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Artigo de método

Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade

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DOI:

10.3791/62690

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25 de maio de 2021

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1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.

Resumo

A gravidade é um dos principais determinantes da função celular humana, proliferação, arquitetura citoesquelética e orientação. Os sistemas de biorreatores rotativos (RCCSs) imitam a perda de gravidade à medida que ocorre no espaço e, em vez disso, fornecem um ambiente de microgravidade através da rotação contínua de células ou tecidos cultivados. Esses RCCSs garantem um suprimento ininterrupto de nutrientes, fatores de crescimento e transcrição e oxigênio, e abordam algumas das deficiências das forças gravitacionais em pratos de cultura de células ou órgãos 2D (bidimensionais) imóveis. No presente estudo, utilizamos RCCSs para co-cultivar células de alça cervical e células da polpa dentária para se tornarem ameloblastos, para caracterizar interações progenitor/andaime periodontal e para determinar o efeito da inflamação nos alvéolos pulmonares. Os ambientes do CCRC facilitaram o crescimento de células semelhantes a ameloblastos, promoveram a proliferação de progenitores periodontais em resposta a revestimentos de andaimes e permitiram uma avaliação dos efeitos das alterações inflamatórias nos alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume as condições ambientais, materiais e etapas ao longo do caminho e destaca aspectos críticos e detalhes experimentais. Em conclusão, os CCRCs são ferramentas inovadoras para dominar a cultura e o crescimento 3D (tridimensional) de células in vitro e para permitir o estudo de sistemas celulares ou interações não passíveis de ambientes clássicos de cultura 2D.

Introdução

A gravidade afeta todos os aspectos da vida na Terra, incluindo a biologia das células individuais e sua função dentro dos organismos. As células sentem a gravidade através de mecanorreceptores e respondem a mudanças na gravidade reconfigurando arquiteturas citoesqueléticas e alterando a divisão celular 1,2,3. Outros efeitos da microgravidade incluem a pressão hidrostática em vesículas cheias de fluido, sedimentação de organelas e convecção de fluxo e calor impulsionada por flutuabilidade4. Estudos sobre o efeito da perda de gravidade em células e órgãos humanos foram originalmente conduzidos para simular o ambiente sem peso do espaço em astronautas durante missões de voo espacial5. No entanto, nos últimos anos, essas tecnologias de biorreatores 3D originalmente desenvolvidas pela NASA para simular a microgravidade estão se tornando cada vez mais relevantes como novas abordagens para a cultura de populações celulares que, de outra forma, não são passíveis de sistemas de cultura 2D.

Os biorreatores 3D simulam a microgravidade cultivando células em suspensão e, assim, criando um efeito constante de "queda livre". Outras vantagens dos biorreatores rotativos incluem a falta de exposição ao ar encontrada em sistemas de cultura de órgãos, uma redução na tensão de cisalhamento e turbulência, e uma exposição contínua a um suprimento variável de nutrientes. Essas condições dinâmicas proporcionadas por um biorreator do Sistema de Cultura de Células Rotativas (CCRC) favorecem a colocalização espacial e a montagem tridimensional de células individuais em agregados 6,7.

Estudos prévios demonstraram as vantagens de um biorreator rotativo para a regeneração óssea8, cultura de germes dentários9 e para a cultura de células do folículo dentário humano10. Também houve um relato sugerindo que o RCCS aumenta a proliferação e diferenciação de células EOE em ameloblastos11. No entanto, células diferenciadas foram consideradas ameloblastos com base na imunofluorescência da ameloblastina e/ou expressão de amelogenina isoladamente11 sem considerar sua morfologia alongada ou forma celular polarizada.

Além do biorreator de vasos de parede rotativa (RWV) desenvolvido pela NASA, outras tecnologias para gerar agregados 3D a partir de células incluem levitação magnética, a máquina de posicionamento aleatório (RPM) e o clinostato12. Para alcançar a levitação magnética, células marcadas com nanopartículas magnéticas são levitadas por meio de uma força magnética externa, resultando na formação de estruturas 3D livres de andaimes que têm sido utilizadas para a biofabricação de estruturas de adipócitos13,14,15. Outra abordagem para simular a microgravidade é a geração de forças G multidirecionais controlando a rotação simultânea em torno de dois eixos, resultando em um cancelamento do vetor de gravidade cumulativa no centro de um dispositivo chamado clinostato16. Quando as células-tronco da medula óssea foram cultivadas em clinostato, a nova formação óssea foi inibida através da supressão da diferenciação de osteoblastos, ilustrando um dos efeitos desdiferenciadores da microgravidade16.

