Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הקמת מערכת אקולוגית של תמנון למחקר ביו-רפואי וביו-הנדסה

Published: September 22, 2021 doi: 10.3791/62705
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

Summary

הבנת המבנים הפיזיולוגיים והאנטומיים הייחודיים של תמנונים יכולה להשפיע מאוד על המחקר הביו-רפואי. מדריך זה מדגים כיצד להקים ולתחזק סביבה ימית כדי להכיל מין זה וכולל הדמיה חדשנית וגישות אנליטיות כדי לדמיין את האנטומיה והתפקוד של מערכת העצבים של התמנון.

Abstract

התפתחויות רבות במחקר הביו-רפואי הושפעו מגילוי מנגנונים אנטומיים ותאיים התומכים בתפקודים ספציפיים במינים שונים. התמנון הוא אחד מאותם בעלי חיים יוצאי דופן שהעניקו למדענים תובנות חדשות על תחומי מדעי המוח, רובוטיקה, רפואה רגנרטיבית ותותבות. מחקר עם מין זה של צפלופודים דורש הקמת מתקנים מורכבים וטיפול נמרץ הן לתמנון והן למערכת האקולוגית שלו שהיא קריטית להצלחת הפרויקט. מערכת זו דורשת מערכות סינון מכניות וביולוגיות מרובות כדי לספק סביבה בטוחה ונקייה עבור החיה. יחד עם מערכת הבקרה, תחזוקה וניקוי שגרתיים מיוחדים נדרשים כדי לשמור ביעילות על המתקן פועל לטווח ארוך. מומלץ לספק סביבה מועשרת לבעלי חיים אינטליגנטיים אלה על ידי שינוי הנוף של הטנק, שילוב מגוון טרף, והכנסת משימות מאתגרות עבורם לעבוד. התוצאות שלנו כוללות MRI והדמיה אוטופלואורסצנטית לכל הגוף, כמו גם מחקרים התנהגותיים כדי להבין טוב יותר את מערכת העצבים שלהם. לתמנונים יש פיזיולוגיה ייחודית שיכולה להשפיע על תחומים רבים במחקר הביו-רפואי. לספק להם מערכת אקולוגית בת קיימא הוא הצעד המכריע הראשון בחשיפת היכולות הייחודיות שלהם.

Introduction

מושגים חדשים במחקר ביו-רפואי ובהנדסה ביו-רפואית מושפעים לעתים קרובות מזיהוי אסטרטגיות ספציפיות שיש למינים ביולוגיים כדי להתמודד עם תנאים ואתגרים סביבתיים ופיזיולוגיים. לדוגמה, הבנת תכונות הפלואורסצנטיות בגחליליות הובילה לפיתוח חיישנים פלואורסצנטיים חדשים שיכולים לדווח על פעילות תאית באורגניזמים מודל אחרים1; זיהוי תעלות יונים המופעלות על ידי אור באצות הובילה להתפתחות של תאית וטמפורלית ספציפית אור מבוסס אור-neuromodulation2,3,4,5; גילוי חלבונים שפמנון זכוכית המנווטים על פי השדה המגנטי של כדור הארץ הוביל להתפתחות של נוירומודולציה מגנטית-מבוססת6,7,8,9,10,11; הבנת רפלקס הסיפון באפליסיה סייעה להבנת הבסיס התאי להתנהגות12,13,14.

החוקרים ממשיכים להרחיב על ההנדסה הביולוגית הנוכחית וארגז הכלים הפילוגנטי על ידי ניצול נקודות החוזק הייחודיות ונקודות המבט החדשניות על פונקציות פיזיולוגיות שמינים מעבדה לא קונבנציונליים מחזיקים. סוכנויות פדרליות מתחילות לתמוך בקווי מחקר אלה על ידי מימון עבודה חדשנית המבוצעת על מינים מגוונים.

סוג אחד של בעלי חיים בעלי יכולות אנטומיה והתחדשות ייחודיות, כמו גם השליטה הסתגלותית של כל אחת מזרועותיו, ביולוגים ומהנדסים מרתקים, וקהלים שובי לב מכל חלקי החברה הוא התמנון 17. ואכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה וההתנהגות של התמנון נחקרו בעשורים האחרונים15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . עם זאת, ההתפתחויות האחרונות בביולוגיה מולקולרית ואולוציונית, רובוטיקה, הקלטת תנועה, הדמיה, למידת מכונה ואלקטרופיזיולוגיה מאיצות תגליות הקשורות לפיזיולוגיה והתנהגות תמנון ומתרגמות אותן לאסטרטגיות ביו-הנדסה חדשניות27,28,29,30,31,32,33,34,35 36,37,38,39.

כאן אנו מתארים כיצד להקים ולתחזק גידול תמנון, אשר יהיה עניין ורלוונטי למדענים ומהנדסים מרקעים שונים, תחומי עניין מדעיים, ומטרות. עם זאת, התוצאות שלנו מתמקדות ביישום תמנונים במדעי המוח ובמחקר הנדסה עצבית. לתמנון מערכת עצבים מפותחת מאוד עם 45 מיליון נוירונים במוח המרכזי, 180 מיליון נוירונים באונות האופטיות, ו-350 מיליון נוירונים נוספים בשמונת חבלי צירי וגרעינים היקפיים; לשם השוואה, לכלב יש מספר דומה של נוירונים וחתול רק חצי ממנו40. שלא כמו מערכת העצבים החולייתית, ישנם רק סיבים 32K efferent ו 140K afferent המחברים את מיליוני הנוירונים במוח התמנון למיליוני נוירונים בכל אחד מהסיבים ציריים של זרועם40,41,42. סיבים יחסית אלה יחסית מחוברים מצביעים על כך שרוב הפרטים לביצוע התוכניות המוטוריות מבוצעים בלב צירי עצמו, תוך שים דגש על השליטה העצבית המופצת באופן ייחודי שיש לתמנונים. לזרועות התמנון יש שליטה מוטורית עדינה ויוצאת דופן המאפשרת להם מיומנויות מניפולציה כגון פתיחת מכסי צנצנת, גם כאשר הם נמצאים בתוך המיכל. יכולת מוטורית מפותחת זו ייחודית לסוג של צפלופודים (תמנון, דיונון ודיונונים)43.

ואכן, באמצעות מאות מיליוני שנות אבולוציה, פיתח התמנון מערכת גנום ופיזיולוגית יוצאת דופן ומתוחכמת43,44, שהעניקה השראה להתפתחות ולהתקדמות חדשות בתחומי המדע וההנדסה. לדוגמה, תיקון דבק עמיד במים המבוסס על המבנה האנטומי של פראיירי התמנון יכול להיצמד למשטחים רטובים ויבשים45; חומר הסוואה סינתטי בהשראת עור ההסוואה של התמנון יכול להפוך משטח שטוח ודו-ממדי למשטח תלת מימדי עם בליטות ובורות46. רובוטים רכים ואוטונומיים זעירים (כלומר, אוקטובוטים) שבעתיד יוכלו לשמש ככלים כירורגיים בתוך הגוף47; וזרוע (כלומר, OctoArm) המחוברת לרובוט דמוי טנק48 פותחו גם הם. מינים רבים של תמנונים משמשים במחקר ביו-רפואי למשל, תמנון וולגאריס, תמנון סיננסיס, אוקטופוס variabilis, ו תמנון bimaculoides (O. bimaculoides); O. וולגרי ו O. bimaculoides להיות הנפוץ ביותר 34,49,50. הרצף האחרון של גנומים תמנון שונים עושה סוג זה של עניין מיוחד ופותח גבולות חדשים במחקר תמנון34,43,51,52.

