Method Article

Plataforma de Cultura de Órgãos do Segmento Anterior para Rastreamento de Lesões no Globo Aberto e Desempenho Terapêutico

DOI:

10.3791/62649

⸱

August 25th, 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesões oculares de globo aberta podem ficar sem tratamento por vários dias em cenários rurais ou militares relevantes, resultando em cegueira. Terapêuticas são necessárias para minimizar a perda de visão. Aqui, detalhamos um modelo de lesão de globo aberto da cultura de órgãos. Com este modelo, a terapêutica potencial para estabilização dessas lesões pode ser devidamente avaliada.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesões em globos abertos têm resultados visuais ruins, muitas vezes resultando em perda permanente de visão. Isso se deve, em parte, a um prolongado atraso entre lesão e intervenção médica em ambientes rurais e aplicações de medicamentos militares onde o atendimento oftalmológico não está prontamente disponível. Lesões não tratadas são suscetíveis à infecção depois que o olho perdeu sua vedação impermeável, bem como a perda de viabilidade tecidual devido à hipotensão intraocular. A terapêutica para selar temporariamente lesões de globo aberta, se devidamente desenvolvidas, pode ser capaz de restaurar a pressão intraocular e prevenir a infecção até que o cuidado oftalmológico adequado seja possível. Para facilitar o desenvolvimento do produto, detalhado aqui está o uso de uma plataforma de lesão aberta de órgãos do segmento anterior para rastrear o desempenho terapêutico por pelo menos 72 h após a lesão. O tecido do segmento anterior suíno pode ser mantido em pratos de cultura de órgãos personalizados e mantido sob pressão intraocular fisiológica. Lesões por punção podem ser criadas com um sistema pneumático capaz de gerar tamanhos de lesões de até 4,5 mm de diâmetro, semelhante ao tamanho de lesões relevantes para os militares. A perda de pressão intraocular pode ser observada por 72 h após a lesão, confirmando a indução adequada da lesão e a perda do selo impermeável do olho. O desempenho terapêutico pode ser rastreado por aplicação ao olho após a indução da lesão e, em seguida, rastreamento da pressão intraocular por vários dias. Além disso, o modelo de lesão do segmento anterior é aplicável a métodos amplamente utilizados para o rastreamento funcional e biologicamente da fisiologia do segmento anterior, como avaliação da transparência, mecânica ocular, saúde do epitélio córnea e viabilidade tecidual. No geral, o método descrito aqui é um próximo passo necessário para o desenvolvimento de terapêuticas biomateriais para selar temporariamente lesões de globo aberta quando o cuidado oftálmico não estiver prontamente disponível.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesões de globo aberta (OG) podem resultar em perda permanente de visão quando não tratadas ou pelo menos estabilizadas após lesão1. Os atrasos, no entanto, são prevalentes em áreas remotas onde o acesso à intervenção oftalmómica não está prontamente disponível, como em áreas rurais ou no campo de batalha em cenários militares. Quando o tratamento não está prontamente disponível, o padrão atual de cuidado é proteger o olho com um escudo rígido até que a intervenção médica seja possível. Na medicina militar, esse atraso atualmente é de até 24 horas, mas a previsão é de aumento de até 72 horas em futuras operações de combate em ambientes urbanos onde a evacuação aérea não é possível2,3,4. Esses atrasos podem ser ainda maiores em aplicações civis rurais e remotas, onde o acesso à intervenção oftálmica é limitado5,6. Uma lesão OG não tratada é altamente suscetível à infecção e perda de pressão intraocular (IOP) devido à vedação impermeável do olho estar comprometida7,8. A perda de IOP pode impactar a viabilidade tecidual, tornando improvável qualquer intervenção médica para restaurar a visão se o atraso entre lesão e terapêutica for muito longo9.

