Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.
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Artigo de método
Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para entender completamente a fisiologia celular dos neurônios e da glia no comportamento dos animais, é necessário visualizar sua morfologia e registrar sua atividade in vivo no comportamento de camundongos. Este artigo descreve um método para a implantação de uma janela craniana crônica para permitir a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. Em combinação com estratégias genéticas e injeções virais, é possível rotular células específicas e regiões de interesse com marcadores estruturais ou fisiológicos. Este protocolo demonstra como combinar injeções virais para rotular neurônios nas proximidades de astrócitos que expressam GCaMP6 no córtex para imagens simultâneas de ambas as células através de uma janela craniana. Imagens multifoton das mesmas células podem ser realizadas por dias, semanas ou meses acordados, comportando animais. Essa abordagem fornece aos pesquisadores um método para visualizar a dinâmica celular em tempo real e pode ser aplicada para responder a uma série de perguntas em neurociência.
Introdução
A capacidade de realizar microscopia de fluorescência in vivo multifotônio no córtex dos camundongos é primordial para o estudo da sinalização celular e estrutura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, patologia da doença 10,11, e desenvolvimento celular12,13 . Com....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo IACUC no Centro Médico da Universidade de Nebraska.
1. Antes da cirurgia
- Prepare pipetas para injeções virais. Puxe capilares de vidro borossilicato usando um puxador de pipeta e coloque a pipeta em um ângulo de 20°. Esterilize as pipetas durante a noite.
- Prepare peças frescas de espuma de gel estéril cortando-as em pequenos quadrados. Submergir a espuma de gel em um tubo microfuge estéril contendo 0,5 mL de soro fisiológico. Mergulhe a espuma de gel em soro fisiológico por pelo menos 30 minutos antes de usar.
- Prepare p....
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Resultados
A qualidade da janela craniana pode ser avaliada pelo quão nítidas as estruturas neuronais aparecem. Em uma boa janela, espinhos dendráticos são claramente visíveis (Figura 1). Com os dados estruturais e posicionais armazenados, o mesmo animal pode ser imageado repetidamente por dias, semanas ou meses para examinar as mesmas células (Figura 1). As imagens na Figura 1 foram obtidas da região do primeiro quarto do córtex motor primári.......
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Discussão
Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação de janelas cranianas crônicas para imagens in vivo de astrócitos cortical e neurônios em ratos acordados e com cabeça em uma gaiola doméstica levantada pelo ar. Exemplos específicos foram fornecidos da aplicação da janela craniana para astrócitos de imagem que expressam GECIs e estruturas sinápticas neuronais. Com o uso de microscopia multifotítica, a dinâmica de sinalização de cálcio astrócito e a dinâmica sináptica estrutural podem ser registradas repetidament.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 15o Lâmina pontiaguda | Surgistar | 6500 | Ferramentas de cirurgia |
| 19 G Agulhas | BD | 305186 | Fornecimento de cirurgia |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Vetor viral |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Vetor viral |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Almofadas |
| Fisher Scientific | Covidien 5750 | Fornecimento de cirurgia | |
| Beveler | Narishige | ||
| Equipamento Vidro de borosilicato | World Precision Instruments | TW100F-4 | Fornecimento |
| de cirurgia Brocas de carboneto | SS White Dental | 14717 | Ferramentas de cirurgia |
| Carprofeno (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institucional, LLC.Drug | ||
| Ar Comprimido | Fisher Scientific | 23-022-523 | Aplicadores de Ponta de Algodão para Cirurgia |
| Puritan | 836-WC NO BINDER | Vidro de Cobertura para Suprimentos de Cirurgia | |
| , espessura nº 1, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Equipamento |
| Cirurgia Dental para Furadeira | Asséptica | ||
| Dexametasona, 4 mg/mL | Mylan Institucional, LLC. | ||
| Microscópio de Dissecção de Drogas | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (líquido de cimento dentário) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagente |
| Duralay em Pó (pó de cimento dentário) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagente |
| Enrofloxacina, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Pomada para os Olhos | Dechra | 17033-211-38 | Fornecimento de |
| Cirurgia Fiber Lite Iluminador de Alta Intensidade Pinça | de Equipamento da Dolan-Jenner Industries | ||
| (Grande) | World Precision Instruments | 14099 | |
| Ferramentas de Cirurgia Fórceps ( Pequeno) | World Precision Instruments | 501764 | Ferramentas de Cirurgia |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Linha de camundongos |
| Germinador | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Linha de camundongos |
| Placa de cabeça | Neurotar | Modelo 1, Modelo 3 | Fornecimento de Cirurgia |
| Fórceps Hemostático | World Precision Instruments | 501705 | Suporte de ferramentas de cirurgia |
| para lâmina de 15o Pointed | World Precision Instruments | 501247 | Suporte de ferramentas de cirurgia |
| para lâminas de bisturi | World Precision Instruments | 500236 | Ferramentas |
| Almofadas de preparação de iodo | Avantor | 15648-926 | Fornecimento de cirurgia |
| Isoflurano | Fornecimento de cirurgia | piramal | |
| Sistema de mesa de isoflurano com caixa de indução | Equipamento de aparelho | ||
| Vaporizador de isoflurano | Equipamento | SurgiVet | |
| Cola Krazy | Office Depot | KG517 | Reagente |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | adesivo instantâneo de cura rápida |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | gel adesivo de cianoacrilato |
| Extrator de micropipeta | Sutter Instruments | Equipamento | |
| multifotônico | |||
| Nitrogênio | Matheson | NI M200 | Gás |
| Oxigênio Matheson | OX Sistema | ||
| microinjeção intracelular | Gas Picospritzer | Parker | |
| Pontas de Pipeta | Rainin | 17014340 | Surgery |
| Supply Aparador de Cabelo para Roedores | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Lâminas de | Cirurgia | Vet International RX0.9NACL-30BAC |
| , Tamanho 11 | Integra | 4-111 | Ferramentas de Cirurgia |
| Tesoura | World Precision Instruments | 503667 | Ferramentas de Cirurgia |
| Equipamento | Armazenamento | Instrumentos Estereotáxicos | |
| Sugi Sponge Strips (tiras de esponja) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (espuma de gel) | Ethicon | 1972 | Seringa de Suprimentos de Cirurgia |
| com Agulha de 26 G | BD | 309625 | Cirurgia Fornecimento |
| Tamoxifeno | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagente |
| Ti: Laser de Safira | Equipamento Coerente | ||
| Pipetas de Transferência Fisher | Scientific | 13-711-9AM | Fornecimento de |
| Cirurgia Manta de Água | Fisher Scientific Equipment | ||
| Xilocaína MPF com Epinefrina (1:200.000), 10 mg/ mL | Fresenius Kabi EUA | Droga |
Referências
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. <....
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Reimpressões e permissões
