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Artigo de método

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

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DOI:

10.3791/62617

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22 de setembro de 2021

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, Drexel University College of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Thomas Jefferson University, 4Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Neste artigo

Resumo

Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas e radiação em tempo real de células metastáticas cerebrais do câncer de mama em um modelo organotípico de fatia cerebral. Os métodos fornecem um ensaio quantitativo para investigar os efeitos terapêuticos de vários tratamentos em metástases cerebrais do câncer de mama de forma ex vivo dentro da interface de microambiente cerebral.

Resumo

A metástase cerebral é uma consequência séria do câncer de mama para as mulheres, pois esses tumores são difíceis de tratar e estão associados a desfechos clínicos ruins. Modelos pré-clínicos de camundongos do câncer de mama câncer de mama o crescimento metastático cerebral (BCBM) são úteis, mas são caros, e é difícil rastrear células vivas e invasão de células tumorais dentro do parnchyma cerebral. Apresentado aqui é um protocolo para culturas de fatias cerebrais ex vivo de camundongos xenoenxerados contendo sublines clonais intracranianas injetadas no cérebro do câncer de mama. Células etiquetadas de luciferase MDA-MB-231BR foram injetadas intracranianamente no cérebro de camundongos fêmeas Nu/Nu, e após a formação de tumores, os cérebros foram isolados, fatiados e cultivados ex vivo. As fatias tumorais foram imagens para identificar células tumorais expressando luciferase e monitorar sua proliferação e invasão no parênquim cerebral por até 10 dias. Além disso, o protocolo descreve o uso de microscopia de lapso de tempo para visualizar o crescimento e o comportamento invasivo das células tumorais após o tratamento com radiação ionizante ou quimioterapia. A resposta das células tumorais aos tratamentos pode ser visualizada por microscopia de imagem viva, medindo a intensidade da bioluminescência e realizando histologia na fatia cerebral contendo células BCBM. Assim, este modelo de fatia ex vivo pode ser uma plataforma útil para testes rápidos de novos agentes terapêuticos sozinhos ou em combinação com radiação para identificar drogas personalizadas para direcionar o crescimento metastático do cérebro do câncer de mama de uma paciente individual dentro do microambiente cerebral.

Introdução

As metástases cerebrais do câncer de mama (BCBM) se desenvolvem quando as células se espalham do tumor primário de mama para o cérebro. O câncer de mama é a segunda causa mais frequente de metástase cerebral após o câncer de pulmão, com metástases ocorrendo em 10-16% das pacientes1. Infelizmente, as metástases cerebrais permanecem incuráveis, pois >80% dos pacientes morrem dentro de um ano após o diagnóstico de metástase cerebral, e sua qualidade de vida é prejudicada devido a disfunções neurológicas2. É urgente identificar opções de tratamento mais eficazes. Modelos de cultura bidimensional ou tridimensional são os métodos mais utilizados para testar agentes terapêuticos em laboratório. No entanto, eles não imitam o complexo microambiente BCBM, um dos principais impulsionadores do fenótipo e crescimento tumoral. Embora esses modelos sejam úteis, eles não capturam as complexas interações tumorais-estromais, os requisitos metabólicos únicos e a heterogeneidade dos tumores3. Para recapitular mais fielmente as interações tumorais e a heterogeneidade do microambiente, nosso grupo e outros começaram a gerar culturas organotípicas de metástase cerebral "fatia" com células tumorais derivadas do paciente (primárias ou metastáticas) ou linhasde células cancerígenas 4,5,6. Comparado aos sistemas in vitro clássicos, este modelo ex vivo de curto prazo pode fornecer condições mais relevantes para a triagem de novas terapêuticas antes da avaliação pré-clínica em grandes coortes animais.

