Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Resumo

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.

Resumo

O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.

Introdução

O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos¹, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose². As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosomma^{precoce 3}. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação⁴. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem rápida, as proteínas deixam os endossos precoces e retornam diretamente à membrana plasmática. Por outro lado, na reciclagem lenta, as proteínas são primeiramente classificadas ao compartimento de reciclagem endóctico e depois transportadas de volta para a membrana plasmática. Várias proteínas de carga, por exemplo, clathrin, complexo retromer, complexo de recuperador e proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich, e complexo SCAR Homologue (WASH), participam desses processos de reciclagem de^{membranas 4,5,6,7,8,9}. O equilíbrio do evento de endocitose e reciclagem é crucial para a sobrevivência celular e contribui para diversos eventos celulares¹⁰, por exemplo, adesão celular, migração celular, polaridade celular e transdução de sinais.

ARF6, um pequeno GTPase, é um regulador relatado de tráfico endocítico^7,11,12. De interesse, diversos grupos de pesquisa ilustraram a importância da ARF6 na reciclagem endocítica^{13,14,15,16,17}. O estudo tem como objetivo investigar a relação entre o crescimento de neurite mediado pela ARF6 e a reciclagem endócítica. O relatório anterior sugere que a ativação do ARF6 é upstream para a atividade Rac1 através da atuação no complexo¹⁸(DOCK180) do ELMO1 . No entanto, ainda não está claro como o ARF6 aciona a sinalização rac1 mediada do ELMO1-DOCK180. A ultracentrifugação de gradiente de densidade foi empregada para investigar o papel da reciclagem endocítica mediada por ARF6 nesse processo. Com isso, a fração contendo endosome de reciclagem foi obtida a partir de lises celulares¹⁹. A fração foi submetida à mancha ocidental para análise de teor de proteínas. Os resultados do imunoblot revelaram que sob a presença de FE65, uma proteína adaptadora enriquecida pelo cérebro, a ARF6 ativa aumentou substancialmente o nível de ELMO1 na fração contendo endosome de reciclagem. O protocolo a seguir inclui os procedimentos para (1) transfecção de células mamíferas; (2) elaboração das amostras e colunas gradientes de densidade; e (3) obtenção da fração contendo endosome de reciclagem.

Protocolo

1. Cultura e transfecção de células mamíferas

1. Placa 2 x 10⁶ células em um prato de cultura de 100 mm. Use quatro pratos para cada transfecção.
   NOTA: O número de células necessárias pode variar para diferentes linhas celulares. A otimização pode ser necessária antes de prosseguir para a etapa de isolamento.
2. No dia seguinte, transfete as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante.

2. Colheita celular

1. Descarte o meio de cultura 48 h pós-transfecção.
2. Lave as células com PBS gelado (fosfatos de sódio de 10 mM, cloreto de potássio de 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM) duas vezes.
3. Adicione 1 mL de PBS gelado⁺ (PBS complementado com coquetel inibidor de protease 0,5x e coquetel inibidor de fosfatase de 0,5x) a cada prato.
4. Colete as células com um raspador de células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL.
5. Pelota as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço a 400 x g por 5 min.
6. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular suavemente em 5 mL de tampão de homogeneização (HB; 250 mM de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4, 1 mM EDTA complementado com 0,03 mM cicloheximida, coquetel inibidor de protefase 1xase e 1xxphosphatase inibidor).
7. Colete as células por centrifugação a 1.300 x g por 10 min.
8. Resuspense a pelota de célula em 1 mL de HB.
9. Homogeneize as células com um homogeneizador do Dounce para 15-20 derrames.
   NOTA: Outros métodos de homogeneização, por exemplo, passando a amostra através de uma seringa, poderiam ser utilizados. A eficiência de homogeneização poderia ser revelada observando o homogeneizado sob um microscópio de contraste de fase.
10. Transfira o homogeneizar para um tubo de centrifugação de 2 mL.
    NOTA: Colher 50 μL de homogeneizar com 12,5 μL de tampão de amostra de 5x e rotulá-lo como total lysate.
11. Adicione 0,7 mL de HB ao homogeneizar.
12. Gire o homogenate diluído a 2.000 x g por 10 min a 4 °C.
    NOTA: A pelota contém núcleos e células ininterruptas.
13. Colete 1,5 mL do supernaspe e repita o passo 2.12 uma vez.
14. Colete 1,4 mL do supernante e rotule-o como supernante pós-nuclear (PNS).