O. bimaculoides המשמשים בהקמה שלנו הוא מין בגודל בינוני של תמנון, שהתגלה לראשונה בשנת 1949, שניתן למצוא במים רדודים מול חופי צפון מזרח האוקיינוס השקט ממרכז קליפורניה לדרום חצי האי באחה קליפורניה17. זה יכול להיות מזוהה על ידי כתמי עיניים כוזבים על המעטפת שלה מתחת לעיניו. בהשוואה לתמנון ענק באוקיינוס השקט (Enteroctopus dofleini) ולתמנון המשותף (O. vulgaris), התמנון הדו-ספוט של קליפורניה (O. bimaculoides) קטן יחסית, מתחיל קטן מכמה סנטימטרים, גדל במהירות כצעיר. כאשר גדל בתוך מעבדה, גודל המעטפת למבוגרים יכול לגדול לגודל ממוצע של 100 ס"מ ולשקול עד 800 g53,54. לתמנונים יש תקופת צמיחה מהירה ב-200 הימים הראשונים שלהם; עד אז, הם נחשבים למבוגרים וממשיכים לגדול לאורך כל חייהם55,56,57. תמנונים יכולים להיות קניבליסטיים, במיוחד כאשר שני המינים שוכנים יחד בתוך טנק; לכן, הם צריכים להיות שוכנים בנפרד בטנקים נפרדים58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן סטייט.

1. הגדרת ציוד טנק תמנון

  1. ראשית, להשיג את כל החומרים הלא ביולוגיים עבור אקווריום שישולב במערכת הסביבתית הימית, כפי שמוצג בטבלת החומרים. הגדלים מסופקים באינצ'ים.
  2. לשטוף את כל צינורות, צנרת, ומערכת מסנן חלקים עם 70% אתנול ו deionized (DI) מים לפני ההתקנה. אין להשתמש בסבון או בכימיקלים אחרים בעת הניקוי.
  3. הנח שולחן פיברגלס בגודל 13 אינץ' x 49 אינץ' x 1/2 אינץ' (חלק #71) עם ארבע רגלי שולחן עשויות סיבי פחמן ועם מידות של 2 אינץ' x 2 אינץ' x 23 אינץ' (חלק #72). חברו את הרגליים ישירות מתחת לפינות השולחן.
  4. מתחת למשטח העליון, בין כל אחת מרגלי השולחן, מניחים גשרי ייצוב סיבי פחמן באורך 2 אינץ' על 2 אינץ' (חלק #72) המחוברים לחלק התחתון של השולחן ישירות על קצה המדף העליון. צרף עם ברגים מדף אחר עם אותם ממדים ישירות על הקרקע מתחת לשולחן. תן למשאבה (ראה שולחן חומרים) לשבת ישירות על משטח המדף התחתון בזמן שהמיכל יושב על המשטח העליון. מערכת זו מוצגת באיור 1.
    הערה: תפוקת המים מהמיכל ניזונה מכבידה וכל הצינורות, למעט אלה הניזונים פנימה והחוצה מהמיכל, צריכים להיות נמוכים יותר מתחתית המיכל כדי להבטיח לחץ ראש ניקוז מרבי.

