방법 논문

미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

DOI:

10.3791/62618

⸱

2021년 5월 3일

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

이 논문에서

요약

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이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.

초록

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미토콘드리아 열발생(미토콘드리아 비결합이라고도 함)은 대사 증후군과 싸우기 위해 에너지 소비를 증가시키는 가장 유망한 목표 중 하나입니다. 갈색 및 베이지 색 지방과 같은 열 생성 조직은 열 생산을 위해 고도로 전문화 된 미토콘드리아를 개발합니다. 주로 ATP를 생산하는 다른 조직의 미토콘드리아도 전체 미토콘드리아 에너지 생산의 최대 25 %를 열로 변환하므로 전신의 생리학에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아 열발생은 체온 유지에 필수적일 뿐만 아니라 식이요법으로 인한 비만을 예방하고 반응성 산소종(ROS)의 생성을 감소시켜 산화 손상으로부터 세포를 보호합니다. 미토콘드리아 열발생은 세포 대사의 핵심 조절자이기 때문에, 이 근본적인 과정에 대한 기계론적 이해는 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 많은 병리와 싸우기 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것이다. 중요하게도, 미토콘드리아에서 열발생의 급성 활성화를 조절하는 정확한 분자 메커니즘은 제대로 정의되지 않았다. 이러한 정보의 부족은 주로 언커플링 단백질의 직접적인 측정을 위한 방법의 부족 때문이다. 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 최근 개발은 처음으로 미토콘드리아 열발생의 기원에서의 현상에 대한 직접적인 연구, IMM을 통한 H+ 누출, 그리고 이를 담당하는 미토콘드리아 운반체의 첫 번째 생물물리학적 특성화, 갈색 및 베이지 색 지방의 특이적인 단백질 1(UCP1), 그리고 다른 모든 조직에 대한 ADP/ATP 수송체(AAC)를 가능하게 했다. 이 독특한 접근법은 H + 누출 및 미토콘드리아 열 발생을 제어하는 메커니즘과 대사 증후군 퇴치를 목표로하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 논문은 IMM을 통해 H+ 전류를 직접 측정하여 열원성 능력을 연구하기 위해 미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론을 설명합니다.

서론

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미토콘드리아는 세포의 강국으로 유명합니다. 실제로, 그들은 화학 에너지의 주요 원천 인 ATP입니다. 덜 알려진 것은 미토콘드리아도 열을 발생시킨다는 것입니다. 사실, 모든 미토콘드리온은 두 가지 유형의 에너지 (ATP와 열)를 지속적으로 생성하며 두 에너지 형태 사이의 미세한 균형은 대사 세포 항상성을 정의합니다 (그림 1). 미토콘드리아가 ATP와 열 사이에 에너지를 분배하는 방법은 아직 크게 알려지지 않았지만 생물 에너지 분야에서 가장 근본적인 질문입니다. 우리는 미토콘드리아 열 생산 (미토콘드리아 열 발생이라고 함)을 증가시키고 결과적으로 ATP 생산을 줄이면 에너지 소비가 증가한다는 것을 알고 있으며 이는 대사 증후군1과 싸우는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.

미토콘드리아 열발생은 미토콘드리아 내부 막(IMM)을 가로지르는 H+ 누출로 인해 기질 산화와 ATP 합성의 결합이 해제되어 결과적으로 열이 생성되므로 "미토콘드리아 비결합"1이라는 이름이 붙여집니다(그림 1). 이 H+ 누출은 언커플링 단백질(UC....

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프로토콜

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수행 된 모든 동물 실험 절차는 국립 보건원 지침을 준수하며 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

참고: 미토콘드리아 분리 절차는 차동 원심분리를 기반으로 하며 조직마다 약간 다릅니다. 예를 들어, 갈색 지방 조직은 지질이 매우 풍부하기 때문에 미토콘드리아를 수확하기 전에 지질 단계에서 세포 파편과 소기관을 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 혼란을 피하기 위해 두 가지 미토콘드리아 분리 절차 (하나는 갈색 지방에서, 다른 하나는 심장에서)가 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 마우스 견갑골 갈색 지방으로부터의 미토콘드리아 분리 (Bertholet et al. 2020에서 수정)15

  1. 미국 수의학 협회 패널 및 IACUC 위원회의 권고에 따라CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 C57BL/6 수컷 마우스를 안락사시킨다.
  2. 배를 탁자를 향하게 한 마우스를 위치시킨 후, 알코올을 분무하여 모발을 닦고 적셨다 (Mann et al., 2014에서 수정)16.
  3. 핀셋으로 피부를 ....

