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Artigo de método

Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

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DOI:

10.3791/62697

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29 de junho de 2021

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1Liver, Pancreas and Motility Laboratory; Unit of Experimental Medicine; School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Department of Surgery, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Department of Cells and Tissue Biology, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Department of Pathology, Hospital General de Mexico, 5Materials Research Institute, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Neste artigo

Resumo

Doenças hepáticas são induzidas por muitas causas que promovem fibrose ou cirrose. O transplante é a única opção para recuperar a saúde. No entanto, dada a escassez de órgãos transplantáveis, alternativas devem ser exploradas. Nossa pesquisa propõe a implantação de andaimes de colágeno no tecido hepático a partir de um modelo animal.

Resumo

Doenças hepáticas são a principal causa de morte em todo o mundo. O consumo excessivo de álcool, uma dieta rica em gordura e a infecção pelo vírus da hepatite C promovem fibrose, cirrose e/ou carcinoma hepatocelular. O transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado para melhorar e prolongar a vida útil dos pacientes em estágios avançados da doença. No entanto, apenas 10% dos transplantes são bem-sucedidos, com disponibilidade de órgãos, procedimentos pré-cirúrgicos e pós-cirúrgicos, e custos elevados diretamente correlacionados com esse resultado. Andaimes de matriz extracelular (ECM) surgiram como uma alternativa para a restauração tecidual. A biocompatibilidade e a aceitação do enxerto são as principais características benéficas desses biomateriais. Embora a capacidade de restaurar o tamanho e a função correta do fígado tenha sido avaliada em modelos de hepatectomia hepática, o uso de andaimes ou algum tipo de suporte para substituir o volume da massa hepática extirpada não foi avaliado.

A hepatectomia parcial foi realizada em um fígado de rato com a xenoimplantação de um andaime de matriz de colágeno (CMS) de um condíle bovino. O tecido do lobo hepático esquerdo foi removido (aproximadamente 40%), e uma proporção igual de CMS foi implantada cirurgicamente. Os testes de função hepática foram avaliados antes e depois do procedimento cirúrgico. Após os dias 3, 14 e 21, os animais foram eutanizados, e foram realizadas avaliações macroscópicas e histópicas. Nos dias 3 e 14, observou-se tecido adiposo em torno do CMS, sem evidência clínica de rejeição ou infecção, assim como a neoformação do vaso e a reabsorção de CMS no dia 21. Havia evidências histológicas de um processo de inflamação insignificante e migração de células adjacentes para o CMS, observadas com a hematoxilina e eosina (H&E) e a coloração tricrômica de Masson. O CMS mostrou-se ter um bom desempenho no tecido hepático e pode ser uma alternativa útil para estudar a regeneração tecidual e a reparação em doenças hepáticas crônicas.

Introdução

O fígado é um dos órgãos mais importantes envolvidos na manutenção da homeostase e da produção deproteínas 1. Infelizmente, a doença hepática é a principal causa de morte em todo o mundo. Em estágios avançados de dano hepático, que incluem cirrose e carcinoma hepatocelular, o transplante de fígado é o procedimento clinicamente recomendado. No entanto, devido à escassez de doadores e à baixa taxa de transplantes bem sucedidos, novas técnicas em engenharia de tecidos (TE) e medicina regenerativa (RM) foram desenvolvidas2,3.

O TE envolve o uso de células-tronco, andaimes e fatores de crescimento4 para promover a restauração de órgãos e tecidos inflamados, fibrosos e edematosos1,5,6. Os biomateriais utilizados em andaimes imitam o ECM nativo, fornecendo as pistas físicas, químicas e biológicas para remodelação celular guiada7. O colágeno é uma das proteínas mais abundantes obtidas a partir da dermis, tendão, intestino e pericárdio8,9. Além disso, o colágeno pode ser obtido como biopolímero para produzir andaimes bi e tridimensionais através de bioimpressão ou eletropinning10,11. Este grupo é o primeiro a relatar o uso de colágeno de uma fonte óssea para a regeneração do tecido hepático. Outro estudo relata o uso de andaimes sintetizados a partir de colágeno bovino, obtido a partir da pele, com poros homogêneos e situados de perto, sem qualquer comunicação entre eles12.