Figure 1
איור 1: התקנת טנק תמנון. מפרצון מים ושקע (א). שלושה מיכלי תמנון כל אחד עם שטח של 1.22 מ 'x 0.3 מ '(b). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. לקדוח חור יחיד 13/4 אינץ ', 2 אינץ 'מאחד הצדדים של הטנק, באמצעות מקדחות חיתוך זכוכית. החלק התחתון של מסך היניקה של תפוקת המים יקבע את גובה חור הפלט כפי שמוצג בצד ימין של איור 2a. מפלס המים ייקבע על ידי מסך היניקה ויהיה צורך להיות לפחות 6 אינץ 'מראש המיכל המאפשר אזור התזה מים.
  2. השתמש בפריימר PVC ובמלט כדי לחבר לצמיתות את המקטעים. כדי לעשות זאת, ראשית, להחליק את הקצה של צינור PVC זכר המיועד לסוף הצינור הנשי. מניחים פיסת סרט של ציירים בצד החיצוני של החלק הגברי שעדיין נראה לעין כדי למנוע מהפריימר והמלט להופיע בצד החיצוני של הצינור. להפריד את החלקים לאחר ההקלטה ומניחים שכבה קלה של פריימר בצד החיצוני של הצינור הגברי בעקבות היישום של המלט באותו אזור.
  3. להתאים מחדש את הצינור הגברי לתוך הצינור הנשי, בהקדם האפשרי, לאחר היישום של מלט ולהסיר את הקלטת. 24 שעות לאחר היישום של פריימר ומלט, לשטוף חלקים מחוברים חדשים עם מי DI. לזמן ריפוי להסתכל על מוצר המלט לכיוונים נוספים.
    הערה: ודא את ההתקנה של כל צינורות וציוד ממוקם כראוי לפני השימוש פריימר PVC ומלט; דרישות אורך הצינור עשויות להשתנות.
  4. לאחר מכן, חבר לצמיתות את הקצה החיצוני (OD) בקוטר 1 אינץ' של מסך היניקה לקצה הקוטר הפנימי (ID) של מפרק המרפק בקוטר 1 אינץ'. חבר את קצה מפרק המרפק לצינורות PVC ישרים (1 אינץ 'OD). חבר את הצד השני של הצינורות הישרים ולאחר מכן למזהה 1 אינץ 'של המתאם הישר דרך הקיר שקע נקבה להתחבר.
    הערה: המזהה מתייחס למרחק הרחב ביותר בין הקירות הפנימיים של הצינור. OD מתייחס לחלק החיצוני של רוחב הצינורות.
  5. חבר לצמיתות את המתאם הישר דרך הקיר לצינור PVC באורך 4 אינץ' ישר עם מנת יתר בגודל 1 אינץ' (החל מהשלב 1.8). הצינור הזה יפנה אל מחוץ למיכל.
  6. חבר לצמיתות את הצינור הישר למרכז מחבר PVC (בצורת Tee מזהה 1 אינץ'; מהשלב 1.9). לאחר מכן, חבר לצמיתות שני צינורות באורך 6 אינץ' (חלק #69) (OD של 1 אינץ') לשני הקצוות הנגדיים של מחבר הטי-אחד הפונה ישירות למעלה לשחרור האוויר והשני ישירות כלפי מטה לזרימת מים.
  7. חבר לצמיתות את הצינור הישר המורחב כלפי מטה (החל בשלב 1.10) לצינור תיל שקע נקבה (מזהה 1 אינץ'). חבר צינור גומי באורך 36 אינץ' (מזהה 3/4 אינץ') למתאם הצינור.
  8. מניחים את מערכת הקירור בין צינורות תפוקת המים לבין מערכת sump.
  9. חבר את אביזרי העקיצה בגודל 3/4 אינץ', שמגיעים עם המערכת, ליציאות הקלט והפלט של יחידת הצ'ילר. שים את צינורות הגומי (מ שלב 1.11) על מתקן הכניסה של הצ'ילר.
  10. חברו חתיכה חדשה של צינורות זיהוי בגודל 3/4 אינץ' (החל מהשלב 1.13) מתפוקת הצ'ילר (החל מהשלב 1.12) ועד לתחנוכת מערכת ה-sump כפי שמוצג באיור 2b.
  11. לאחר מכן, הניחו את מסנן הגרביים בגודל 4 אינץ' x 12 אינץ', בגודל נקבובית של 200 מיקרומטר, בשטח המיועד לו כפי שמוצג באיור 2. כמו כן, כפי שמתואר באיור 2, הניחו את רחפן החלבון ואת משאבת החזרה באזורים המתאימים שלהם. יחד עם משאבת ההחזרה, חבר את השסתום הצף העליון האוטומטי לקיר הפנימי של אזור המשאבה, 2 אינץ 'מעל החלק העליון של מפרצון המים של המשאבה; אין לחסום את הסרת המשאבה מהמיכל, במידת הצורך.
  12. חבר לצמיתות צינור ישר באורך 12 אינץ' (3/4 אינץ' OD) לשקע המשאבה (החל מהשלב 1.15). בקצה השני של הצינור הישר 3/4 אינץ', חבר לצמיתות את מנת המנת יתר של הצינור למפרק מרפק של 3/4 אינץ' ID 45°. לקצה השני של המפרק, חברו לצמיתות צינורות OD בגודל 3/4 אינץ'.
  13. חבר את הקצה השני של הצינור הישר (החל בשלב 1.16) למזהה בגודל 3/4 אינץ' של מתאם הפחתה ישר. חבר לצמיתות את קצה המתאם הגדול יותר (2 אינץ'OD) לקלט של אור UV.
    הערה: אורכי הצינורות הישרים עשויים להשתנות.
  14. לאחר מכן, התאם את המיקום של זרם אור UV עם צינור הפלט של המשאבה (החל מהשלב 1.17) כך שהצינור אינו מתעקל בין אור למשאבה (החל מהשלב 1.15). לקדוח חורים לתוך סד הייצוב כדי להתאים את חורי חיבור אור UV. התאם את גודל הברגים למקדחה וחבר את אור ה- UV לשולחן באמצעות הברגים שניתנו.
  15. חבר לצמיתות את הצד בגודל 2 אינץ' של מתאם הפחתת אחר לפלט של אור ה- UV (החל בשלב 1.18). חבר מנת יתר בגודל 1 אינץ' של צינור ישר באורך 5 אינץ' למזהה 1 אינץ' של המתאם. לאחר מכן, חבר חתיכה פינתית של 90° עם מזהה בגודל 1 אינץ' לצינור OD בגודל 1 אינץ'; יש את הקצה הלא מחובר של פיסת הפינה מצביע לכיוון הצד של המיכל שבו קלט המים נועד ללכת (באותו צד כמו בשלב 1.5).
  16. חבר לצמיתות את הקצה השני של הפינה (מהשלב 1.19) לצינור באורך 6 אינץ' (חלק #69) בעל מנת יתר של 1 אינץ' עם הקלט של יחידת בקרת הזרימה (חלק #2). חבר לצמיתות צינור OD נוסף בגודל 1 אינץ' (חלק #69) לפלט של יחידת ניטור הזרימה; האורך חייב להאריך לפחות 3 אינץ 'מעבר לצד של הטנק.
  17. באמצעות מקדח חיתוך זכוכית בגודל 13/4 אינץ' (חלק מס' 1), חתוך חור חדש 3 אינץ' מעל קו המים המיועד ורחוק 2 אינץ' מצד המיכל (איור 1a) בצד שממול לזה שיש לו בור תפוקת מים. חבר מחיצה נוספת דרך הקיר המתאימה עם החלקה בגודל 1 אינץ' (חלק #77) הפונה אל מחוץ למיכל.
  18. לתלוש המחיצה חבר צינור ישר עם מנת מנת יתר בגודל 1 אינץ' ואורך של 4 אינץ' (חלק #69) לצמיתות. צמצם את הצינורות מהחלק האחרון של שלב 1.21 כדי להתאים את המרחק צינורות זה משתרע מהמיכל. חבר לצמיתות צינור 90° (חלק #65) לכל אחד מהצינורות הפתוחים וחתוך צינור ישר OD סופי בגודל 1 אינץ ' (חלק #69) המחבר לצמיתות את שני חלקי הפינה.
    הערה: איור 3 מציג ייצוג פשוט של מערכת האקווריום.
  19. הגדר את שאר מערכת הבקרה (חלק #34), תחילה הרכבה של רצועת הכוח (חלק #53) לשולחן עצמו או לקיר סמוך. לידו הרכבה מודול ניטור הנוזלים (חלק #2).
  20. חבר את חיישן הזרימה, רצועת הכוח וחיישני זיהוי הדליפה למודול. הגדר את נורית הצמיחה (חלק מס' 26) המחובר לסל האצות (איור 2).
  21. חבר את חיישן הזרימה, אור UV, אור גדילה, משאבה ושומן חלבון לחטיף האנרגיה. הגדר את תכנות מערכת בקרת המים בהתאם למדריך של היצרן.
  22. הכן מים מלוחים על ידי ערבוב חצי תערובת מלח זמינה מסחרית עם 1 גלון של אוסמוזה הפוכה (RO) או deionized (DI) מים. הפוך 45 גלונים כדי למלא באופן מלא טנק אחד ומערכת סיכום.
  23. הפעל את המשאבה בתוך בקר זרימת המערכת sump והמשיך להוסיף מים מלוחים עד שהשסתום העליון האוטומטי נמצא במצב כבוי כך שאין צורך במים מתוקים נוספים.
  24. ברגע שהמים מלאים, להפסיק למלא ולהדליק את יחידת צינון המים כדי להגדיר את הטמפרטורה בין 18 °C (50 °F) עד 22 °C (70 °F) מכיוון שזה טווח הטמפרטורה עדיף53 מעלות צלזיוס. תדליק את רחפן החלבון.
  25. מוסיפים 30 ק"ג של אלמוגים כתוש לתחתית המיכל, כמו גם שכבה של אלמוגים כתוש לתחתית פח האצות. הוסיפו מספר סלעים חיים ותוספות אחרות לסביבת התמנון. מניחים חלק עליון כדי לכסות את פתיחת המיכל.
    הערה: סלעים חיים הם אלמוגים מתים המאוכלסים על ידי חיים ימיים מקרוסקופיים כגון חיידקים ואצות.
  26. מוסיפים חיידקים nitrifying המשמשים אקווריומים מים מלוחים לפי ההוראות על האריזה. המשיכו להוסיף זאת לפי ההוראות, בדקו את הטמפרטורה, המליחות, ה-pH, האמוניה, הניטריט והחנקות מדי יום עם ערכות לבדיקת מים, חיישן pH וחיישן טמפרטורה. הערכים הבטוחים לרמות אמוניה, ניטריט וחנקות נמוכים מ-0.5 ppm, 0.25 ppm ו-10 ppm בהתאמה58.
  27. ודא אור UV כבוי במשך הימים חיידקים nitrifying מתווסף כדי לאפשר מיקרואורגניזמים מים מלוחים לגדול. לאחר הפרמטרים נמצאים בטווחים בטוחים, אור UV ניתן להפעיל מחדש.
  28. לאחר הקמת המערכת, בדוק גם כי ה- pH והחמצון הם ב 8.0-8.4 ו Equation 1-59, בהתאמה. לפני הוספת בעלי חיים לאקווריום, בדוק את נוכחותם של כל רמות נחושת וחמצן בתוך המערכת באמצעות ערכת בדיקת מי נחושת.
    הערה: נחושת גורמת נזק חסרי חוליות וזה מפריע osmoregulation בזימים דגים60,61.
  29. אם נחושת נמצאה במים, לבדוק את מקור המים DI / RO. לאחר קביעת כי מקור המים אינו מכיל נחושת, לבצע 30% שינוי מים ומניחים את בלוק הפחמן הפעיל (חלק #46) בתוך המים. אם הבעיה נמשכת, בצע שינוי מים מלא ונקה את כל החלקים.
  30. לאחר שכל הפרמטרים של המים נקבעים להיות בתוך רמות בטוחות, להוסיף 10 שרימפס רפאים למערכת לפחות שבוע לפני הוספת התמנונים. זה יעזור להציג ביומסה עבור חיידקים ולהצביע על איכות המים הכוללת.
  31. הוסף תושבים אקולוגיים אקווריום נוסף לפח האצות. זה כולל Chaetomorpha spp. (אצות ספגטי), Trochus Sp. (חילזון טרקוס מרכב), ומרסרינריה מרקנריה ( צדפות אבן דובדבן).