Para permitir o desenvolvimento de terapêuticas fáceis de aplicar para vedação de lesões OG até que um especialista oftálmico possa ser alcançado, um modelo de lesão de OG no topo do banco foi previamente desenvolvido10,11. Com este modelo, lesões de alta velocidade foram criadas em olhos suínos inteiros, enquanto o IOP foi capturado por transdutores de pressão. A terapêutica pode então ser aplicada para avaliar sua capacidade de selar o local da lesão de OG12. No entanto, como este modelo utiliza olhos suínos inteiros, ele só pode avaliar o desempenho terapêutico imediato sem nenhuma maneira de acompanhar o desempenho a longo prazo através da possível janela de 72h em que o terapêutico deve estabilizar o local da lesão até que o paciente atinja o atendimento especializado. Como resultado, um modelo de lesão OG de cultura de órgãos do segmento anterior (ASOC) foi desenvolvido e detalhado neste protocolo como uma plataforma para acompanhamento do desempenho terapêutico de longo prazo13.

O ASOC é uma técnica amplamente utilizada para a manutenção do tecido avascular do segmento anterior, como a córnea, para várias semanas pós-enucleação14,15,16,17. O segmento anterior é mantido sob IOP fisiológico por perfusar o fluido nas taxas de fluxo fisiológico e preservar a região de saída da malha trabecular, o tecido responsável pela regulação do IOP, durante a configuração ASOC18,19. A plataforma ASOC pode manter o tecido fisiologicamente, induzir uma lesão OG usando um dispositivo pneumático, aplicar uma estabilização terapêutica e de lesão de pista por pelo menos 72 h pós-lesão13.

Aqui, o protocolo fornece uma metodologia passo a passo para o uso da plataforma ASOC. Primeiro, detalha como configurar e fabricar a plataforma ASOC. Em seguida, o protocolo detalha como dissecar asepticamente o segmento anterior e manter o trabalho de malha trabecular, seguido pela criação de tecido de segmento anterior em pratos de cultura de órgãos personalizados. Em seguida, detalha como criar lesões de globo aberto e aplicar terapêutica imediatamente após a lesão. Por fim, o protocolo fornece uma visão geral sobre parâmetros de caracterização que são possíveis de usar com este método que avalia as propriedades funcionais, mecânicas e biológicas do olho e quão bem a lesão foi estabilizada. No geral, este modelo fornece uma plataforma muito necessária para acelerar o desenvolvimento de produtos para estabilizar e tratar lesões de globo aberta e melhorar o prognóstico de visão ruim após a lesão.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antes de realizar este protocolo, esteja ciente de que existem requisitos legais e éticos para o uso de animais em pesquisa e treinamento. Se animais vivos forem usados para a fonte de tecido ocular, procure aprovação da autoridade ética ou legal local (IACUC ou Comitê de Ética, etc.) antes de começar. Se houver alguma dúvida na obtenção de aprovação para o uso de animais, não prossiga. Determinamos e relatamos anteriormente que os olhos suínos frescos obtiveram e foram usados dentro de 24 horas após a morte em comparação com a fisiologia in vivo e se saíram bem para esses estudos (Tecnologias Animais, Tyler, TX, EUA)10,13. Nenhum animal vivo foi utilizado ao longo deste protocolo, utilizando um fornecedor de tecidos para obter tecido dentro de 24 horas.

NOTA: Antes da chegada dos tecidos, forja os pratos de cultura de órgãos(Protocolo Suplementar 1),anéis de fixação(Protocolo Suplementar 1),estandes de pratos(Protocolo Suplementar 1),configuração de coleta de dados transdutores de pressão(Protocolo Suplementar 2)e plataforma de punção pneumática(Protocolo Suplementar 3). Esterilize os pratos, ferramentas e suprimentos e prepare as áreas de trabalho. É útil ter uma área não estéril para realizar dissecção grosseira nos olhos, pois eles geralmente vêm com tecido orbital extra conectado. Execute estes primeiros passos em uma superfície de trabalho aberta e limpa e, em seguida, transfira os olhos aseptamente para um gabinete BSC II para micro-dissecção (gabinete #1). Idealmente, o gabinete BSC II utilizado para microdiscção é separado do gabinete BSC II (gabinete nº 2) para minimizar o fluxo de ar e maximizar o espaço de trabalho. Configure o armário de micro dissecção com um microscópio dissecando e uma maneira de visualizar a superfície de trabalho (câmera ou oculares salientes do armário).