Modelos ex vivo foram construídos e utilizados com sucesso principalmente para a identificação de tratamentos bem-sucedidos de vários cânceres. Eles requerem poucos dias de avaliação e, além disso, podem ser adaptados para a triagem de medicamentos específico do paciente. Por exemplo, os tecidos ex vivo do câncer de bexiga e próstata têm mostrado uma resposta anti-tumor dependente de dose de docetaxel e gemcitabina7. Carcinoma colorretal ex vivo semelhantes foram desenvolvidos para tela quimioterapia oxaliplatina, Cetuximab e Pembrolizumab8. Esta aplicação tem sido amplamente utilizada no câncer de pâncreas, considerando a interação essencial entre o ambiente estromal e as características genotípicas e fenotípicas do adenocarcinoma ductal 9,10. Além disso, tais modelos organotípicos foram desenvolvidos para exames semelhantes em tumores de cabeça, pescoço, gástrico e mama11,12.

Aqui, um modelo de fatia cerebral ex vivo de células tumorais metastáticas do câncer de mama xenoenxerados em seu microambiente está sendo gerado. Camundongos foram intracranianamente injetados com câncer de mama cérebro tátático cérebro trófico células MDA-MB-231BR13 no lobo parietal córtex cerebral- um local comum de metástase TNBC 14,15 e permitido desenvolver tumores. Fatias cerebrais foram geradas a partir desses animais xenoengrafados e mantidas ex vivo como culturas organotípicas como descrito16,17. Este novo modelo ex vivo permite a análise do crescimento da célula BCBM dentro do parenchyma cerebral e pode ser usado para testar agentes terapêuticos e efeitos de radiação em células tumorais dentro do microambiente cerebral.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado e segue as diretrizes de cuidados com animais pelo Comitê de Uso e Uso Institucional de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel (IACUC). Camundongos fêmeas atímicas nu/nu (6-8 semanas de idade) foram utilizados neste estudo.

1. Injeção intracraniana de células tumorais

  1. Esterilizar todos os equipamentos (pinças, tesouras, tesoura suturando, broca de mão) sob um ciclo seco de uma autoclave por até 45 minutos em bolsas de esterilização, incluindo um indicador de esterilização. Se realizar cirurgias em vários animais, esterilize ferramentas entre animais usando um esterilizador de contas aquecida (até 3x).
  2. Anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com animais dos usuários (por exemplo, isoflurane (4% para indução, manutenção de 1-2%) e administrar analgesia (subcutânea, 0,1mL de 0,1mg/kg buprenorphine SR-LAB) antes do início da cirurgia. Certifique-se de profundidade de anestesia ideal com uma pitada de dedo do dedo do sol.
  3. Coloque os ratos em uma estrutura estereotaxa e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão (Figura 1A). Aplique pomada oftálmica aos olhos.
  4. Esterilize a superfície da cabeça por aplicação repetida e alternada (3x) de cotonetes de iodo e 70% de etanol antes da incisão.
  5. Use um bisturi cirúrgico para fazer uma incisão de 1 cm através da pele em um ângulo ligeiramente diagonal para a linha imaginária que divide o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Limpe qualquer sangue com um cotonete.
  6. Desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção: 2 mm à direita, 1 mm para frente com referência ao bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
  7. Use um bit de broca (0,73 mm) para penetrar o crânio +2ML, +1RC para a bregma e fazer um orifício usando leve pressão e movimento de torção.
  8. Use uma seringa de injeção cerebral para injetar 5 μL de uma solução de 100.000 MDA-MB-231BR (expressando firmemente gfp-luciferase) em 1x PBS estéril inserindo inicialmente a seringa 3,5 mm de profundidade no cérebro.
  9. Deixe a seringa se contentar por 2 minutos. Puxe-o para cima cerca de 1 mm, e depois de 2 min, injete lentamente a primeira metade do volume.
  10. Espere mais 2 minutos antes de injetar o resto, e, em seguida, puxe lentamente a seringa 3 minutos após a injeção final.
    NOTA: A injeção lenta é empírica ao permitir que o volume seja bem absorvido pelo tecido cerebral e não crie vazamentos depois de puxar a seringa, o que pode levar as células cancerígenas a crescer fora do local pretendido.
  11. Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e, em seguida, use suturas de polipropileno para suturar o tecido. Os camundongos se recuperarão dentro de 5 minutos após a remoção da anestesia.
  12. Monitore seu comportamento logo após a cirurgia por cerca de 10 minutos, 3 h depois e no dia seguinte para determinar se tratamento especial, incluindo injeção salina, alimentos macios, etc., são necessários para ajudar na recuperação rápida.
  13. Monitore o crescimento do tumor através de imagens de bioluminescência no sistema de imagem.
    1. Para isso, primeiro, ligue o oxigênio e o isoflurane no sistema de imagem. Deixe que ambos sejam distribuídos para a câmara separada fora da caixa de imagem.
    2. Em seguida, ligue o software, inicialize o instrumento e escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse.
  14. Coloque os ratos na câmara separada com isoflurane e garanta a profundidade ideal da anestesia com uma pitada de dedo do dedo do dedo. Injete os camundongos intraperitonealmente com 200 μL de luciferina de 30 mg/mL.
  15. Transfira o estômago dos ratos para o nariz da câmara de imagem abastecido com oxigênio e isoflurano. Bloqueie a câmara e escolha 2 minutos de exposição para iniciar a imagem.
  16. Use a ferramenta ROI (região de interesse) do software para quantificar o sinal bioluminescente do tumor.
  17. Para analisar o tamanho do tumor, escolha a ferramenta de forma do círculo, encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor. Meça o ROI e informe as leituras totais.
  18. Permitir o crescimento sólido do tumor por 12-14 dias (ou até que a luciferase atinja cerca de 7,0 x 106 unidades) (Figura 1B) antes de gerar fatias cerebrais.
    NOTA: O aumento do número de células a serem injetadas levará a um crescimento mais rápido do tumor; portanto, a geração de fatias cerebrais pode ocorrer antes de 12 dias. Por outro lado, um tumor maior levará a mais fatias de GFP+ se for permitido crescer por 14 dias. Após 14 dias, a saúde dos camundongos começa a se deteriorar rapidamente; portanto, o monitoramento da saúde animal deve ser aumentado para uma vez por dia após o ponto de tempo de 10 dias, e quaisquer camundongos que demonserem sinais de dor e/ou desconforto devem ser usados para gerar as fatias.