Figure 2
איור 2: מערכת סיכום. תצוגה צדדית של מערכת הסיכום (א). תצוגה עליונה של מערכת הסיכום (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אקווריום עם מערכת סינון סיכום מתחת למיכל ויחידות הבקרה הסביבתית. חצים ירוקים מצביעים על כיוון זרימת המים במערכת. מים זורמים מסעיף אחד עד שתיים לקירור ועל שלושה כדי להפריד חומר ביולוגי כבד מחומר קל יותר. פסולת כבדה צפה לתחתית והחוצה לחלק חמש בעוד החומר הביולוגי הקטן יותר זורם לתוך מסנן הגרביים בתוך סעיף ארבע. מים זורמים מארבע מתחת לסעיף חמש נכנסים לרפרוף החלבון בשישה כדי להסיר את הפסולת שנותרה בתוך המים. פח האצות מכיל מיקרואורגניזמים לפירוק פסולת, אמוניה וחנקות וכן לחמצן את המים. בחלק האחרון של המערכת, יותר מים מתווספים כדי להסביר את האידוי לפני נשאב בחזרה לתוך המיכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. מיכלי אחסון

  1. הקימו שני מיכלי אחסון מים גבוהים של 60 גלון, אחד למי המלח והשני למי RO. ודא שקו המילוי המרבי של מיכל המים המתוקים גבוה יותר מהשולחן. חבר צינורות בגודל 1/4 אינץ' לחלק העליון האוטומטי של השסתום הצף במערכת sump וצרף את הקצה השני של הצינורות לתחתית מיכל המים המתוקים.
    הערה: זה כדי למלא מחדש אם המים מתאדים. מלח יישאר במים.
  2. ממלאים את מיכל המים המלוחים במים ומוסיפים את כמות המלח היחסית למיכל. יש להזרים ברציפות את מיכל אחסון המים המלוחים לערבוב וחימצון תקין. יש להמתין שעה לפני השימוש כדי להבטיח ערבוב מלא של המלח.
    הערה: מיכל המים המלוחים שימושי למילוי המיכלים לאחר הניקוי.

3. התקנת מיכל מזון

  1. לשמירה על שרימפס בחיים במשך יותר משבוע, לאחסן אותם במיכל נפרד מן התמנון עם המליחות מתחת 30 ppt ואת הטמפרטורה קרובה ל 25 °C (5 °F).
  2. כדי לעשות זאת, שבוע לאחר הבשלת מיכלי התמנון, העבר 8 גלונים של מים מלוחים בוגרים למיכל השרימפס. מוסיפים 15 ק"ג של אלמוגים כתוש לתחתית המיכל. הוסיפו כמה סלעים חיים למיכל כדי להחביא מקומות לתרסיסים (איור 4).
    הערה: מי ים בוגרים מתייחסים לתהליך של מתן אפשרות לחיידקים ימיים לגדול בתוך המים המלוחים כפי שמוצג בשלב 1.30.
  3. חבר מסנן מיכל לקצה המיכל. הגדר את מסנן המיכלים לפי הוראות היצרן. הוסף משאבת אוויר ליד המיכל המחובר לצינור עם אבן אוויר מחוברת שהוכנסה למיכל.
  4. נקה את המסנן ושנה את רפידות המסנן מדי שבוע. כמו כן, 25% מהמים יצטרכו להשתנות בו זמנית. בדוק פרמטרים חנקן, pH, וטמפרטורה מדי יום במיכלי המזון עם ערכות בדיקת מים כמתואר בשלב 1.30. אם הפרמטרים של חנקן המים נשארים גבוהים, בצעו שינויים נוספים במים והוסיפו שקית סופגת חנקן למים; או אם הבעיות נמשכות יותר מחודש, יהיה צורך להעביר את השרימפס למיכל גדול יותר.
  5. מוסיפים שרימפס ברגע שמכתם אלמוגים כתוש מתפוגג. כדי להוסיף שרימפס הראשון, עם ההגעה, להעביר את השרימפס מבלי לשלוח מים למיכל מים מלוחים קטן במשך 5 דקות כדי להסיר biowaste. לאחר מכן, ניתן להוסיף את השרימפס ישירות למיכל. ניתן להוסיף דגי יתושים ישירות למיכל השרימפס.
    הערה: ניתן לרכוש דגי שרימפס ויתושים מכל ספק מסחרי של בעלי חיים הרשומים על גיליון החומרים או ספקי מזון אחרים. אפשר גם להציע תמנונים שרימפס מופשר.
  6. להאכיל שרימפס ודגים עם פתיתי דגים, צמחייה מתה, או אצות62, לפי הוראות מזון.
  7. למיכל הסרטנים, מוסיפים 1 גלון של מים מלוחים ו -10 ק"ג של חלוקי נחל. עורמים את חלוקי האבן בצד אחד ומשאירים אדמה יבשה בצד אחד ו-2 ס"מ של מים מלוחים בצד השני (כפי שצוין באיור 4). הפרמטרים האופטימליים של מים סביבתיים עבור חסרי חוליות אלה צריכים להיות 30-35 ppt ו 22-25 °C (70 °F) עבור מליחות וטמפרטורה11,63, בהתאמה.
  8. הוסיפו סרטני כנר ישירות למיכל (איור 4). סרטנים יבלו את רוב חייהם על היבשה, אך יוכלו להיות מתחת למים במשך כמה ימים בכל פעם, מה שהופך את הטנק שנמצא בחלקו מתחת למים חיוני להישרדותם ארוכת הטווח.
  9. להאכיל סרטני כנר פעם ביום על ידי הוספת פתיתי דגים לתוך המנה על האזור היבש של הטנק. לנקות מדי שבוע על ידי הסרת סרטנים ושינוי 100% של מים מלוחים. תנקה את חלוקי האבן.
  10. יש לאחסן רכיכה ימית (צדפות ומולים) בתוך מיכלי המים המלוחים כדי שהתמנונים יפתחו את עצמם ויספקו מנגנון סינון מים נוסף64.
  11. מניחים מולים בתוך מיכל נפרד פנוי בשבוע הראשון כדי להימנע מהנחת עומס פסולת מיותר על מערכת הסינון של מיכל התמנון.
    הערה: בעוד מולים היו המזון המועדף על התמנון, הם נוטים יותר למות זמן קצר לאחר ההגעה ויגדילו באופן משמעותי את הפסולת הביולוגית בתוך המיכל אם הם נוכחים בכמויות גדולות.