1. Etapas de esterilização, suprimentos (ver Tabela de Materiais para obter mais detalhes) e configuração

  1. Preparar e esterilizar a gás os seguintes itens (1 kit para cada olho): prato ASOC, anel de fixação, dois conectores fluidos com anéis O, dois cubos de agulha de 18 G, quatro parafusos, dois comprimentos de tubo PE-100 (comprimento de distância deve ser longo o suficiente para estender do prato dentro da incubadora até a bomba de seringa e configuração de coleta de dados transdutores de pressão), dois hubs de agulha dobradas de 18 G 90°, duas válvulas de 3 vias.
  2. Prepare e autoclave os seguintes kits.
    1. Prepare e autoclave o kit de instrumentos de microdiscção, contendo um par de fórceps finos, um par de tesouras Vannas, um par de fórceps dentuças médias, um par de tesouras grandes, cotonetes de algodão, e uma lâmina de barbear ou bisturi.
    2. Prepare e autoclave o kit de instrumentos de montagem, contendo um par de fórceps dentados médios, um par de tesouras cirúrgicas e uma chave L.
    3. Prepare e autoclave o kit diário (quantidade: um por dia de cultura), contendo uma chave L para apertar anéis de fixação em pratos todos os dias, conforme necessário.
    4. Autoclave quatro béquers de 100 mL para desinfetar e armazenar olhos e segmentos anteriores.
    5. Autoclave os objetos de punção.
  3. Reúna os seguintes itens estéreis: placa de Petri (1 prato/olho), gaze (1-2/olho), suporte para pratos, seringas de 20 mL (1/olho), seringas de 10 mL (1/olho), filtros de seringa de nylon (1/olho).
  4. Prepare a mídia estéril: DMEM com 4% de FBS, 1x Glutamax, 1x Gentamicina, 1x Antibiótico-Antimycotico (AA; aproximadamente 30-40 mL mídia completa/olho).
  5. Prepare AA-PBS: PBS com 1x AA (~500 mL).
  6. Prepare o pacote de ferramentas de dissecção grosseira: tesoura cirúrgica grande e limpa e seca.
  7. Configure o espaço de trabalho de dissecção não estéril: Reúna suprimentos da embalagem bruta da ferramenta de dissecção, olhos suínos enucleados submersos na PBS e no gelo, cortina cirúrgica, 100 mL de béquer com PBS. Coloque a cortina cirúrgica e os itens necessários para dissecção grosseira.
  8. Configure o espaço de trabalho de dissecção estéril: Reúna suprimentos do kit de instrumentos de microdiscção, gaze estéril, microscópio dissecando, solução betadina, PBS estéril, mídia estéril, quatro béquers esterilizados de 100 mL, placa de Petri estéril. Transferência asepticamente para o gabinete BSC II #1. Configure o armário para visualizar os olhos no microscópio de dissecação.
  9. Configure o espaço de trabalho de montagem ASOC: Reúna kits esterilizados a gás (kit de prato e kit de tampa), kit de instrumentos de montagem, mídia estéril, estandes de pratos de pratos, placas de Petri estéreis, seringas estéreis e filtros de seringa. Transferência asepticamente para o gabinete BSC II #2. Configure o armário para montagem de pratos.
  10. Quando os olhos estiverem estabilizados e prontos para perfuração (72 h após a configuração), transfiticamente transferi-los para um gabinete BSC II. Configure o espaço de trabalho de indução de lesão OG: dispositivo de indução de lesão pneumática (conjunto detalhado em Supplemental 3) e Lab Jack e vise de rastreamento cruzado para segurar o prato ASOC.