A descelularização preserva o ECM nativo, permitindo a posterior incorporação de células com potencial de células-tronco13,14. No entanto, este procedimento ainda está em fase experimental no fígado, coração, rim, intestino delgado e bexiga urinária de camundongos, ratos, coelhos, porcos, ovelhas, bovinos e cavalos3,14. Atualmente, o volume de massa hepática ressectado não é substituído em nenhum dos modelos de hepatectomia animal. No entanto, o uso de suporte adicional ou rede (biomateriais) que permita a proliferação celular e a angiogênese pode ser essencial para a pronta restauração das funções paramicírmicas hepáticas. Assim, os andaimes poderiam ser empregados como abordagens alternativas para regenerar ou reparar tecidos em doenças hepáticas crônicas, eliminando limitações devido à doação e às complicações clínicas do transplante hepático.

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Protocolo

A presente pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina (DI/115/2015) da Universidade Nacional Autónoma de México (UNAM) e pelo comitê de ética do Hospital Geral do México (CI/314/15). A instituição cumpre todas as especificações técnicas para a produção, cuidado e uso de animais de laboratório e é legalmente certificada por lei nacional (NOM-062-ZOO-1999). Ratos Wistar machos pesando 150-250 g (6-8 semanas de idade) foram obtidos do Laboratório de Instalações Animais da Faculdade de Medicina da UNAM, para este estudo.

1. Obtenção de andaimes de matriz de colágeno a partir do fêmur bovino

  1. Obtenha o condíle do fêmur bovino de um matadouro certificado pelas autoridades sanitárias e agrícolas do México.
    1. Disseca cuidadosamente a gordura, músculo e cartilagem com um instrumento cirúrgico. Corte os fragmentos de condíle em fragmentos de 3 cm x3 cm usando um cortador de serra e limpe a gordura e o sangue com uma toalha. Lave os fragmentos de condíle com água.
    2. Ferva (92 °C) os fragmentos com 1 L de detergente aniônico (10 g/L) por 30 min. Lave os fragmentos de condíle duas vezes para remover quaisquer restos do detergente aniônico.
    3. Seque os fragmentos de condíle por 3 h usando papel filtro (0,5 mm).
  2. Prepare um triangular (1 cm x1 cm x1 cm) CMS de espessura 0,5 cm dos fragmentos mencionados na etapa 1.1 (Figura 1A).
    1. Desmineralize os fragmentos em 100 mL de 0,5 M HCl por 10 min com agitação constante. Remova o HCL.
      NOTA: Neutralizar o HCl com hidróxido de sódio (10 M).
    2. Enxágüe os fragmentos três vezes com 100 mL de água destilada, 15 min cada vez, com agitação constante. Seque o CMS com papel filtro (0,5 mm) por 1h.
    3. Use um microscópio estéreo15 para analisar as propriedades estruturais do CMS (tamanho dos poros, formação de poros e interconexão porosa)(Figura 1B).
    4. Use um microscópio eletrônico de varredura16 para analisar a superfície áspera da trabecula cms(Figura 1C).
    5. Utilize o instrumento de dissecção para mistura e alongamento para avaliar as alterações mecânicas (plasticidade e flexibilidade) do CMS(Figura 1D).
    6. Embale o CMS na bolsa de esterilização e esterilize-o com plasma de peróxido de hidrogênio por 38 minutos. Armazene o CMS estéril na embalagem original em uma área seca a 20-25 °C até usar.