4. הקדמת תמנון למיכל

  1. ודא שרמות האמוניה, הניטריט והחנקות נמוכות מ-0.5 ppm, 0.25 ppm ו-10 ppm בהתאמה. יש משאבת יד מים זמין כדי להסיר דיו תמנון מן הטנק. מומלץ גם שני אנשים להליך זה.
  2. עם ההגעה, מניחים את השקית על הסולם ומפחיתים את משקל השקית לאחר הסרת התמנון. מוסיפים אבן אוויר לשקית כדי להגדיל את חמצון המים תוך העברת החיה למיכל שלהם. מדדו את טמפרטורת המים ואת המליחות של מי המשלוח. תיעד מקרים של מחלה ממושכת לאחר המשלוח.
    1. מבלי להעביר מים מהתיק למיכל, תלו את שקית התובלה מעל פינת המיכל כשהשקית שקועה חלקית במי המיכל כדי להתחיל לשנות את הטמפרטורה של תיק ההובלה. מוציאים 10% מהמים מהתיק וזורקים את הכיור. מוסיפים את אותה כמות מים מהמיכל לשקית. חוזרים על הפעולה כל 10 דקות עד שטמפרטורת המים בשקית שונה לא יותר מ-1° מטמפרטורת המים במיכל.
    2. לאחר הפרש הטמפרטורה של התיק ואת הטנק הם בתוך 1 °, להבטיח כפפות שחוקים כדי להעביר את התמנונים למיכל האישי שלהם. כדי לזוז, מניחים את שתי הידיים מתחת לתמנון כדי לספק תמיכה במהלך ההעברה; האדם השני יצטרך למשוך בעדינות את זרועות היניקה מצד השקית.
    3. ברגע שהתמנון יוצא מהשקית, העבירו אותו במהירות למים של בית הגידול החדש שלו ומעבירים כמה שפחות מים משקית המשלוח. השתמש במשאבת היד כדי להסיר כל דיו התמנון משחרר כאשר במיכל. עכשיו לשקול את השקית עם מים כדי לקבל משקל משוער של החיה.
  3. במשך השבועיים הראשונים לאחר ההגעה, לעקוב אחר הצריכה היומית של התמנון זה צריך להיות סביב 4% עד 8% ממשקלו58,65,66. התמנון צריך להיבדק ארבע פעמים ביום; זה יכול להיות מופחת פעמיים ביום לאחר 2 שבועות. שוקלים כל שבועיים כדי להתאים את צריכת המזון שלהם לפי הצורך.
    הערה: מינים מסוימים של תמנון ידועים לברוח מן הטנק שלהם, ולכן מומלץ לשים משקל 2.5 ק"ג על המכסה של הטנק שלהם.

5. טיפול יומיומי

  1. באמצעות ערכת בדיקת מים מלוחים זמינה מסחרית עבור pH, אמוניה, ניטריט וחנקות, להוסיף את הכמות מכוונת הערכה של מי טנק לארבע המבחנות המסופקות עם הערכה. כפי שצוין בערכת הבדיקה, הוסף את כמות המגיב הצבעוני לצינור המתאים.
  2. אם רמות האמוניה, הניטריט והחנקות הן מעל 0.5 ppm, 0.25 ppm ו- 10 ppm בהתאמה, לשטוף את הביומסה מתוך מסנן הגרביים או לשנות למסנן גרביים חדש. בנוסף, לנקות ביומסה מראש הרחפן עם מברשת ולהוסיף חיידקים ג'ינס נוספים למיכל. אם הבעיות נמשכות, אז להחליף 25% של מים מלוחים מתוקים.
    הערה: השלבים לעיל מפחיתים תרכובות חנקן בתוך המערכת האקולוגית.
  3. הסר את כל פגרי הסרטן והשרימפס המתים מהמיכל, כמו גם כל חומר צואתי תמנון באמצעות משאבת יד. מוציאים את כל הסרטנים החיים הנותרים מהמיכל ומעבירים אותם בחזרה למיכל האחסון. לאחר מכן, סדר מחדש חפצים גדולים בתוך המיכל.
  4. הצג מחצית ממספר הסרטנים שהתמנון יאכל מדי יום למיכל במשקל 1.25 +/- 0.25 גרם. להאכיל שרימפס מופשר או סרטני כנר זכר קטנים לתמנונים צעירים. בהתאם לניסוי, סרטנים ושרימפס ניתן להציג בכל מקום במיכל או לתמנון ישירות.
    הערה: צריכת המזון היומית של התמנונים היא 4%-8% ממשקלם67. שרימפס קפוא יכול להיות מסופק גם כמקור מזון המבוסס על משקל התמנון.
  5. תציע חמישה חסילונים רפאים מדי יום. בממוצע, שלושה נצרכו בניסוי זה. כדי לספק מגוון רחב של מזון לתמנון, לתת צדפה חיה אחת או מולים פעם בשבוע ותמיד לשמור על שלושה דגי יתושים בתוך הטנק.
    הערה: אין צורך לתת לבעלי החיים מגוון מזון ויכול למנוע מבעלי חיים להיות פיתה על ידי מזון במהלך ניסויים. לוח הזמנים האכלה המשמש כאן כדי לפקח בצורה הטובה ביותר על האכלה תמנון והתנהגות היא להציג מחצית ממספר הסרטנים המבוססים על משקל ולהגדיל את מספר השרימפס לחמישה בבוקר. בערב, הציגו את המחצית השנייה של הסרטנים למיכל.

6. תברואה שבועית

  1. כבה את אורות הרחפן, המשאבה ופח האצות לפני ניקוי מערכת הסיכום. לאחר מכן, לכבות את השסתום האוטומטי של המערכת לפני הסרת מים. לבסוף, להסיר את הרחפן ואת כל המים רק ממערכת sump.
  2. לשפשף קלות את פח האצות כדי להסיר את רוב הביומסה מקירותיה. נקו את שאר אזור הסיכום בעזרת מברשת. הסר את מסנן הגרביים, לנקות עם חומץ, ולתת לו להתייבש; להסתובב עם מסנן גרביים אחר בכל שבוע החלפה עם חדשים כל שלושה חודשים. הסר ונקה ביומסה מהחלק העליון של הרחפן שבועי.
    הערה: הימנע משימוש במתכת לניקוי הפלסטיק מכיוון שהוא ייצור שריטות שעלולות להיות מועדות לצמיחה מיקרוביאלית.
  3. מחזירים את הרחפן למערכת ומתחילים למלא במים מלוחים. כאשר אזור המשאבה מתחיל להתמלא, ניתן להפעיל שוב את כל המערכות. הפסק להוסיף מים כאשר החלק העליון האוטומטי של שסתום צף הוא במצב כבוי.

Figure 4
איור 4: טנק לסרטני כנר (מינוקה פוגנקס). תחתית המיכל מיועדת למחצה למיטה יבשה והחצי השני ל-2 ס"מ של מים מלוחים רדודים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: טנק לשרימפס רפאים (פאלאמפונטס פאלדוסוס). סלעים במיכל השרימפס מספקים מקומות לשרימפס להסתתר ולהיפלט, כמו גם לצמיחת מיקרואורגניזמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

7. טיפול בבעלי חיים חשויים

  1. עקבו אחר המדריך reference66 כדי להעריך את בריאות התמנון.
    הערה: עבור תמנונים נקבה, מחזור סוף החיים מתחיל בדרך כלל לאחר הטלת ביצים. בעל החיים יתחיל להפחית את צריכת המזון ויפסיק לאכול לגמרי ויהפוך ליותר רדים. תוחלת החיים לאחר תהליך סוף החיים משתנה. לא ניתן לנקוט בפעולה נוספת מלבד האכלה וניטור של החיה. זכרים סנסנטים יפחיתו את צריכת המזון ויהפכו לרדומים68.