2. Dissecção do tecido

  1. Prepare o tecido suíno usando espaço de trabalho de dissecção não estéril.
    1. Procure olhos suínos enucleados de um matadouro local, estudos em animais ou fornecedor. Mantenha os olhos no gelo submerso em PBS durante a entrega e use imediatamente após o recebimento.
    2. Corte o tecido extraorbital e corte a conjuntiva deixando apenas a concha córnea e o nervo óptico. Realize a dissecção em condições não estéreis com grandes tesouras cirúrgicas e fórceps em um pacote de ferramentas de dissecção bruta.
    3. Coloque os olhos de volta em PBS fresco no gelo até que todos os olhos necessários para a configuração experimental tenham sido dissecados preliminares/brutos.
    4. Submergir os olhos em solução betadina de 10% por 2 minutos em recipientes fechados e transferir asepticamente para o gabinete BSC II #1. Realize todos os trabalhos subsequentes em condições estéreis para minimizar as contaminações durante a instalação.
  2. Dissecar estérilmente segmentos anteriores.
    1. Após 2 min em solução betadina, transfira os olhos para três lavagens seriais de AA-PBS estéreis para remover o excesso de solução betadina da superfície ocular, mantendo a esterilidade do tecido ocular. Depois de três lavagens, mantenha o tecido em AA-PBS até uso posterior.
    2. Hemisect o olho usando uma lâmina de barbear/bisturi e tesoura curvada. Coloque o olho em uma gaze encharcada de AA-PBS e crie uma incisão com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi perto do equador do olho (60/40 dividido com 40 no lado anterior). Utilizando tesoura cirúrgica curva, hemisect o olho para isolar o olho anterior (metade córnea).
      NOTA: O corte ao redor do segmento anterior precisa ser contínuo para evitar bordas irregulares e ásperas na esclera que criarão vazamentos de fluidos após a instalação na cultura do órgão.
    3. Use microscisores como pá para colher humor vítreo do segmento anterior. Remova a lente do segmento anterior usando microscissores. Deixe os segmentos anteriores no AA-PBS até novas etapas de dissecção.
      NOTA: Todos os olhos que serão dissecados podem ser mantidos nesta etapa e um por um levado pelo restante do processo de dissecção.
    4. Com um microscópio dissecando, corte a íris para a raiz da íris gradualmente, radialmente até que a malha trabecular (TM) seja visível. O TM é um tecido pigmentado que compreende fibras circunferencialmente orientadas ao redor da casca corneoscleral. Cortes cuidadosos na íris em direção à raiz da íris exporão a profundidade do TM sob o tecido.
    5. Corte 360° ao redor da íris na mesma profundidade do corte inicial no tecido para expor toda a região TM. Limpe qualquer íris residual restante cobrindo TM, conforme necessário.
    6. Corte os remanescentes do corpo ciliar posteriormente ao TM, deixando apenas uma fina faixa de tecido posterior à região TM (aproximadamente 1 mm).
    7. Coloque o segmento anterior dissecado (AS) em mídia até nova configuração no ASOC no gabinete BSC II #2.
      NOTA: Todos os olhos podem ser mantidos neste momento antes da configuração do ASOC se um único usuário estiver realizando dissecção e montagem de pratos de cultura de órgãos.

3. Criação de segmentos anteriores em pratos de cultura de órgãos

  1. Coloque um único AS em uma placa de Petri com AS invertida (copo para cima). Usando um cotonete, molhado na mídia e suavemente dab no centro da córnea para remover qualquer pigmento. Usando fórceps para segurar o olho e o mesmo cotonete, limpe o cotonete ao redor da esclera para remover pigmento extra.
  2. Inverta o AS e coloque em cima da parte inferior do prato sobre a região elevada, centralizando a córnea sobre a região elevada no prato. Coloque o anel de fixação em cima do AS recém-colocado.
  3. Coloque quatro parafusos nos orifícios correspondentes para manter o anel no lugar com o SO sob o anel. Aperte suavemente os parafusos com a tecla L.
    NOTA: A etapa de aperto acontecerá diariamente durante todo o experimento, de modo que o objetivo do aperto inicial aqui é garantir que a mídia não vaze, evitando quebrar o anel de fixação.
  4. Com um conjunto de placas de Petri estéreis, coloque a parte superior sobre a placa e inverta a configuração. Anexe o suporte do prato. Conecte os conectores fluidos com anéis O em portas roscadas na parte inferior do prato.
  5. A um conector fluido, conecte um cubo de agulha dobrada de 18 G 90°, um comprimento de tubulação, um hub de agulha de 18 G, um filtro de seringa de nylon, uma válvula de três vias e uma seringa de 20 mL cheia de mídia.
  6. Ao segundo conector fluido, conecte um cubo de agulha dobrada de 18 G 90° grau, comprimento de tubulação, um cubo de agulha de 18 G, uma válvula de três vias e a porção do barril de uma seringa estéril de 10 mL (isso funcionará como um reservatório para capturar líquidos e bolhas do ASOC).
  7. Com válvulas de três vias abertas adequadamente para as seringas, empurre suavemente a mídia através do sistema usando a porta do conector fluidics identificada na etapa 3.5 para inflar o AS, encher a mídia no tubo e, eventualmente, o reservatório.
    NOTA: Se a mídia vazar no prato ASOC, o AS não está bem fixado o suficiente com o anel de fixação.
  8. Remova bolhas empurrando suavemente a mídia para dentro do prato e invertendo o prato para empurrar as bolhas para dentro do reservatório.
  9. Coloque o prato e fique de pé. Coloque a parte inferior de uma placa de Petri sob os pés do suporte, cuidado para não engravar a tubulação.

