Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.
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Artigo de método
Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade
Neste artigo
Resumo
Resumo
A gravidade é um dos principais determinantes da função celular humana, proliferação, arquitetura citoesquelética e orientação. Os sistemas de biorreatores rotativos (RCCSs) imitam a perda de gravidade à medida que ocorre no espaço e, em vez disso, fornecem um ambiente de microgravidade através da rotação contínua de células ou tecidos cultivados. Esses RCCSs garantem um suprimento ininterrupto de nutrientes, fatores de crescimento e transcrição e oxigênio, e abordam algumas das deficiências das forças gravitacionais em pratos de cultura de células ou órgãos 2D (bidimensionais) imóveis. No presente estudo, utilizamos RCCSs para co-cultivar células de alça cervical e células da polpa dentária para se tornarem ameloblastos, para caracterizar interações progenitor/andaime periodontal e para determinar o efeito da inflamação nos alvéolos pulmonares. Os ambientes do CCRC facilitaram o crescimento de células semelhantes a ameloblastos, promoveram a proliferação de progenitores periodontais em resposta a revestimentos de andaimes e permitiram uma avaliação dos efeitos das alterações inflamatórias nos alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume as condições ambientais, materiais e etapas ao longo do caminho e destaca aspectos críticos e detalhes experimentais. Em conclusão, os CCRCs são ferramentas inovadoras para dominar a cultura e o crescimento 3D (tridimensional) de células in vitro e para permitir o estudo de sistemas celulares ou interações não passíveis de ambientes clássicos de cultura 2D.
Introdução
A gravidade afeta todos os aspectos da vida na Terra, incluindo a biologia das células individuais e sua função dentro dos organismos. As células sentem a gravidade através de mecanorreceptores e respondem a mudanças na gravidade reconfigurando arquiteturas citoesqueléticas e alterando a divisão celular 1,2,3. Outros efeitos da microgravidade incluem a pressão hidrostática em vesículas cheias de fluido, sedimentação de organelas e convecção de fluxo e calor impulsionada por flutuabilidade4. Estudos sobre o efeito da perda de gravidade em células e órgã....
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Protocolo
Toda a aprovação institucional necessária foi obtida para garantir que o estudo estivesse em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU.
1. Montagem e esterilização do biorreator
- Esterilizar quatro recipientes de alta proporção (HARV) para o biorreator em uma autoclave no ciclo de instrumentos de plástico por 20 minutos a 121 °C, conforme recomendado pelo fabricante.
- Após a esterilização, monte os vasos em um exaustor de cultura de células, apertando os parafusos fornecidos com o biorreator após o qual os vasos estão prontos para uso.
2. Andaimes utilizad....
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Resultados
A câmara interna do biorreator fornece um ambiente para as células proliferarem e se diferenciarem, se ligarem a um andaime ou se reunirem para formar tecidos como conjuntos. Cada vaso HARV comporta até 10 mL de meio e facilita uma circulação constante de nutrientes para que cada célula tenha uma excelente chance de sobreviver. A figura 1A ilustra a fixação das portas da seringa à placa frontal do recipiente, onde estão fixadas válvulas de balcão único estéreis. Essas válvulas atuam como por.......
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Discussão
As etapas críticas do protocolo para o crescimento de células em microgravidade incluem o biorreator, o andaime, as células usadas para cultura 3D e o revestimento de andaimes como um meio de induzir a diferenciação celular. O tipo de biorreator usado em nossos estudos compreende o biorreator RCCS-4, uma modificação recente do dispositivo de cultura de tecidos cilíndricos rotativos do Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) original desenvolvido pela NASA para cultivar células em microgravidade simulada. Este ambi.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os estudos foram generosamente apoiados por doações do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (UG3-DE028869 e R01-DE027930).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antibiótico-antimicótico | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ácido Ascórbico | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Mídia de modificação | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA andaime | Synthecon | Personalizado | Disponível na empresa através de um pedido personalizado |
| BMP-2 | R& D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R& D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectina | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Disco de gelatina | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Folhas de grafeno | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Disco de hidroxiapatita | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Proteína Il-6 | PeproTech | 200-06 | |
| Mídia SFM de queratinócitos (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminina | Corning | 354259 | |
| Peptídeo LRAP | Peptídeo 2.0 | Sequência personalizada: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Membrana de nitrocelulose | Merck Millipore | ||
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Válvula de serra torneira unidirecional com trava luer macho giratória | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Seringas com agulha 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Tripsina EDTA (0,25%) | ThermoFisher Scientfic |
Referências
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 ....
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Reimpressões e permissões