8. הרדמה תמנון

  1. בצע הרדמה תמנון כמפורט באטלר-סטרובן ואח '69.
  2. קבל מיכל 6 L עם מכסה כי הוא לפחות 15 ס"מ גבוה. מניחים 4 ליטר מים ישירות ממיכל התמנון לתוך המיכל ומספקים אוויר עבור 4 ליטר של מים מלוחים באמצעות משאבת אוויר קטנה עם אבן אוויר כדי להפיץ חמצן לסביבת המים58.
  3. לפני הצגת התמנון, להוסיף 1% EtOH למיכל. לפני הטיפול בתמנון, תיעד את מספר הנשימות לדקה על ידי ספירת נשיפה של מים מהסיפון.
    הערה: עבור תמנונים במעבדת החוקרים, הנשימה הבסיסית היא 16 - 24 נשימות לדקה.
  4. לפני הזזת התמנון, יש לתעד את פיגמנטציה העור של התמנון ואת קצב הנשימה הבסיסי. הסר את התמנון מן הטנק באמצעות מיכל פה פתוח 4 L נקי על ידי איסוף אותו עם המים שמסביב.
    הערה: במהלך הרדמה, שיעורי הנשימה אינם מצביעים בהכרח על הרדמה מלאה.
  5. שקול את התמנון בזמן במיכל, ולאחר מכן להזיז אותו על ידי הנחת שתי הידיים סביב גוף התמנון והרמתו. ייתכן שיהיה צורך באדם נוסף כדי להסיר את הגפיים השאיבה מקירות המיכל.
  6. מעבירים במהירות את התמנון למיכל המוכן עם 1% EtOH. סגור את המכסה כדי למנוע בריחה אפשרית.
  7. תיעד את הנשימה של התמנון לדקה על ידי ספירת נשיפה של מים מסיפון בסוף 5 הדקות הראשונות. אם הנשימה נשארת מעל קו הבסיס והחיה ממשיכה להגיב לצביטת אור, הוסיפו 0.25% EtOH נוספים למים. תוספת של אתנול למים יכולה להימשך למקסימום של 3% EtOH.
    הערה: אינדיקציה אחת לכך שהתמנון אינו מודע היא אובדן השליטה שלו בכרומטופופורים שלו. במקרה זה העור נראה חיוור מהרגיל. אינדיקציה נוספת היא לצבוט קלות את הזרועות ולבדוק אם יש תגובה מוטורית. אם עדיין אין תגובה בשלב זה, התמנון אינו מודע, וניתן לבצע ניסויים.
  8. בעוד תחת הרדמה, לפקח על הנשימה והצבע של התמנון כדי להבטיח שהוא נשאר מחוסר הכרה למשך ההליך. אם התמנון מתחיל להתעורר במהלך ההליך, להוסיף 0.25% EtOH נוסף.
  9. לביטול ההשפעות של הרדמה אתנול, להעביר את התמנון למיכל חדש 4 L או גדול יותר של מים מחומצנים ממיכל ההחזקה הקבוע שלה. ברגע שהנשימה חוזרת לשגרה, התמנון הופך לפעיל, ועורו חוזר לפיגמנטים רגילים; אפשר להחזיר אותו למיכל שלו.

9. המתת חסד של תמנון

  1. פעלו על פי הסטנדרטים הבינלאומיים להמתת חסד תמנון כמפורט בפיוריטו ואח ', מולטשניובסקי ואח ', ובאטלר-סטרובן ואח ' 57,58,69.
  2. הכן מיכל 6 ליטר חדש עם 4 ליטר מים ממיכל ההחזקה של התמנון. מערבבים ב-MgCl2 לריכוז של 4% למיכל המתת החסד. בצע צעדים מ 8.1 עד 8.9 כדי להחיש את התמנון.
  3. הזז את התמנון לאחר שלב 8.8 למיכל המתת החסד. לאחר עצירת הנשימה, המתינו 5 דקות ובצעו decerebration של התמנון או לשמור במיכל המתת החסד במשך 5 דקות נוספות.

10. התנהגות של O. bimaculoides

  1. אין להאכיל את התמנון בבקרים כאשר הם יוכשרו להשתמש במיכל מכסה בורג. הגדר התקן הקלטת מצלמה המצביע על האזור המיועד להזנה.
  2. קבל צינור מכסה בורג 50 מ"ל עם חורים בקוטר 1 מ"מ על פני השטח ואת המכסה לזרימת מים בכל המיכל. מניחים סרטן כנר בתוך המיכל. מניחים משקל בתוך המיכל או מחוברים החוצה כדי שהוא יישאר בתחתית המיכל.
  3. מניחים את המיכל בתחתית המיכל בתוך השטח הפתוח ומבחן התמנון והמצלמה. אם הסרטן לא נאכל לאחר 4 שעות, ואז להסיר אותו מן הצינור לחדש את לוח הזמנים האכלה ליום. המשך לבצע תרגיל זה מדי יום.
    הערה: זה מוצג באיור 6 ונדון בסעיף התוצאה הייצוגית.

11. תמנון MRI

הערה: בעבר, תגובות MRI פונקציונליות מעוררות ב רשתית התמנון נמדדו בבעלי חיים מרדים70. כאן, השגנו MRI ברזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד של מערכת העצבים של התמנון שדרשה שעות של סריקה. לכן, זה בוצע ב O. bimaculoides מורדם.

  1. השגו תמונות MRI באמצעות מערכת 7T. עטפו את התמנון בניילון נצמד פוליוויניל כלוריד באיכות מטבח כדי לשמור על הידרציה של הרקמה. מניחים את התמנון על העטיפה, מכניסים את הקצוות ולאחר מכן מגלגלים לאטום.
  2. השתמש בנפח שידור/קבל סליל בקוטר 4 ס"מ כדי לרכוש תמונות של המוח וזרועות מרובות. השתמש ברצף נדיר משוקלל T1 עם הפרמטרים הבאים: זמן חזרה (TR) של 1500 אלפיות שני, זמן הד (TE) של 20 אלפיות שני, רזולוציה של 117 x 117 x 500 מיקרומטר, 100 ממוצעים, גורם נדיר 8. אלה הם פרמטרי MRI טיפוסיים למוח מכרסמים הדמיה. שימוש בגורם RARE הופך את ההדמיה למהירה יותר, בעוד ש-100 תמונות משועבדות יחד בממוצע כדי להגדיל את יחס האות לרעש71.
  3. תמונה זרוע התמנון באמצעות סליל שידור נפח 86 מ"מ ומערך 4 x 4 ס"מ 4 ערוצים לקבל סליל. חותכים זרוע באמצעות מספריים כירורגיים ומניחים אותה בצינור חרוט 15 מ"ל מלא מלוחים חוצצי פוספט.
    הערה: הרצף היה רצף שחזור היפוך T1_weighted (MP-RAGE) עם פרמטרים: TR/ TE = 4000/2.17 ms, עיכוב היפוך 1050 ms, 100 x 100 x 500 μm רזולוציה, 9 ממוצעים, זמן סריקה 1.5 שעות (איור 7). רצף היפוך-שחזור מבטל את האות מהמים ומגביר את הניגודיות בתוך התמונה; רצף זה נבחר מכיוון שהוא מאפשר הדמיה של האנטומיה הפנימית של arm72.