4. Iniciar a cultura de órgãos do segmento anterior

  1. A ASOC está pronta para incubação. Coloque o prato ASOC na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2). Certifique-se de que a altura do prato ASOC na incubadora acima dos transdutores de pressão é conhecida e contabilizada para calcular o IOP com precisão(Protocolo Suplementar 4).
  2. Direcione as linhas de tubulação pela parte inferior da porta da incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 para que não interfiram na abertura e fechamento da porta. Conecte a seringa de 20 mL à bomba de seringa fixada em 2,5 μL/min.
  3. Posicione a linha de tubulação com o reservatório no instrumento transdutor de pressão. Conecte a válvula lateral de 3 vias à configuração do transdutor de pressão enquanto flui PBS através da linha para evitar que bolhas de ar entrem nas linhas de tubulação.
    NOTA: Esvazie o PBS dos reservatórios após a instalação do sistema para reduzir a probabilidade de contaminação do reservatório com crescimento microbiano durante a duração da cultura dos órgãos.
  4. Inicie a coleta de dados IOP, primeiro garantindo que um cartão microSD esteja presente para salvar arquivos de dados. Em seguida, ligue a configuração do transdutor de pressão para iniciar a coleta de dados.
    NOTA: Os detalhes para a configuração do dispositivo de coleta de dados do transdutor de pressão são fornecidos no Protocolo Suplementar 2.

5. Manutenção diária do ASOC

  1. Depois que o ASOC tiver 24 h para equilibrar, remova os pratos da incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e coloque-os no gabinete BSC II.
    NOTA: Na aquisição de dados de pressão, esses períodos de tempo parecem picos à medida que os ASOCs são removidos da incubadora (mudança de altura) e ajustados no gabinete.
  2. Verifique se há vazamentos em cada prato na placa de Petri. Se estiver presente, verifique se há conexões fluidas apertadas sob o prato e aperte novamente se necessário. Verifique se há vazamentos na parte superior do prato usando uma tecla L estéril para apertar os parafusos no anel de fixação.
    NOTA: O tecido esclera AS comprimirá e reduzirá a espessura em 24 horas, e o anel de fixação precisará ser apertado.
  3. Aspire a mídia do prato bem.
    NOTA: O trabalho de malha trabecular está filtrando o fluido da mídia que está sendo bombeada para o ASOC. Portanto, a mídia estará presente no prato ASOC ao longo das bordas.
  4. Repita as etapas 3.7 e 3.8 para remover quaisquer bolhas de ar presas.
  5. Recheie as seringas nas bombas de seringa, certifique-se de que as bombas de seringa estejam em funcionamento e confirme o alinhamento das válvulas para perfusão no ASOC. Devolva o prato ASOC para a incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
    NOTA: O ideal é que essas etapas sejam executadas diariamente. No entanto, o uso de um volume inicial de 20 mL de mídia, o volume do prato ASOC e uma taxa de bomba de 2,5 μL/min devem ser suficientes para deixar o sistema funcionar por vários dias sem ser perturbado.