2. Gerar fatias cerebrais

NOTA: Realize os passos após o isolamento cerebral em uma coifa de fluxo laminar estéril. Normalmente é possível gerar 35-40 fatias individuais contendo células tumorais (sinal de luciferase) de um rato injetado com células MDA-MB-231BR (Figura 1C).

  1. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em uma autoclave. Coloque o cortador de tecido na capa de fluxo laminar estéril e limpe todas as ferramentas e instrumentos com 70% de etanol.
  2. Após 12-14 dias após a injeção intracraniana de células MDA-MB-231BR, anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com animais dos usuários, conforme descrito em 1.2. Certifique-se de profundidade de anestesia ideal com uma pitada de dedo do dedo do sol.
  3. Remova e coloque seus cérebros rapidamente (dentro de 45 s) em sacarose gelada (4 °C) composta pela seguinte: sacarose de 280 mM, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM de glicose, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-ascorbate, 3 mM de tiorea, 2 mM Na+, 29 mM piruvato; pH=7,3.
  4. Usando um bisturi afiado, estéril ou lâmina de barbear, corte partes em excesso do cérebro que não contenham nenhum tumor de todos os lados, incluindo a parte inferior do cérebro.
  5. Leve a forma do cérebro para um cubo não perfeito para sentar-se no papel filtro molhado DA ACSF em uma tampa de prato de 60 mm para facilitar o corte.
    NOTA: Tecido extra do cérebro onde é improvável que o tumor tenha crescido é removido antes do corte para permitir a geração de fatias de GFP+ e criar uma forma do cérebro que é estável na superfície do instrumento e não será perturbado pelas vibrações causadas pelo corte.
  6. Coloque várias folhas de círculos de papel de filtro pré-molhado (com ACSF) sobre a plataforma de corte e coloque o tecido bloqueado em cima disso.
  7. Coloque o tamanho do corte no instrumento em 2 ou 2,5 unidades na régua fornecida para cortar o tecido em seções de 200-250 μm.
    NOTA: Fatias de até 350 μm ou tão finas quanto 100 μm são viáveis. Para fatias <200 μm, use vibratome ou compresstome.
  8. Use um pincel (sable) para transferir fatias cerebrais em um prato contendo sacarose ACSF e separe as fatias sob um microscópio leve usando agulhas de 27 G.
  9. Identifique as fatias positivas do GFP sob o microscópio fluorescente e transfira-as para um novo prato de 60 mm contendo 2-3 mL de mídia de fatia adulta (meio neurobásico A, 2% suplemento B12, 1% suplemento N2, 1% glutamina, 0,5% glicose, penicilina de 10 U/mL e 100 μg/mL streptomicina) usando uma pipeta quebrada de 1 mL estéril (abertura ampla).
    NOTA: As fatias cerebrais que contêm células tumorais crescendo sobre a superfície cerebral (talvez devido ao vazamento de células de injeção, etc.) são excluídas.
  10. Transfira 3-5 fatias para cada 30 mm, 0,4 μm de cultura de tecido de tamanho de poros inserindo em placas de 6 poços a uma distância que não permite crescer entre si.
  11. Remova o meio de excesso da superfície da inserção usando uma pipeta P1000, adicione 1 mL de meio de fatia de rato adulto por baixo de cada inserção e equilibre a mídia na incubadora antes do corte.
  12. Incubar os tecidos a 37 °C, 5% DE CO2 e 95% umidade por 24 h antes da imagem.