12. הדמיית טומוגרפיה של קריו-פלואורסצנטיות (CFT)

  1. להקפיא את התמנון: לעבוד במכסה אדים. מכסים את תחתית דיואר בקרח יבש, ואז ממלאים בהקסנים. מורידים לאט את התמנון לתוך ההקסנים במשך כ -10 דקות, מוסיפים hexanes טרי וקרח יבש כנדרש כדי לכסות את התמנון באופן מלא עם hexanes קר. שמור את התמנון קפוא ב -20 °C (70 °F) עד שהוא מוטבע.
  2. הטמעה וקטע התמנון: צור תבנית מלבנית בגודל המתאים כדי להחזיק את התמנון באמצעות הכלים המסופקים על ידי יצרן CFT. מכסים את תחתית התבנית במדיה OCT (טמפרטורת חיתוך אופטימלית) (חומר סטנדרטי המשמש במעבדות היסתולוגיות) ומניחים לה לקפוא לג'ל חצי מוצק.
  3. מניחים את התמנון הקפוא לתוך שכבת הג'ל של OCT, ולאחר מכן לכסות לאט עם OCT ב 2-3 שכבות. בין מדרגות מזיגה, להקפיא את מדרגות הבלוק עד OCT הוא בשלב הג'ל. לאחר התמנון מכוסה לחלוטין, להקפיא את הבלוק לפחות 12 שעות ב -20 °C (70 °F).
  4. טען את הדגימה למערכת טומוגרפיה קריו-פלואורסצנטית73.
  5. מקטע ותמונה כל O. bimaculoides המתחסד ברזולוציה מזוסקופית באמצעות 3 מסנני פליטה / עירור ובכך לייצר כמה ערכות נתונים איזוטרופיות 3D.
  6. כאשר החתך מגיע לזרוע ולמערכת העיכול, העבר את הסעיפים לשקופיות להיסטולוגיה נוספת.
  7. טען את ערכת הנתונים הגולמית לתוך תוכנת השחזור מספק CFT שתוכנן במיוחד כדי לאפשר עיבוד מהיר.
  8. בנייה מחדש של מחסנית תלת-ממדית באמצעות יישור ציון דרך, איזון היסטוגרמה, תיקוני פלואורסצנטיות ונורמליזציה, כולל הסרת השפעות פלואורסצנטיות תת-קרקעיות עבור כל אורך גל.
  9. לאחר שהערימה השלישית הסופית מיוצרת על-ידי כלי השחזור, דמיינו את הנתונים באמצעות כלי תוכנת ההדמיה ויצרו פסי טיסה עם שכבות-על של אור לבן ופלואורסצנטיות יחד עם הקרנות עוצמה מרבית תלת-ממדיות (3D-MIPS), למשל, איור 873.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל בעלי החיים במחקרים שלנו הושגו מהטבע, ולכן לא ניתן היה לקבוע את גילם המדויק והשהות שלהם במעבדה הייתה משתנה. מצב תמנון נצפה מדי יום. לא ראינו טפילים, חיידקים, נזק לעור או התנהגות חריגה. המשקל הממוצע של בעלי חיים היה 170.38 +/- 77.25 גרם. כל חיה איכלסה את מיכל ה-40 גלון שלה. סטיית התקן הממוצעת ± לפרמטרים שנרשמו עבור טנק במשך שבוע הייתה: pH 8.4 ± 0.0, מליחות 34.06 ± 0.61 ppt, טמפרטורה 18.7 ± 0.75 °C (75 °F), אמוניה 0.11 ± 0.14 ppm, ניטריט 0.25 ± 0.14 ppm, וחנקות 1.43 ± 2.44 ppm.

התנהגות של O. bimaculoides: כדי להבין את הפונקציה sensorimotor, כמו גם את יכולות הלמידה והזיכרון של תמנונים, מבחנות unscrewing הוכח להיות מבחן שימושי (איור 6). הוא גם מספק סביבה מועשרת שהוכחה כיעילה לשמירה על מנגנונים פיזיולוגיים קריטיים הקשורים להשפלה עצבית74. בדיקה זו בוצעה מדי יום עם שלושה תמנונים, ולקח לתמנונים 4 ימים בממוצע ללמוד כיצד לפתוח מבחנה.

Figure 6
איור 6: התקדמות תמנון המפתה את המכסה של צינור. השתמש במצלמות להקלטת קטעי וידאו של תיבות זיהוי ירוקות שנוצרו מתוכנת המצלמה. במסגרת האחרונה של הווידאו, האובייקט הכחול הוא המכסה של הצינור עולה לכיוון פני השטח של הטנק לאחר שהוסר על ידי התמנון. סרגל קנה מידה = 30 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

MRI של מערכת העצבים של התמנון: MRI מספק אמצעי לדמיין רקמה רכה עם רזולוציה מרחבית גדולה. רכשנו תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד (100 מיקרון ווקסל) של מערכת העצבים של ה-O. bimaculoides (איור 7). טכניקה זו תאפשר להשיג מורפולוגיה מפורטת ומעקב סיבים והתמצאות בהכנה של בעלי חיים שלמים.

Figure 7
איור 7: MRI של מערכת העצבים של התמנון. אפיון MRI ברזולוציה גבוהה של מערכת העצבים O. bimaculoides . רכשנו תמונות MRI ex vivo של המוח והזרועות של התמנון שיוצרים יחד מערכת עצבים המכילה מעל 500 מיליון נוירונים. המוח נמצא במרכז, ושתי האונות האופטיות מחוברות בכל צד (א). מבט קורונל על הזרועות. את חבל צירי ניתן לראות בכל אחת משבע הזרועות שנתפסו בתצוגה זו (ב). מבט קשתי של הפראיירים מדגים מבנה עצבים היקפי מורכב (ג). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיית טומוגרפיה של קריו-פלואורסצנטיות (CFT): ה- CFT היא שיטה חדשנית המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה בהכנת בעלי חיים שלמה. המערכת השתמשה רק בפלואורסצנטיות אוטומטית כדי ליצור תמונה מורפולוגית תלת-ממדית של החיה כולה. כפי שניתן לראות באיור 8, הדבר אפשר לדמיין את המוח ואת הפראיירים הממוקמים לאורך הזרוע באורך הגל (ירוק) של 470 ואת מערכת העיכול באורכי הגל 555 (כחול) ו-640 (צהוב).

Figure 8
איור 8: הדמיה של דימות קריו-פלואורסצנטי (CFT) של או. בימקולואידים. התמנון כולו הוטבע בבלוק וחתוך באופן סדרתי תוך איסוף תמונות אור לבן ופלואורסצנטיות לאחר כל קטע. זה יצר ערכת נתונים איזוטרופית תלת-ממדית עם שלושה אורכי גל פלואורסצנטיים. סרגל קנה מידה = 30 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התקנת מערכת:
המערכת האקולוגית של האקווריום פותחה באופן שבו מועסקות שיטות מכניות וביולוגיות לסינון וחימצון המים. רכיבי הסינון של המערכת משתמשים במסנני גרביים, ברפרוף חלבונים ובניקוי קבוע כדי לשמור על רמות החנקן והחמצן. חשוב מכך, אנו מסתמכים גם על מיקרואורגניזמים ימיים כדי לצרוך את התרכובות החנקניות המסוכנות ופסולת ביולוגית אחרת, כמו גם לזרום את המים באמצעות תהליכי פוטוסינתזה. שיטות נוספות, מלבד השימוש באצות, כדי להוסיף חמצן למים היא דרך אוויר חיצוני עם אבן אוויר מחוברת. לפני הוספת חיידקים, מומלץ להוסיף חול חי או אלמוגים כתוש כאמצעי צמיחה. ללא מדיה ייקח לאורגניזמים זמן רב יותר לבסס את עצמם בתוך המערכת. פיתוח זה ייקח 1-3 שבועות כדי לפרק ביעילות biowaste ולייצב את מחזור החנקן בתוך פרמטרים מתאימים.