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결과

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미토콘드리아에 적용된 패치 클램프 방법론의 개발은 IMM과 이를 담당하는 미토콘드리아 수송체인 UCP1 및 AAC를 통한 H+ 누출에 대한 최초의 직접적인 연구를 제공했다. UCP1- 및 AAC 의존성 H+ 누출의 전기생리학적 분석은 미토콘드리아의 열원성 용량에 대한 첫눈에 제공할 수 있다. 결과 섹션에서는 UCP1 및 AAC를 통해 H+ 누출을 측정하는 표준 절차에 대해 설명합니다.

UCP1 종속 H+ 전류 측정(그림 4)6,7,15
전압 램프 프로토콜의 적용은 UCP의 필수 활성화제인 외인성 지방산(FA)의 첨가 없.......

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토론

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이 방법 논문은 미토콘드리아에 최근에 적용된 패치 클램프 기술을 제시하는 것을 목표로하며, 미토콘드리아 열발생 5,6,7,15를 담당하는 IMM을 통해 H + 누출을 직접 연구하는 새로운 접근 방식입니다. 이 기술은 조직에 한정되지 않으며, HAP1, COS7, C2C12 및 MEF 세포와 같은 상이한 표준 인간 및 세포 모델에서 IMM의 H+ 누출 및 다른 전도도를 분석하는데 사용될 수 있다. 그러나, 각각의 미토콘드리아 단리에는 각 세포 또는 조직 유형에 특정한 약간의 재조정이 필요하다.

갈색 지방 5,6 및 심장

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공개 사항

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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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나는 Yuriy Kirichok 박사에게 내가 그의 실험실에서 참여했던 위대한 과학과 도움이되는 토론을 위해 Kirichok 실험실의 구성원들에게 감사한다. 또한 AAC1 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Douglas C. Wallace 박사님께도 감사드립니다. 기금: A.M.B는 American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1% 젤라틴MilliporeES-006-B
60X 침수 대물렌즈, 개구수 1.20OlympusUPLSAPO60XW
Axopatch 200B 증폭기분자 장치
붕규산 유리 모세관Sutter InstrumentsBF150-86-10
Digidata 1550B 디지타이저분자 장치
패러데이 케이지수제
프렌치 프레스글렌 밀스5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 실험실 오버 헤드 교반기
반전 현미경올림푸스IX71 또는 IX73
마이크로 포지(Narishige)MF-830
Micromanupulator MPC-385셔터 악기FG-MPC325
한천 다리 용 미세 전극 홀더World Precision InstrumentsMEH3F4515
Micropipette Puller(Sutter Instruments)P97
미니 셀Glen Mills5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPMCole ParmerEW-50705-50
객관적 인 100X 배율Nikon  렌즈MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10분자 장치
관류 챔버워너 인스트루먼트RC-24E
Potter-Elvehjem 균질화 장치 10 mlWheaton358039
냉장 원심분리기 SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
작은 원형 유리 커버슬립: 지름 5mm, 두께 0.1mm워너 인스트루먼트640700
진동 차단 테이블NewportVIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acidSigma AldrichG1951
D-mannitol  시그마 알드리치M4125
EGTA  시그마 알드리치3777
HEPES  시그마 알드리치H7523
KCl  시그마 알드리치60128
MgCl2  시그마 알드리치63068
자당  시그마 알드리치S7903
TMA  시그마 알드리치331635
TrisBase  시그마 알드리치T1503
TrisCl  시그마 알드리치T3253
프렌치 프레스 용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29

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재인쇄 및 허가

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태그

1ADP ATP

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