3. IVIS imagem de fatias

NOTA: Realize passos de adição de luciferase e inibidor em uma coifa de fluxo laminar estéril.

  1. Pipeta 5 μL de solução de luciferina de 30 mg/mL no meio abaixo das pastilhas, levantando a pastilha com fórceps e colocando-as de volta no poço após a adição de luciferina à mídia no poço.
  2. Coloque a placa de 6 poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara.
  3. Abra o software e inicialize o instrumento.
  4. Escolha configurações de câmera que permitam visualização e captura de apenas um poço por imagem. Mova o palco para cima (FOV de 5 cm) e coloque o poço que deve ser imagedo diretamente sob a câmera.
  5. Defina o tempo de imagem para o mais adequado dependendo da intensidade da luciferase que o tumor emitirá, que pode variar de 10 s a 5 min. Comece com a configuração para 10 s e, em seguida, aumente se o sinal estiver baixo, mas mantenha-o consistente para todos os pontos e condições de tempo até o final do experimento (Figura 1D).
  6. Use a ferramenta ROI (ferramenta de forma de círculo), encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e informe as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia.
  7. Leve a placa de volta para o capô de fluxo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeiramente a pastilha do poço.
  8. Aspire o meio, substitua-o por 1 mL de meio fresco e coloque a inserção de volta no poço.
  9. Para experimentos onde as fatias estão sendo tratadas com vários compostos, como inibidores, metabólitos, etc., prepare a concentração apropriada do reagente em 1,2 mL de mídia de fatia cerebral em um tubo de 1,5 mL e, em seguida, transfira 1 mL para o poço que contém a fatia.
  10. Repita este processo a cada 48 horas durante a duração do estudo.

4. Imagem ao vivo do crescimento do tumor em fatias cerebrais ex vivo

NOTA: O fornecimento é inserido com meio suficiente (1,5 mL) para durar o comprimento do experimento, pois não é possível adicionar meio adicional durante a imagem ao vivo.