2. Preparação da área cirúrgica e manuseio e preparação do modelo animal

  1. Higienize a área cirúrgica, mesa de trabalho, microscópio de microcirurgia e assento com solução de clorexidina de 2%. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, esponja cirúrgica, cotonetes e cortina cirúrgica descartável através da esterilização térmica (121 °C/30 min/100 kPa)
  2. Atribua os ratos (n=5) em três grupos de cinco ratos por grupo: 1. sham, 2. hepatectomia e 3. hepatectomia mais CMS, e siga todos os grupos nos dias 3, 14 e 21 dias.
    1. Administrar cetamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro.
      NOTA: O período sedativo normalmente dura de 30-40 min.
    2. Raspe a pele abdominal (5 cm x 2 cm) usando sabão cirúrgico e uma lâmina de dois gumes, e desinfete a pele usando solução tópica de 10% de povidona-iodo em três rodadas17.
    3. Coloque o animal em uma placa quente na posição decúbito dorsal, com o pescoço hiperextendido para manter uma via aérea permeável(Figura 2).
    4. Avalie a profundidade da anestesia através do padrão respiratório e perda do reflexo de abstinência nos membros.
    5. Coloque uma cortina cirúrgica descartável ao redor da pele raspada e faça uma incisão (2,5 cm) na linha albous com um bisturi, usando o processo xifoide como ponto de referência. Evite o vaso sanguíneo da parede abdominal para evitar sangramento.
    6. Coloque o retítil abdominal no lugar e observe a cavidade abdominal. Utilizando as fórceps de dissecção, extraia o lobo hepático esquerdo e coloque-o na placa metálica(Figura 3A).
      NOTA: No grupo falso, apenas extraia o lobo hepático esquerdo e depois devolva o fígado para a cavidade abdominal. Sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0.
    7. Nos grupos experimentais com e sem CMS, utilize uma lâmina de bisturi e lâmina de bisturi estéril (nº 15) para realizar hepatectomia (aproximadamente 40%) com dois cortes. Use um modelo metálico triangular (1 cm x 1 cm x 1 cm) para realizar a hepatectomia(Figura 3B).
    8. Para evitar sangramento no fígado, mantenha a compressão cirúrgica com um cotonete na borda do fígado por 5 minutos.
    9. Hidrate o CMS em solução salina estéril por 20 minutos antes do procedimento cirúrgico. Implante o CMS no sítio de hepatectomia com quatro suturas de pontos entre o tecido hepático e o CMS para evitar o deslocamento do bioma material. Use 7-0 suturas de polipropileno não absorvíveis(Figura 3C).
      NOTA: Não remova as suturas em uma segunda cirurgia; as suturas podem ser usadas como referência para identificar o local de implantação de CMS.
    10. Devolva o fígado à cavidade abdominal e sutura a parede abdominal e a pele com uma sutura de nylon 3-0. Limpe a incisão cirúrgica com uma esponja cirúrgica encharcada de iodo em duas rodadas. Observe e monitore os sinais vitais dos animais.

3. Cuidados pós-operatórios

  1. Administre a flunixina de meglumina (2,5 mg/kg) intramuscularmente no membro traseiro. Administrar analgésicos conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
  2. Para recuperação da anestesia, coloque os animais em caixas individuais de policarbonato com cama de animal de laboratório em uma área livre de ruídos com controle de temperatura (23 °C).
  3. Observe a recuperação dos animais e monitore seu consumo de água e alimentos por 2h. Monitorar animais postados operativamente conforme aprovado pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.

4. Avaliação da função hepática no soro

  1. Coletar amostras de sangue (500 μL) das veias traseiras laterais dos animais anestesiados antes do procedimento cirúrgico (valores de linha de base) e nos dias de avaliação 3, 14 e 21.
  2. Centrifugar as amostras de sangue a 850 × g/10 min em temperatura ambiente (23 °C); separe o soro e armazene-o a -80°C até usar.
  3. Realize um painel de testes de função hepática: albumina s sorocabana (ALB), fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), aminotransferase aspartate (AST), bilirrubina total (TB) e bilirrubina direta (DB)(Tabela 1).