3. Preparação da coluna de gradiente de densidade

1. Transfira 1,2 mL de PNS para um tubo ultracentrífuga.
2. Adicione 1 mL de solução de sacarose de 62% (2,351 M de sacarose, 3 mM de imidazol no pH 7.4) à amostra e misture bem por tubulação suave.
   NOTA: A solução resultante é uma solução de sacarose de 40,6%.
3. Adicione 3,3 mL de solução de sacarose de 35% (1,177 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da amostra.
4. Adicione 2,2 mL de solução de sacarose de 25% (0,806 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da solução de 35% de sacarose.
   NOTA: O índice refrativo das soluções de sacarose de 62%, 40,6%, 35% e 25% à temperatura ambiente são 1,44, 1,40, 1,39 e 1,37, respectivamente. Os índices refrativos das soluções de sacarose poderiam ser verificados com um refratômetro para garantir a precisão e consistência do experimento.
5. Encha o tubo de ultracentrifugação com HB.
   NOTA: Armazene temporariamente a coluna de gradiente de densidade preparada a 4 °C.

4. Fracionamento e recuperação da fração contendo endosome de reciclagem

1. Centrifugar a coluna a 210.000 x g por 3 h a 4 °C.
2. Colete 12 frações (1 mL cada) cuidadosamente, começando a partir da parte superior do gradiente.
   NOTA: Os endossomos de reciclagem devem ser encontrados na interface entre 35% e 25% de soluções de sacarose. As frações coletadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C.
3. Diluir todas as frações com 1 mL de tampão de diluição (3 mM imidazol em pH 7,4, 1 mM EDTA).
4. Centrifugar a amostra diluída a 100.000 x g por 1 h a 4 °C.
5. Aspire o supernasal e adicione 50 μL de tampão de amostra de 1x para colher as frações.
6. Analise o conteúdo da proteína nas frações por manchas ocidentais.

Resultados

Após fracionar as células HEK293 não traduzidas por ultracentrifugação gradiente de densidade, 12 frações foram coletadas a partir do topo do gradiente. As frações colhidas foram diluídas com o tampão de diluição em uma razão de 1:1 e submetidas a uma segunda rodada de centrifugação. As amostras foram então submetidas a manchas ocidentais para análise de seu conteúdo proteico. Como mostrado na Figura 1,o marcador de reciclagem endosome Rab11 é detectado na fração 7²⁰....

Discussão

O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela última^{publicação 22}, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacarose, recomenda-s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL, tubo de polipropileno de parede espessa de topo aberto, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
placa de cultura de tecidos de 100 mm	SPL	20100
13,2 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto certificado gratuitamente, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x tampão de amostra	GenScript	MB01015
cOmplete, coquetel de inibidor de protease sem EDTA	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Tecnologia	de sinalização celular	4850S	Anticorpo monoclonal de coelho para detecção de COX IV.
Cicloheximida	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com baixa glicose	HyClone	SH30021.01
anticorpo ELMO1 (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 anticorpo (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Anticorpo policlonal de cabra para detecção de FE65.
Soro bovino fetal, grau de pesquisa	HyClone	SV30160.03
GAPDH Anticorpo monoclonal (6C5)	Ambion	AM4300	Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de GAPDH.
Software ImageLab	Bio-Rad		Medição da intensidade da banda
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção	Invitrogen	11668019
Monoclonal Anti-β-COP anticorpo	Sigma	G6160	Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de β-COP.
Tecnologia de sinalização celular	mAb de camundongo Myc-tag (9B11)	2276S	Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de proteínas marcadas com myc.
OmniPur EDTA, sal dissódico, dihidrato	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Mídia de soro reduzida	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche
Anticorpo policlonal específico RAB11A	Proteintech	20229-1-AP	Anticorpo policlonal de coelho para detecção de Rab11.
Sacarose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti Rotor de Balde Oscilante	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 Rotor de ângulo fixo	Beckman Coulter	362046
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300062