Sistemas in vitro para facilitar a cultura fiel de ameloblastos proporcionariam um grande passo em direção à engenharia de tecidos de esmalte dentário17. Infelizmente, até hoje, a cultura dos ameloblastos tem sido um empreendimento desafiador18,19. Até agora, cinco linhagens celulares diferentes semelhantes a ameloblastos foram relatadas, incluindo a linhagem celular de linhagem de ameloblastos de camundongo (ALC), a linhagem celular epitelial dentária de ratos (HAT-7), a linhagem celular LS8 20 de camundongos, a linhagem celular PABSo-Esuína 21 ea linhagem celular 22 SF2-24 de ratos. No entanto, a maioria dessas células perdeu sua forma distinta de célula polarizada em cultura 2D.

No presente estudo, recorremos a um Sistema de Biorreator de Cultura de Células Rotativas (CCRC) para facilitar o crescimento de células semelhantes a ameloblastos a partir de epitélios de alça cervical co-cultivados com progenitores mesenquimais e superar os desafios dos sistemas de cultura 2D, incluindo a redução do fluxo de nutrientes e alterações citoesqueléticas devido à gravidade. Além disso, o RCCS forneceu novos caminhos para o estudo das interações célula/andaime relacionadas à engenharia do tecido periodontal e para examinar os efeitos dos mediadores inflamatórios nos tecidos alveolares pulmonares in vitro. Juntos, os resultados desses estudos destacam os benefícios dos sistemas de cultura rotatória baseados em microgravidade para a propagação de epitélios diferenciados e para a avaliação dos efeitos ambientais em células cultivadas in vitro, incluindo interações célula/andaime e a resposta tecidual a condições inflamatórias.

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Protocolo

Toda a aprovação institucional necessária foi obtida para garantir que o estudo estivesse em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU.

1. Montagem e esterilização do biorreator

  1. Esterilizar quatro recipientes de alta proporção (HARV) para o biorreator em uma autoclave no ciclo de instrumentos de plástico por 20 minutos a 121 °C, conforme recomendado pelo fabricante.
  2. Após a esterilização, monte os vasos em um exaustor de cultura de células, apertando os parafusos fornecidos com o biorreator após o qual os vasos estão prontos para uso.

2. Andaimes utilizados para a experiência de co-cultura de biorreactores

  1. Incubar os andaimes juntamente com as células para fornecer suporte para a fixação celular necessária para o crescimento posterior.
  2. Escolha entre andaimes à base de PGA, andaimes de hidroxiapatita, folhas de grafeno, discos de gelatina e andaimes à base de colágeno para estudos de cocultura.

3. Dissecção da Alça Cervical (LC) e preparação de célula única

  1. Sacrificar ratos por decapitação após parada respiratória por overdose de CO2 .
    NOTA: Todos os estudos em animais estão em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU.
  2. Dissecar alças cervicais de camundongos 6 dias pós-natais (NPD) seguindo uma versão modificada de um protocolo previamente publicado23.
    NOTA: Em nosso estudo, a porção distal da alça cervical não mostrada no protocolo previamente publicado está incluída (Figura 3).
    1. Lavar o tecido dissecado com PBS estéril frio antes da digestão com colagenase dispase a 37 °C durante 30 minutos.
  3. Passar a solução através de um filtro de células estéreis de 70 μm e continuar a centrifugar a 800 x g durante 10 minutos.
  4. Descarte o sobrenadante. Centrifugar o pellet e lavar duas vezes com PBS frio a 800 x g. Descarte o sobrenadante.
  5. Conte as células usando um hemocitômetro e adicione 1 X 105 células por vaso.

4. Cultura de células da polpa dentária e expansão da linhagem celular

  1. Células da polpa dentária em placa de cultura de tecidos de 100 mm na passagem 4 na concentração de 1 x 105.
  2. Preparar meios para a cultura consistindo de meios de alta glicose DMEM, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico/antimicótico (P/S).
  3. Quando as células atingirem 85-90% de confluência, aspirar o meio e lavar as placas duas vezes com PBS pré-aquecido.
  4. Após a lavagem com PBS, adicionar uma solução pré-aquecida de tripsina-EDTA a 0,25% à placa e incubar as placas contendo células da polpa dentária a 37 °C durante 3 minutos.
  5. Confirme o descolamento celular por inspeção visual usando um microscópio.
  6. Recolher o meio juntamente com as células da placa de cultura e transferir através de uma pipeta de 25 ml para um tubo cónico estéril de 50 ml.
  7. Centrifugar as células a 800 x g durante 8 minutos e eliminar o sobrenadante. Ressuspenda as células em meios frescos e conte usando um hemocitômetro.
  8. Para co-cultura com células de alça cervical, semear as células da polpa dentária no biorreator a uma concentração de 1 x 104 por vaso.