  1. Coloque a placa de 6 poços no suporte automático da placa de microscópio dentro da incubadora (37 °C, 5% DE CO2 e 95% de umidade).
  2. Abra o software, ligue o campo brilhante no primeiro quadrante para ajustar a exposição necessária para visualizar as fatias. Para encontrar a posição (coordenadas "xy") da fatia, navegue com "xy" no segundo quadrante para controlar as coordenadas "xyz" do microscópio.
  3. Selecione placa de 6 poços como o labware usado para este experimento. Selecione o editor do mapa do ROI e registre essa posição selecionando um novo ROI, adicione e salve esse ROI.
  4. Repita os mesmos passos para todas as outras regiões de interesse em outros poços. Depois de ter adicionado todos os ROIs, salve todos os ROIs.
  5. Em Protocolo, selecione Limpar o Tempo-Lapso de Tempo sob Aquisição, seguido de selecionar os canais de interesse (neste caso GFP).
  6. Desligue o foco automático na configuração do foco e ajuste manualmente ao foco apropriado para todas as fatias. Finalmente, ajuste a intensidade de campo brilhante e o tempo de excitação e exposição do canal fluorescente ao nível apropriado.
  7. Defina o protocolo para adquirir imagens a cada 15 minutos por 48 h.
  8. Salve e execute o protocolo. No final do experimento, o arquivo salvo conterá as imagens brightfield e GFP capturadas para cada ROI.
  9. Para combinar as imagens em um vídeo, renomeie todas as imagens de interesse com o mesmo nome seguidas de um número binário para organizá-las na ordem em que foram capturadas (por exemplo, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
  10. Abra o ImageJ e importe as imagens clicando em Arquivo > Importar > Sequência de Imagem. Selecione os nomes dos arquivos que aparecem em uma lista e escreva o conteúdo do nome dos arquivos na caixa 'Fatos de nome do arquivo ' que aparecerá para identificar os arquivos selecionados para o vídeo.
  11. Salve as imagens combinadas em Arquivo > Salve como > AVI.

5. Ensaio MTS e imunohistoquímica de tecido cerebral ex vivo

  1. ENSAIO MTS
    1. Extite as fatias cortando a membrana de cultura tecidual por baixo de cada fatia ao longo das bordas do tecido e transfira o tecido, ainda preso à membrana, em uma placa de 96 poços.
    2. Adicione o reagente MTS misturado em uma proporção de 1:5 com mídia de cultura e triton de 0,01% (1x) para permitir a penetração da solução no tecido, em um volume total de 120 μL em cada poço.
    3. Use 4% de paraformaldeído (PFA) como agente para tornar as fatias cerebrais inviáveis e, portanto, um controle positivo para este experimento. Mergulhe a fatia de interesse cerebral em 4% de PFA por 1 h em RT (temperatura ambiente) ou durante a noite a 4 °C antes de prosseguir com o ensaio MTS.
    4. Deixe o reagente MTS reagir sobre as fatias por 4h, retire as fatias dos poços e meça a absorvância em 490 nm para todas as condições, incluindo um poço vazio sem fatia como referência.
    5. Relatar as leituras em função da área de fatia de tecido, medida com uma régua de pinça digital.
  2. Preparação imunohistoquímica
    1. Mergulhe as fatias cerebrais presas à superfície de inserção da membrana em 10% de formalina durante a noite a 4 °C.
    2. Realizar incorporação, processamento, bloqueio e gerar lâminas não manchadas do tecido. Use o protocolo padrão de coloração imunohistoquímica para coloração para H&E, Ki-67, gama-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI

6. Irradiação de tumor em fatias cerebrais ex vivo

  1. Irradie o tumor com 6 Giros (raios-x de 310 kVp).
    NOTA: As unidades inseridas para obter a dose total de 6 Gy são 3522 unidades após considerar unidades R (medidas com eletrometro Victoreen) e correções para o dedal, densidade do ar e cGy/R como descrito anteriormente18. O tempo de exposição é de 130,9.
  2. Use 0,25 mm +1 mm Al de filtragem adicionada, 50 cm de SSD, 125 cGy por min.
  3. Realize a dosimetria por uma câmara de ionização no feixe calibrada contra um padrão primário.
  4. Faça correções diariamente para umidade, temperatura e pressão barométrica.

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Resultados

As células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase foram intracranianamente injetadas no hemisfério direito de camundongos Nu/Nu de 4-6 semanas de idade, conforme explicado acima (Figura 1A) e foram autorizadas a crescer por 12-14 dias, período durante o qual o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência (Figura 1B). Injetamos 100.000 células cancerígenas intracranianamente como relatado por outros grupos19, mas é possível inj...

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Discussão

Este estudo estabelece um novo método de cultura cerebral ex vivo para tumores cerebrais de xenoenxerto explantado. Mostramos que as células BCBM MDA-MB-231BR intracranianamente injetadas no cérebro de camundongos podem sobreviver e crescer em fatias cerebrais ex vivo . O estudo também testou células intracranianamente injetadas de glioblastoma U87MG (GBM) e também descobriu que essas células cancerígenas sobrevivem e crescem em fatias cerebrais (dados não mostrados). Acreditamos que esse modelo pode se...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos financeiros para declarar.

Agradecimentos

Queremos agradecer julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Subvenção universal de pesquisa da Pensilvânia (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA2227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1 mL, ponta deslizanteBD309659
30 Agulhas G1/2 BD305106
placas de 6 poçosGenessee25-105
Microscópio automatizado e software LUMAVIEWEtalumaLS720
B27 (GEM21)Gemini Bio-Products400-160
Béquer 50 mLFisher10-210-685
Pincel de zibelina sem corte, Tamanho #5/0Cera Óssea Médica Sciences66100-50
Seringa de Injeção
CaCl2Fisher ScientificBP510-250
DAPIInvitrogenP36935
D-Luciferina Sal de PotássioPerkin Elmer122799
Lâmina de barbear de dupla bordaVWR55411-060(95-0043)
Papel de filtro , círculos quantitativos, 4,25 cmFisher09-805a (1001-042)
Pincel de zibelina fina #2/0Microscopia Eletrônica Sciences66100-20
FórcepsFine Science Tools11251-20
Gamma-H2AX anticorpoMillipore05-636
GFAP anticorpoThermo Fisher13-0300
GFP anticorpoSanta CruzSC-9996
GlicoseSigma AldrichG8270
Glutamina (200 mM)Corning cellgrow25-005-CL
H& E e KI-67Jefferson Core Facility Patologia coloração Conjunto de
brocas manuais com micro mini brocas helicoidaisAmazonYCQ2851920086082DJ
HEPES, ácido livreFisher ScientificBP299-1
Apenas para camundongos Quadro estereotáxicoHarvard Apparatus (Holliston, MA, EUA).72-6049, 72-6044
KClFisher ScientificS271-10
Tesoura cirúrgica grandeFerramentas de ciência fina14001-18
Células MDA-MB-231BRGentilmente cedido pela Dra. Patricia SteegRef 14
MgCl2· 6H2OFisher ScientificM33-500
Dispositivo de imagem de camundongosPerkin ElmerSistema
Software de imagem de camundongosCaliper Life Sciences (Waltham, MA, EUA).Leitor de microplacas de
de faísca
Reagente InvitrogenP36935
MTSPromega CellTiter 96 Solução aquosa única(Cat: G3582)
Suplemento N2Life Technologies17502-048
Meio neurobasalLife Technologies21103049
Camundongos atímicos Nu / NuCharles Rivers Labs (Wilmington, MA, EUA)
ParaformaldeídoAffymetrix19943
Caneta / StrepLife Technologies145140-122
Sutura de polipropilenoMedex fornecerETH-8556H
Bastões de cotonete de iodopovidonaDME Fornecimento EUACat: 689286X
Lâmina de bisturi #11 (pk de 100)Fine Science Tools10011-00
Cabo de bisturi #3Fine Science Tools10003-12
Sodium PyruvateSigma AldrichS8636
Espátula/sondaFine Science Tools10090-13
SS Lâminas de barbear de dupla borda não revestidas (American safety razor co (95-0043))VWR55411-060
SucaroseAmresco57-50-1
Bisturi CirúrgicoExelint InternationalD29702
Tissue ChopperBrinkman(Tipo McIlwain)
Inserções de cultura de tecidosMilliporePICMORG50 ou PICM03050
Precisão 250 kVp
Cerebral DYNJBW25 ModoMed Hamilton Company 80430 Cleaved caspase 3 Antibody Cell Signaling 14220S IVIS 200software de imagem viva Solução de montagem de teca Máquina de raios-X

Referências

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