6. Indução de lesão por OG com dispositivo de punção pneumática

NOTA: A construção do dispositivo de punção pneumática está detalhada no Protocolo Suplementar 3. As lesões de OG são induzidas após a estabilização do IOP, que normalmente ocorre após 3 dias na cultura. Os valores aceitáveis de IOP são de 5 a 20 mmHg com base no IOP fisiológico, o que pode ser determinado avaliando os arquivos de dados IOP ou definindo indicadores LED no sistema de medição de pressão conforme descrito no Protocolo Suplementar 2.

  1. Prepare o gabinete BSC II para indução de lesão OG conforme detalhado na etapa 1.10. Conecte a plataforma de perfuração a uma linha de ar comprimido. Coloque o objeto de punção estéril no mandril.
    NOTA: Um compressor de ar pode ser usado para alimentar o dispositivo, mas o ar comprimido do tanque ou linhas de laboratório embutidas podem ser suficientes se a pressão for superior a 50 psi.
  2. Coloque o regulador de pressão na plataforma de punção a 50 psi para uma força de punção adequada em objetos de até 4,5 mm de diâmetro. Posicione a víse de rastreamento cruzado na tomada de laboratório em frente à plataforma de punção para segurar o prato ASOC durante a indução de lesão.
  3. Remova a configuração ASOC de 37 °C, incubadora de CO2 de 5% e coloque no vise perpendicular de rastreamento cruzado à plataforma de punção(Figura 2) depois de remover a tampa e colocá-la de lado. Mantenha o segmento anterior perfusando, mas feche a porta da válvula de 3 vias para o transdutor de pressão para evitar danos de pressão excessiva ao transdutor.
  4. Estenda o braço do pistão até a distância máxima e posicione o ápice da córnea dentro de 1 mm do objeto de punção. Retraia o braço do pistão e aproxime o segmento anterior 1 cm do objeto de punção.
    NOTA: Esta distância foi otimizada para indução de lesão de alta eficiência sem atingir o prato ASOC.
  5. Dispare o dispositivo de punção ligando-o e abrindo a válvula solenoide com o segundo interruptor no dispositivo. Para retrair o dispositivo, pressione novamente o segundo interruptor para remover o dispositivo de punção do olho. Verifique a indução adequada da lesão por inspeção visual e vazamento de mídia do local da lesão.
  6. Remover o prato ASOC do torno; coloque a tampa de volta no conjunto do prato e abra a linha fluida para o transdutor de pressão. Coloque o ASOC de volta na incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
    NOTA: Neste ponto, o terapêutico pode ser aplicado ao AS para avaliar sua eficácia para vedação de lesões OG.

7. Removendo o ASOC da cultura

NOTA: Dependendo da análise do ponto final (ver Resultados Representativos para possíveis métodos de ponto final), o AS precisa permanecer no prato ASOC inflado enquanto outros métodos requerem tecido AS isolado da câmara de cultura. A metodologia abaixo descreve como tirar o AS dos pratos da cultura do órgão e remover o resto da configuração.

  1. Remova os pratos ASOC da incubadora de 37 °C, 5% de CO2. Feche a válvula de 3 vias para a seringa e o reservatório e desconecte o tubo do sistema. Descarte a seringa, o reservatório e o filtro. Coloque as válvulas de 3 vias, tubos e cubos de agulha em um recipiente separado para lavar e esterilizar.
  2. Desconecte os cubos de agulha das conexões fluidas na parte inferior do prato. Desconecte os conectores fluidos e os anéis o. Coloque todos os itens em um recipiente para lavar e esterilizar.
  3. Remova os quatro parafusos do anel de fixação usando a tecla L. Remova cuidadosamente o anel de fixação.
  4. Utilizando fórceps, remova o AS do prato e, dependendo da análise e imagem do ponto final, coloque em resíduos de risco biológico fixador ou apropriado.