5. Co-cultura de células da alça cervical/polpa dentária em um andaime dentro do biorreator RCCS

  1. Adicione ambos os tipos de células, a alça cervical e a polpa dentária ao meio de cultura contendo meio SFM de queratinócitos com fatores de crescimento suplementados, proteínas da matriz extracelular e andaimes.
    NOTA: Os fatores de crescimento são adicionados a uma concentração de 0,03 μg/mL de proteína morfogenética óssea 2 (BMP 2), 0,03 μg/mL de proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos recombinantes humanos (hFGF) e 15 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (hEGF), enquanto os componentes da ECM incluíram 200 μg/mL de Matrigel, 5 μg/mL de laminina e 5 μg/mL de fibronectina.
  2. Suportes de revestimento com uma mistura de 500 μL de gel de colagénio enriquecido com 1 mg de péptido LRAP (Peptídeo de amelogenina rico em leucina), 1 mg de matriz de esmalte em estádio inicial liofilizado preparado a partir de dentes suínos24, 5 μg/ml de laminina e 5 μg/ml de fibronectina.
    NOTA: Isso funcionou melhor para nossos experimentos.
  3. Após o revestimento do andaime, adicione células e andaimes ao biorreator e encha o biorreator com 10 mL de meio por vaso.
  4. Feche a tampa da porta de enchimento do vaso do biorreator após a adição de meios, células e andaimes.
  5. Fixar as válvulas estéreis às portas da seringa no início da experiência e mantê-las no lugar com uma tampa até ao final da experiência.
  6. Uma vez que a embarcação esteja 90% cheia e as tampas da porta de enchimento estejam fechadas e apertadas, abra as válvulas estéreis.
  7. Utilize duas seringas estéreis (3 ml) sempre que for necessária uma mudança de meio. Encha uma seringa com um meio fresco enquanto a outra seringa é deixada vazia.
  8. Abra ambas as válvulas de seringa e manobrar suavemente as bolhas em direção à porta da seringa vazia.
  9. Uma vez que o meio fresco da seringa cheia é cuidadosamente injetado no recipiente, remova as bolhas através da porta da seringa vazia.
    NOTA: Este procedimento é realizado até que todas as microbolhas sejam removidas dos vasos.
  10. Feche as portas da seringa com tampas e descarte as seringas em um recipiente de resíduos perfurocortantes.
  11. Fixar cada recipiente à base do rotador e colocar a base do rotador numa incubadora com 5% de CO2 e temperatura de 37 °C.
  12. Ligue a alimentação e defina a velocidade de rotação para 10,1 rpm.
    NOTA: Ajuste a velocidade para garantir que os andaimes estão em suspensão sem tocar na parede da embarcação.
  13. Para a mudança de mídia, coloque os vasos em uma posição vertical para garantir que as células se estabeleçam no fundo. Abra as portas da seringa e ligue as seringas estéreis às portas.
  14. Siga o mesmo procedimento, aspirando 75% do meio esgotado em nutrição e injetando meio fresco através do outro porto.

6. Preparação de órgãos pulmonares e cultura baseada em biorreatores

NOTA: Filhotes de camundongos do tipo selvagem E15 foram utilizados para o preparo dos órgãos pulmonares.

  1. Dissecar o tecido pulmonar após a eutanásia de uma rata grávida com asfixia por CO2 .
    1. Uma vez que a morte é confirmada após asfixia por luxação cervical, use um bisturi para expor a cavidade torácica. Depois disso, remova os filhotes do útero e eutanasie por decapitação.
  2. Após a eutanásia, prepare a cavidade torácica, abrindo-a com um bisturi para localizar os pulmões. Lave pequenos segmentos de tecido pulmonar com PBS estéril e coloque-o em uma membrana pré-esterilizada por 2 horas com meio de cultura de órgãos em uma incubadora contendo 5% de CO2 e temperatura de 37 °C.
  3. Uma vez que os tecidos pulmonares se ligam à membrana em uma placa de cultura de órgãos 2D, transfira as amostras para o vaso do biorreator.
  4. Prepare a mídia para a cultura.
    NOTA: O meio de controle DMEM de alta glicose contém 10% de soro fetal bovino (FBS), solução antibiótica a 1% (P/S) (penicilina, 100 U/mL, estreptomicina, 50 μg/mL) e 100 μg/mL de ácido ascórbico (AA) e para a indução de condições inflamatórias, o meio controle é suplementado com 5 ng/mL de proteína IL-6.
  5. Realizar o experimento de cultura pulmonar por 10 dias com uma troca de meio a cada 48 horas no biorreator, conforme descrito acima.

