Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Resumo

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Resumo

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos e são tratadas rotineiramente com antibióticos empíricos. No entanto, devido ao aumento da resistência microbiana, a eficácia dos antibióticos mais usados diminuiu. Para encontrar opções alternativas de tratamento, há uma grande necessidade de uma melhor compreensão da patogênese DA UTI e dos mecanismos que determinam a suscetibilidade da UTI. Para investigar isso em um modelo animal, é indispensável um ensaio reprodutível e não invasivo para estudar o curso da UTI.

Durante anos, o padrão-ouro para a enumeração da carga bacteriana tem sido a determinação de Unidades de Formação de Colônias (UFC) para um determinado volume amostral. Esta técnica requer homogeneizações de órgãos pós-morte e diluições seriais, limitando a produção de dados e a reprodutibilidade. Como alternativa, a bioluminescência (BLI) está ganhando popularidade para determinar a carga bacteriana. A rotulagem de patógenos com um operon lux permite a detecção e quantificação sensíveis de forma não invasiva, permitindo assim o acompanhamento longitudinal. Até agora, a adoção da BLI na pesquisa da UTI permanece limitada.

Este manuscrito descreve a implementação prática de BLI em um modelo de infecção do trato urinário do rato. Aqui, é fornecido um guia passo-a-passo para a cultura de bactérias, instilação intravesical e imagem. A correlação in vivo com a UFC é examinada e uma prova de conceito é fornecida comparando a carga bacteriana de animais infectados não tratados com animais tratados com antibióticos. Além disso, são discutidas as vantagens, limitações e considerações específicas para a implementação da BLI em um modelo in vivo UTI. A implantação da BLI no campo de pesquisa da UTI facilitará muito a pesquisa sobre a patogênese da UTI e a descoberta de novas formas de prevenir e tratar a ITU.

Introdução

As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas mais comuns em humanos. Quase metade de todas as mulheres experimentarão uma UTI sintomática durante sua vida¹. Infecções limitadas à bexiga podem dar origem a sintomas urinários como aumento da frequência urinária, urgência, hematuria, incontinência e dor. Quando a infecção sobe para o trato urinário superior, os pacientes desenvolvem pyelonephritis, com mal-estar, febre, calafrios e dor nas costas. Além disso, até 20% dos pacientes com UTI sofrem de infecções recorrentes, resultando em uma redução drástica na sensibilidade a antibióticos^2,

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Comunitário da União Europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da KU Leuven (P158/2018).

1. Bactérias de cultivo (adaptadas a partir de^7,13,14)

1. Preparação
   1. Escolha uma cepa UPEC luminescente que melhor se encaixe nas necessidades experimentais.
      NOTA: Aqui, o isolado da cistite clínica, UTI89 (E. coli), foi selecionado por causa de sua capacidade uropatogênica tanto em humanos quanto em roedores, e seu uso comum nos mod....

Resultados

In vivo BLI correlaciona-se com a UFC do inóculo no momento da instilação.
Para avaliar o limite de detecção do BLI in vivo e a correlação com a UFC do inóculo, os camundongos foram infectados com diferentes concentrações de UTI89-lux e PBS como controle negativo. Antes da instilação, animais não infectados eram escaneados para determinar a luminescência de fundo. As imagens subsequentes foram obtidas imediatamente após a instilação(Fig.......

Discussão

Vantagens da BLI em relação às contagens de UFC
Dados longitudinais
Uma grande desvantagem do método tradicional de contagem da UFC para quantificar a carga microbiana é a exigência de homogeneizações de órgãos post-mortem, fornecendo apenas um ponto de dados transversais por animal. Por outro lado, a BLI permite o acompanhamento longitudinal não invasivo de animais infectados. Os animais podem ser imagens de 2 a 3 vezes por dia, fornecendo uma visão detalhada da cinética da infecção. Além.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de poliestireno de fundo plano preto de 96 poços	Corning	3925	para imagem in vitro
Aesculap ISIS	Aesculap	GT421	, com tampa GT608
Vaporizador	anestesia Aparelho de Harvard limitado	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacina
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Angiocateter amarelo, use ponta de plástico estéril para instilação
Camundongos C57Bl/6J	Janvier	N/A
Centrífuga 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	para medir OD 600nm
Tamponamento de fosfato de Dulbecco Salino, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanol 70% desnaturado 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Tubo de Poliestireno de Fundo Redondo, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml seringa	Greiner	227285
Hamilton GASTIGHT, trava luer PTFE, 100 µ L	Sigma-Aldrich	26203	para garantir a instilação bacteriana lenta de 50 µ L
Alça de inoculação	Roth	6174.1	suporte: Art. Nº 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Produtos veterinários	N/A	Isoflurano
Espectro IVIS Sistema de imagem in vivo	PerkinElmer	REF 124262	dispositivo de imagem
Solução de canamicina 50 mg/mL	Sigma-Aldrich	CAS 25389-94-0
Software de imagem viva	PerkinElmer	N/A	BLI software de aquisição, versão 4.7.3
Luria Caldo Bertani	Sigma-Aldrich	REF L3022	alternativamente pode ser feito
Luria Caldo Bertani com ágar	Sigma-Aldrich	REF L2897	alternativamente pode ser feito
placa de Petri Sterilin 90mm	ThermoFisher Scientific	101VR20	para encher com ágar LB suplementado com Km
Pyrex Frasco de cultura 250 mL	Sigma-Aldrich	SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean	Unchained Labs	701-2007	para medir OD 600nm
UTI89-lux	N/A	N/A	Generoso presente do Prof.
Seed Vortex	VWR international	444-1372

Aparador de cabelo de