8. Análise de dados do IOP

  1. Conecte o cartão microSD a um computador para remover o arquivo .txt contendo dados da execução experimental mais recente.
    NOTA: O arquivo é nomeado no código que controla o microcontrolador e deve ser atualizado para cada experimento (ver Protocolo Suplementar 2).
  2. Importe os dados em uma planilha.
  3. Organize os dados em 12 colunas: Tempo (em minuto) e sinal mV para cada um dos 11 canais transdutores de pressão. Os primeiros dez canais correspondem a dez configurações experimentais ASOC. O sinal final do transdutor é para um sensor aberto ao ar como um canal de controle para confirmar que o sinal mV não alterou devido a alterações no sinal de entrada. Canal de controle de parcela versus tempo para confirmar que o sinal mV foi consistente durante todo o tempo.
  4. Converta os sinais mV para dez canais em mmHg usando equações de interceptação de inclinação geradas a partir da calibração inicial de cada sensor (ver Protocolo Suplementar 4).
  5. Tempo de parcela (converter-se em dias para simplificar a interpretação de dados) versus cada um dos dez canais para determinar como o IOP flutuava ao longo do curso de tempo experimental.
  6. Determine os valores médios de IOP em pontos-chave dos dados para comparar mais facilmente os valores entre cada um e como eles são alterados antes e depois da indução de lesão de OG. Média de 2-3 horas de dados para cada intervalo de 24 horas para determinar iOP em cada dia de ASOC.
    NOTA: Os resultados do IOP representativo são mostrados na Figura 4.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imagens capturadas via Tomografia de Coerência Óptica (OCT) são mostradas para olhos lesionados de OG para ilustrar como uma indução de lesão bem sucedida parece. A Figura 3 mostra imagens para controle e tecido AS ferido OG imediatamente após a lesão e 72 h depois. Duas visualizações são mostradas: imagens transversais através do local da lesão e projeção de intensidade máxima (MIPs) de cima para baixo para visualizar a área da superfície da imagem. Os olhos de controle não mostram nenhuma ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existem etapas críticas com a plataforma de lesão ASOC OG que devem ser destacadas para melhorar a probabilidade de sucesso ao usar a metodologia. Primeiro, durante a dissecção do segmento anterior, preservar o trabalho de malha trabecular é essencial, mas desafiador de fazer corretamente. Se o TM for interrompido, o olho não manterá a pressão fisiológica e não atenderá aos critérios de elegibilidade para uso experimental. Recomenda-se praticar o processo de dissecção em condições normais primeiro, em vez de introduzir o...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses concorrentes. As opiniões expressas neste artigo são as dos autores e não refletem a política oficial ou a posição do Departamento Médico do Exército dos EUA, departamento do Exército, Departamento de Defesa ou governo dos EUA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos através de um acordo interagências (#19-1006-IM) com o programa temporário de aquisição de reparos corneais (Agência de Desenvolvimento de Materiel Médicos do Exército dos Estados Unidos).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Conector de tubo roscado macho de plugue reto de policarbonato 10-32McMaster-Carr51525K431
10-32, ½ "McMaster-Carr92196A269
Seringa de 10 mLBD302995
Seringa de 20 mLBD302830
Anti-AntiGibco15240-096
Ball-End L keyMcMaster-Carr5020A25
BetadineFisher ScientificNC1696484
BD  Intramédico  PE 160 TubingFisher Scientific14-170-12E
CotonetesPuritan25-8061WC
DMEM mediaATCC30-2002
FBSATCC30-2020
Pinça finaWorld Precision Instruments15914
GazeCovidien8044
GentamicinaGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
Anel de vedação de silicone de alta temperatura, 2 mm de largura, 4 mm de diâmetro internoMcMaster-Carr5233T47
Pinça grandeWorld Precision Instruments500365
Tesoura cirúrgica grandeWorld Precision Instruments503261
pinça dentada médiaWorld Precision Instrumentos501217
Prego (objeto de perfuração)McMaster-Carr97808A503
Filtros de seringa de nylonFisher09-719C
PBSGibco10010-023
Placa de Petri (100 mm)FisherFB0875713
Policarbonato, três vias, torneira com macho  luer  travaLâminaFisher NC9593742
Fisher12-640
Aço inoxidável 18 G  90 graus  agulha dispensadora de ânguloMcMaster-Carr75165A81
Aço inoxidável 18 G reto ½ '’ agulha de dispensaçãoMcMaster-Carr75165A675
Copos estéreis de 100 mL com tampasVWR15704-092
Vannas  tesouraWorld Precision InstrumentsWP5070
de barbear

References

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