7. Andaime revestido com cultura de células do ligamento periodontal humano (hPDL)

  1. Cultura de células do ligamento periodontal humano.
    NOTA: As células são isoladas e cultivadas em nosso laboratório de acordo com o protocolo publicado anteriormente25.
  2. Revestir os discos de andaime de colágeno com 30 μL de PBS para o grupo controle e o neuropeptídeo galanina (GAL) a uma concentração de 10-8 durante a noite.
  3. Semear células PDL humanas no andaime de controle e revestido de GAL por 2 horas a 37 °C em uma placa de cultura e transferir os andaimes semeados de células para um vaso de biorreator, conforme mencionado acima.
  4. Cultive os andaimes semeados de células por 14 dias no biorreator antes de colher os andaimes para análise.

8. Limpeza e manutenção de biorreatores

  1. Depois que os andaimes/células forem colhidos do biorreator, remova as portas da seringa do navio.
    NOTA: Os parafusos ao redor dos vasos são retirados e o recipiente é suavemente lavado com água e sabão.
  2. Lave os recipientes com água limpa e aperte os parafusos mais uma vez.
  3. Armazenar os recipientes após a autoclave até a próxima utilização.

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Resultados

A câmara interna do biorreator fornece um ambiente para as células proliferarem e se diferenciarem, se ligarem a um andaime ou se reunirem para formar tecidos como conjuntos. Cada vaso HARV comporta até 10 mL de meio e facilita uma circulação constante de nutrientes para que cada célula tenha uma excelente chance de sobreviver. A figura 1A ilustra a fixação das portas da seringa à placa frontal do recipiente, onde estão fixadas válvulas de balcão único estéreis. Essas válvulas atuam como por...

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Discussão

As etapas críticas do protocolo para o crescimento de células em microgravidade incluem o biorreator, o andaime, as células usadas para cultura 3D e o revestimento de andaimes como um meio de induzir a diferenciação celular. O tipo de biorreator usado em nossos estudos compreende o biorreator RCCS-4, uma modificação recente do dispositivo de cultura de tecidos cilíndricos rotativos do Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) original desenvolvido pela NASA para cultivar células em microgravidade simulada. Este ambi...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os estudos foram generosamente apoiados por doações do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (UG3-DE028869 e R01-DE027930).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Antibiótico-antimicóticoThermoFisher Scientfic15240096
Ácido AscórbicoSigma AldrichA4544
BGJb Fitton-Jackson Mídia de modificaçãoThermoFisher Scientfic12591
BIOST PGA andaimeSyntheconPersonalizadoDisponível na empresa através de um pedido personalizado
BMP-2R& D Systems355-BM
BMP-4R& D Systems314-BP
DMEM MediaSigma AldrichD6429-500mL
FBSThermoFisher Scientfic16140071
FibricolAdvanced Biomatrix5133-20mL
FibronectinaCorning354008
GalaninSigma AldrichG-0278
Disco de gelatinaAdvanced BiomatrixCytoForm 500
Folhas de grafenoAdvanced BiomatrixCytoForm 300
hEGFPeprotechAF-100-15
hFGFThermoFisher ScientficAA1-155
Disco de hidroxiapatitaAdvanced BiomatrixCytoForm 200
Proteína Il-6PeproTech200-06
Mídia SFM de queratinócitos (1X)ThermoFisher Scientfic17005042
LamininaCorning354259
Peptídeo LRAPPeptídeo 2.0Sequência personalizada: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL
PLEAWPATDKTKREEVD
MatrigelCorning354234
Millipore Membrana de nitroceluloseMerck Millipore
RCCS BioreactorSyntheconRCCS 4HD
SpongeColAdvanced Biomatrix5135-25EA
Válvula de serra torneira unidirecional com trava luer macho giratóriaSmiths MedicalMX5-61L
Seringas com agulha 3ccMcKESSON16-SN3C211
Tripsina EDTA (0,25%)ThermoFisher Scientfic
AABP0470025200056

Referências

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