5. Eutanásia e manejo de tecidos

  1. Anestesiar os animais para cada avaliação (dias 3, 14 e 21) seguindo o protocolo descrito acima.
  2. Eutanize através de métodos aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
  3. Realize uma incisão (5-6 cm) na linha albous com um bisturi para observar os órgãos da cavidade abdominal e tirar fotografias da área de hepatectomia da farsa e dos grupos experimentais, com e sem o CMS.
  4. Pegue amostras hepáticas (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) de todos os animais do grupo de estudo e coloque-as em uma solução de formaldeído de 4% para 24h para avaliação histológica subsequente.

6. Análise histológica

  1. Preservar os tecidos hepáticos em 4% de formaldeído e desidratar o tecido usando uma série de concentrações de álcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); colocá-los em xileno (1h) e incorporá-los na parafina16.
  2. Corte os blocos de parafina com um microtome em seções de 4 μm de espessura para a preparação de oito slides.
  3. Executar h&E e masson's tricromo mancha16.
  4. Observe as seções manchadas sob um microscópio leve para selecionar as áreas representativas do fígado, com e sem CMS. Obtenha fotomicrografias em 4x, 10x e 40x de ampliação e processe as imagens usando o software apropriado18 (ver a Tabela de Materiais).

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Resultados

A desmineralização óssea afeta as propriedades mecânicas do CMS sem alterar a forma original ou a interconexão de seusporos. O CMS pode ter qualquer forma e, portanto, pode ser ajustado ao tamanho e forma do órgão ou tecido selecionado19. No presente protocolo, utilizamos um CMS triangular (Figura 1A-D). Foi utilizado um modelo de rato para avaliar a capacidade regenerativa do xenoimplant CMS no fígado. Embora o fíga...

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Discussão

O transplante de órgãos é o pilar do tratamento em pacientes com fibrose hepática ou cirrose. Alguns pacientes se beneficiam desse procedimento, tornando necessário fornecer alternativas terapêuticas para os pacientes na lista de espera. A engenharia de tecidos é uma estratégia promissora que emprega andaimes e células com potencial regenerativo2,4,13. A remoção de uma porção do fígado é um passo crítico neste procedimento devid...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Benjamín León-Mancilla é doutorando pelo Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa DGAPA-UNAM.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao pessoal do Laboratório de Instalação Animal da Unidade experimental de Medicina, enfermeira Carolina Baños G. pelo apoio técnico e cirúrgico, Marco E. Gudiño Z. pelo apoio em microfotografias, e Erick Apo pelo apoio na histologia hepática. O Conselho Nacional apoiou esta pesquisa de Ciência e Tecnologia (CONACyT),o número de subvenção SALUD-2016-272579 e o PAPIIT-UNAM TA200515.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Detergente aniônicoAlconoxZ273228
de biópsiaLeica3802453
Câmera DMXNikonDXM1200F
CentrífugaEppendorf5424
Gluconato de clorexidina 4%BD372412
Óculos de cobertura 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Álcool etílico, puroSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixina meglumidaMSDQ-0273-035
Lâminas de vidro 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxilinaMerckH9627CAS 571-28-2
Ácido clorídrico 37%Merck339253CAS 7647-01-0
CetaminaPisa agropecuáriaQ-7833-028
Microscópio de luzNikonMicrophoto-FXA
Microcirurgia estereomicroscópioZeissOPMI F170
Microtainer capa amarelaBeckton Dickinson365967
micrótomoLeicaRM2125
Animal modelo: ratos WistarUniversidad Nacional Autó noma de Mé xico
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polipropileno 7-0AtramatSE867/2-60
Povidona-iodo10% solução cutâneaDiafra SA de CV1.37E+86
Microscópio eletrônico de varreduraZeissDSM-950
Hidróxido de sódio, pelletsJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
EstereomicroscópioLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe de 1 mL com agulha (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Processador de tecidos ( Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Incorporador de tecidos)Sakura Finetek USA5229
Kit de coloração tricrômicaAnalisador Sigma-AldrichHT15
Unicell DxC600Beckman CoulterBC 200-10
XilazinaPisa agropecuáriaQ-7833-099
XilenoSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

Referências

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