Em Drosophila,o núcleo oócito sofre migração dependente de microtúbulos durante a oogênese. Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para acompanhar a migração realizando imagens ao vivo em câmaras de ovos ex-vivo. Nosso procedimento mantém as câmaras de ovos vivas por 12 horas para adquirir filmes de lapso de tempo 3D multi-posição usando microscopia confocal de disco giratório.
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Artigo de método
Migração Nuclear no Oócito de Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de células vivas é particularmente necessária para entender os mecanismos celulares e moleculares que regulam movimentos de organela, rearranjos de citoesqueleto ou padronagem de polaridade dentro das células. Ao estudar o posicionamento do núcleo oócito, as técnicas de imagem ao vivo são essenciais para capturar os eventos dinâmicos desse processo. A câmara de ovos Drosophila é uma estrutura multicelular e um excelente sistema modelo para estudar esse fenômeno devido ao seu grande tamanho e disponibilidade de inúmeras ferramentas genéticas. Durante a oogênese média de Drosophila, o núcleo migra de uma posição central dentro do oócito para adotar uma posição assimétrica mediada por forças geradas por microtúbulos. Essa migração e posicionamento do núcleo são necessários para determinar os eixos de polaridade do embrião e da mosca adulta subsequente. Uma característica dessa migração é que ela ocorre em três dimensões (3D), criando uma necessidade de imagem viva. Assim, para estudar os mecanismos que regulam a migração nuclear, desenvolvemos um protocolo para cultivar as câmaras de ovos dissecadas e realizar imagens ao vivo por 12h por aquisições de lapso de tempo usando microscopia confocal de disco giratório. No geral, nossas condições nos permitem preservar as câmaras de ovos de Drosophila vivas por um longo período de tempo, permitindo assim que a conclusão da migração nuclear seja visualizada em um grande número de amostras em 3D.
Introdução
Por vários anos, o oócito Drosophila emergiu como um sistema modelo para estudar a migração nuclear. O oócito Drosophila desenvolve-se em uma estrutura multicelular chamada câmara de ovos. Câmaras de ovos abrangem 16 células germinativas (15 células enfermeiras e o oócito) cercadas por uma camada epitelial de células somáticas foliculares. O desenvolvimento da câmara de ovos foi subdividido em 14 etapas (Figura 1A), durante as quais o oócito crescerá e acumulará reservas necessárias para o desenvolvimento precoce do embrião. Durante o desenvolvimento, após a reorganização microtúbula e o transporte assimétrico de determi....
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Protocolo
1. Preparação média de imagem
- Prepare novas mídias no dia do uso. Pipeta 200 μL de meio Schneider (contendo L-Glutamina e 0,40 g/L de NaHCO3 complementado com soro fetal de bezerro inativado 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina).
- Suplemento com 30 μL de insulina 10 mg/mL.
- Adicione 4 μL de soro fetal inativado a calor.
2. Preparação da câmara de observação
- Com uma ponta de pipeta, aplique uma pequena quantidade de graxa de silicone ao redor do orifício na parte inferior do slide perfurado(Figura 4D).
- Posicione uma tampa de 24....
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Resultados
Antes da migração, o núcleo é dinâmico e oscila em torno de uma posição central durante um período definido como pré-migração. Esses pequenos movimentos refletem um equilíbrio de forças de empurrar e puxar que mantêm o equilíbrio no meio do oócito. Ao quantificar as trajetórias dos núcleos, mostramos que as trajetórias APM e LPM apresentaram proporções semelhantes. Definimos a natureza da trajetória pelo primeiro contato entre o núcleo e a membrana plasmática6. Assim, o núcleo atinge o APM ou o LP.......
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Discussão
Outros protocolos descrevem como preparar e cultivar câmaras de ovos Drosophila ex vivo para ensaio de imagem ao vivo12,13. A novidade deste protocolo é o uso de uma câmara de imagem construída usando um slide de alumínio oco, um deslizamento de tampa e uma membrana permeável O2/CO2. A principal vantagem desta configuração é limitar o movimento em Z sem exercer pressão sobre a amostra. Assim, o oócito ainda pode se mover livremente,.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Somos extremamente gratos a Jean-Antoine Lepesant e Nicolas Tissot que originalmente desenvolveram o protocolo e compartilharam alguns elementos gráficos da Figura 3 conosco. Agradecemos a Fanny Roland-Gosselin que tirou as fotos da Figura 4. Agradecemos também a outros membros do laboratório por discussões úteis que contribuíram para a amenização desta técnica e Nathaniel Henneman por seus comentários que ajudaram a melhorar este manuscrito. Reconhecemos a instalação central ImagoSeine do Instituto Jacques Monod, membro da France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh é apoiada por uma bolsa de doutorado do Ministério da Pesquisa francês (MESRI). Antoine Guichet e F....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anestesiar almofada de CO2 | Dutscher | 789060 | Anestesiar moscas |
| Lamínula (24x50 mm) | Knittel Vidro | VD12450Y100A | Preparação da câmara de observação |
| Fórceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissecção |
| Agulhas de aço inoxidável | Entosphinx | 20 | Dissecção |
| Soro fetal de bezerro inativado por calor | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Meio de imagem |
| Solução de insulina pâncreas bovino | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Meio de imagem |
| Solução de penicilina/estreptomicina | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Meio de imagem |
| Membrana permeável | Leica | 11521746 | Preparação da câmara de observação |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Meio de imagiologia |
| Massa lubrificante de silicone | BECKMAN COULTER | 335148 | Preparação da câmara de observação |
| Disco giratório confocal | Zeiss | CSU-X1 | Observação da migração nuclear |
| Óleo Voltalef 10S | VWR | 24627 - 188 | Preparação da câmara de observação |
Referências
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A.
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Reimpressões e permissões
