oliveira, B. A. P., Schineider, I. M., Yonehara Noma, I. H., Dias Alcarás, I. C., Barbosa, F., Barbosa Nonino, C. Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies. J. Vis. Exp. (183), e62598, doi:10.3791/62598 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter