O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

Summary

Este artigo de método detalha os principais passos na medição do vazamento de H⁺ através da membrana mitocondrial interna com a técnica de patch-clamp, uma nova abordagem para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias.

Abstract

A termogênese mitocondrial (também conhecida como desacoplamento mitocondrial) é uma das metas mais promissoras para aumentar o gasto energético para combater a síndrome metabólica. Tecidos termogênicos como gorduras marrons e bege desenvolvem mitocôndrias altamente especializadas para produção de calor. Mitocôndrias de outros tecidos, que produzem principalmente ATP, também convertem até 25% da produção total de energia mitocondrial em calor e podem, portanto, ter um impacto considerável na fisiologia de todo o corpo. A termogênese mitocondrial não é apenas essencial para manter a temperatura corporal, mas também previne a obesidade induzida pela dieta e reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para proteger as células contra danos oxidativos. Uma vez que a termogênese mitocondrial é um dos principais reguladores do metabolismo celular, uma compreensão mecanicista desse processo fundamental ajudará no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial. É importante ressaltar que os mecanismos moleculares precisos que controlam a ativação aguda da termogênese nas mitocôndrias são mal definidos. Essa falta de informação deve-se, em grande parte, à escassez de métodos para a medição direta de proteínas desacoplamento. O desenvolvimento recente da metodologia de patch-clamp aplicada às mitocôndrias possibilitou, pela primeira vez, o estudo direto do fenômeno na origem da termogênese mitocondrial, o vazamento de H⁺ através do IMM, e a primeira caracterização biofísica dos transportadores mitocondriais responsáveis por ele, a proteína desacoplamento 1 (UCP1), específica das gorduras marrom e bege, e o transporte ADP/ATP (AAC) para todos os outros tecidos. Esta abordagem única fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam o vazamento de H⁺ e a termogênese mitocondrial e como eles podem ser direcionados para combater a síndrome metabólica. Este artigo descreve a metodologia de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias para estudar sua capacidade termogênica medindo diretamente as correntes H⁺ através do IMM.

Introduction

Mitocôndrias são famosas por serem a potência da célula. Na verdade, eles são a principal fonte de energia química, ATP. O que é menos conhecido é que mitocôndrias também geram calor. De fato, cada mitocôndria constantemente gera os dois tipos de energias (ATP e calor) e um equilíbrio fino entre as duas formas de energia define homeostase de células metabólicas (Figura 1). Como as mitocôndrias distribuem energia entre ATP e calor é certamente a questão mais fundamental no campo da bioenergetics, embora ainda seja amplamente desconhecida. Sabemos que o aumento da produção de calor mitocondrial (chamada termogênese mitocondrial), e consequentemente reduzir a produção de ATP aumenta o gasto energético e esta é uma das melhores formas de combater a síndrome metabólica¹.

A termogênese mitocondrial origina-se do vazamento de H⁺ através da membrana mitocondrial interna (IMM), levando ao desacoplamento da oxidação do substrato e da síntese de ATP com consequente produção de calor, daí o nome “desacoplamento mitocondrial”¹ (Figura 1). Este vazamento H⁺ depende de transportadores mitocondriais chamados proteínas de desacoplamento (UCPs). A UCP1 foi a primeira UCP identificada. É expressa apenas em tecidos termogênicos, gordura marrom e gordura bege em que mitocôndrias são especializadas para produção de calor ^2,3,4. A identidade da UCP em tecidos não adiposos, como músculo esquelético, coração e fígado, tem permanecido controversa. Mitocôndrias nesses tecidos podem ter cerca de 25% da energia mitocondrial total convertida em calor, o que pode impactar significativamente a fisiologia de todo o corpo¹. Além de manter a temperatura corporal do núcleo, a termogênese mitocondrial também previne a obesidade induzida pela dieta, reduzindo as calorias. Além disso, reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por mitocôndrias para proteger as células de danos oxidativos¹. Assim, a termogênese mitocondrial está envolvida no envelhecimento normal, distúrbios degenerativos relacionados à idade e outras condições que envolvem estresse oxidativo, como isquemia-reperfusão. Portanto, a termogênese mitocondrial é um poderoso regulador do metabolismo celular, e uma compreensão mecanicista desse processo fundamental promoverá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial.

A respiração mitocondrial foi a primeira técnica a revelar o papel crucial da termogênese mitocondrial no metabolismo celular e ainda é a mais popular na comunidade¹. Esta técnica é baseada na medição do consumo de oxigênio pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) que aumenta quando o vazamento mitocondrial H⁺ é ativado. Esta técnica, embora instrumental, não pode estudar diretamente o vazamento mitocondrial H⁺ através do IMM¹, dificultando assim a identificação e caracterização precisas das proteínas responsáveis por isso, particularmente em tecidos não adiposos em que a produção de calor é secundária em comparação com a produção de ATP. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias, forneceu o primeiro estudo direto do vazamento de H⁺ em todo o IMM em vários tecidos ^5,6,7.

O grampo mitocondrial de toda a IMM foi estabelecido pela primeira vez de forma reprodutível por Kirichok et ^al.8. Eles descreveram a primeira medição direta das correntes mitocondriais de cálcio (MCU) em 2004 usando mitoplastos das linhas celulares COS-7⁸. Mais tarde, o laboratório de Kirichok mostrou correntes de cálcio de IMMs de tecidos de camundongo⁹ e Drosophila ⁹. Outros laboratórios agora usam essa técnica rotineiramente para estudar as propriedades biofísicas da MCU 10,11,12,13,14. A análise completa do grampo de remendo do IMM da condutância de potássio e cloreto também é possível e foi mencionada em vários artigos, mas ainda não foi o tema principal de uma publicação ^6,7,9. A primeira medição das correntes H⁺ em todo o IMM foi relatada em 2012 a partir de mitocôndrias de gordura^{marrom-rato 6}, e de mitocôndrias de gordura bege do rato em 2017⁷. Esta corrente é devido à proteína de desacoplamento específica dos tecidos termogênicos, UCP1 ^6,7. Trabalho recente publicado em 2019 caracterizou a AAC como a principal proteína responsável pelo vazamento mitocondrial H⁺ em tecidos não adiposos, como o coração e o músculo esquelético⁵.

Esta abordagem única agora permite a análise funcional direta de alta resolução dos canais mitocondriais e transportadores responsáveis pela termogênese mitocondrial. Para facilitar a expansão do método e complementar outros estudos como a respiração mitocondrial, um protocolo detalhado é descrito abaixo para medir as correntes H⁺ transportadas pela UCP1 e AAC. Três passos importantes são descritos: 1) isolamento mitocondrial da gordura marrom do rato para analisar a corrente H⁺ dependente de UCP1 e o isolamento mitocondrial do coração para analisar a corrente H⁺ dependente de AAC, 2) preparação de mitoplastos com uma prensa francesa para ruptura mecânica da membrana mitocondrial externa (OMM), 3) gravações de grampos de remendo de UCP1 e correntes H⁺ dependentes de AAC em todo o IMM.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais animais que foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Los Angeles (IACUC). NOTA: O procedimento de isolamento mitocondrial é baseado na centrifugação diferencial e varia ligeiramente de tecido para tecido. Por exemplo, uma vez que o tecido adiposo marrom é extremamente rico em lipídios, requer um passo adicio…

Representative Results

O desenvolvimento da metodologia de grampo de remendo aplicado às mitocôndrias proporcionou o primeiro estudo direto do vazamento de H+ através do IMM e dos transportadores mitocondriais, UCP1 e AAC, responsáveis por isso. A análise eletrofisiológica dos vazamentos H+ dependentes de UCP1 e AAC pode fornecer um primeiro olhar da capacidade termogênica das mitocôndrias. A seção de resultados descreve os procedimentos padrão para medir o vazamento de H+ via UCP1 e AAC. <p clas…

Discussion

Este artigo de método visa apresentar a técnica de grampo de remendo recentemente aplicada às mitocôndrias, uma nova abordagem para estudar diretamente o vazamento de H⁺ através do IMM responsável pela termogênese mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica não se limita aos tecidos e também pode ser usada para analisar vazamento de H⁺ e outras conduções do IMM em dife…

Materials

0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253