העשרה סביבתית:
העשרה קוגניטיבית וסנסורית יכולה לסייע בנוריגנזה וברווחה הכללית של התמנון75. העשרה יכולה להיות מורכבת ממצע חולי, קונכיות, סלעים ומבנים אחרים המספקים מקומות מסתור וכיסוי. לעתים קרובות אנו משנים את התצורה של המבנים בתוך הטנק של התמנון ומציגים צעצועים חדשים עם מכניקה מעניינת כדי להניע את התמנון לחקור. מצאנו כי עדיף להשתמש בעציצים עם חור בתחתית כדי לשכן תמנונים. זה מאפשר טיפול פחות טראומטי, שבו בבית עם כניסה אחת, התמנון עלול להיפגע בעת ניסיון להסיר. התמנון נהנה אינטראקציה עם לגו גדול וצנצנות unscrewing עם מזון להציב בתוך, כפי שתואר גם פיוריטו ואח '58. העשרה סביבתית חשובה לבריאות הקוגניטיבית והפיזיולוגית של התמנון, אשר הוכח כמשפיעה על מנגנוני התחדשות קריטיים במערכת העצבים של התמנון74,75.

שיפורים:
ניתן לשנות את ההתקנה של המערכת כגון הגדלת גודל הטנקים, באמצעות מערכות sump שונות, כמו גם ציוד שונה. שיפורים נוספים שניתן לבצע הם להוסיף את מערכת הקירור לאחר פלט משאבת sump בשל מגבלות זרימה הנגרמות על ידי מערכת הקירור. שיפורים נוספים יהיו להציג סוגים שונים של אצות כדי לשלוט ברמות חנקות, כמו גם טרף אחרים, כגון רכיכות לא רעילות אחרות decapods, אשר התמנון עשוי להעדיף כאפשרויות נוספות.

תמנונים דורשים טיפול מתמיד ותשומת לב והשיטות הנהגות בפרוטוקול זה הוכיחו את עצמם כסביבה יציבה ובריאה לתושביה. בעוד השיטות המתוארות כאן הן עבור O. bimaculoides, ההתקנה האקווריום הבסיסית יכולה להיות מועסקת עבור רוב בעלי החיים הימיים עם וריאציות קלות בגודל המערכת והציוד. המאפיינים הייחודיים של בעלי חיים אלה הופכים אותם לאידיאליים עבור תחומי מחקר רבים והצלחת הפרויקטים הקשורים לבעלי חיים אלה תלויה חריצות של צוות הבעלות. תמנונים עם היכולות שאין דומה להן הופכים אותם למודל חייתי יוצא דופן וחשוב לשימוש במחקר ביו-רפואי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH UF1NS115817 (G.P.). G.P. נתמך חלקית על ידי מענקי NIH R01NS072171 ו- R01NS098231. ברצוננו להודות לפטריק זכרצ'וקי ומוחמד פרחוד מ-Emit Imaging על העזרה והתמיכה באיסוף והדמיה של הנתונים בפלטפורמת ההדמיה של Xerra. MSU יש הסכם מחקר עם Bruker Biospin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-3/4 in. Drill Bit Home Depot 204074205 Glass cutting tool
Part number:1
1" flow sensors Neptune Systems Local Dealer Pipe with sensor to measure water flow
Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer Bulk Reef Supply 207113 Strainer for water leaving tank
Part number:3
10 gallon tank Preuss Pets Local Dealer Fiddler crab holding tank
Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring AQUAMAXX UJ41171 Filter for large organic matter in sump
Part number:5
40 gallon aquarium Preuss Pets Local Dealer 4 Food aquarium tanks
Part number:6
60g poly tanks - rectangle Preuss Pets Local Dealer 2 Water Storage (salt and freshwater)
Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model WayWe 719574198463 For cooling water continuously
Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush ALAZCO B06W2FT5V5 Tank Cleaning
Part number:9
Ammonia Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 33D For water testing
Part number:10
Apex system WiFi Neptune Systems Local Dealer System connection for off site monitoring
Part number:11
API Aquarium Test Kit Amazon B001EUE808 For water testing
Part number:12
API Copper Test Kit Amazon B0006JDWH8 For water testing
Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units Aqua Ultraviolet A00028 For removing bacteria leaving sump system
Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack Aquaclear A1394 Food Tank Carbon Filter Inserts
Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30 Aqueon 100106082 Food tank filtering units
Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float) Neptune Systems Local Dealer For freshwater tank
Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC) Neptune Systems Local Dealer From water storage to octopus tanks
Part number:18
Banded Trochus Snail LiveAquaria CN-112080 For algae bin
Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured LiveAquaria BVJ-76354 For algae bin
Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen Fulton Fish Market N/A Live food
Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin Bulk Reef Supply 211813 Salt for tank water
Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD McMaster 5233K71 Cleaning tool
Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch Marine Depot 4C31001 Cleaning tool
Part number:24
Copper Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 65L For water testing
Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light Eshopps 6500K Algae bin light
Part number:26
Eheim 1262 return pumps EHEIM 1250219 Pump for storage tanks
Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3 Eshopps 15000 Sump system
Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich 64-17-5 Anesthesia
Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter Extech DO600 Oxygen measurement
Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:31
Filter Cartridges Aqueon 100106087 Food tank filters
Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea Bulk Reef Supply 212959 Sediment for bottom of tank
Part number:33
FMM module Neptune Systems Local Dealer Controller for apex system
Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz Bulk Reef Supply 213036 Bacteria start
Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail Grainger 38Y789 Water Hand Pump
Part number:36
High pH Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 27 For water testing
Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp Petco 2580993 Shrimp and fish transfer net
Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors Neptune Systems Local Dealer Placed on floor to detect water
Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass Marine Depot LE12007 Cleaning tool
Part number:40
Live rocks Preuss Pets Local Dealer Habitat for octopus
Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long Haomaomao B07FS7J7PN Tank Cleaning
Part number:42
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M1028-100ML Euthanasia
Part number:43
Magnetic Probe Rack Neptune Systems Local Dealer For holding apex sensor probes
Part number:44
Marine Ghost Shrimp NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count Chewy 98331 For elevated copper levels
Part number:46
Nitra-Zorb Bag Aquarium Pharmaceuticals AP2213 Absorbs nitrogen compounds
Part number:47
Nitrate Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals LR1800 For water testing
Part number:48
Nitrite Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 26 For water testing
Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue Amazon B076S56XWX Aerate water
Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard Amazon B0002563MM Tubing for connecting air pump to air stone
Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose Preuss Pets Local Dealer Water transport
Part number:52
PM1 module Neptune Systems Local Dealer Power control module for apex
Part number:53
Protein skimmer Reef Octopus AC20284 Removes biowaste from system
Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts Neptune Systems Local Dealer Helps ensure organization for wires and tubing within system
Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer Amazon Oatey - 30246 For connecting PVC pipes
Part number:56
RODI unit Neptune Systems Local Dealer RO Water
Part number:57
Salinity Probes HANNA probes HI98319 Measures salinity of water
Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment Seachem 1438 Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus
Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer Seachem 116012607 Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems
Part number:60
Set of lexan tops Preuss Pets Local Dealer Aquarium tank lids
Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables Neptune Systems Local Dealer Cables for Apex system
Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums Amazon B07DC2TZCJ Cleaning tool
Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male McMaster 4880K189 PVC pipe
Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male McMaster 4880K773 PVC pipe
Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male McMaster 4880K415 PVC pipe
Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female McMaster 4880K008 PVC pipe
Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female McMaster 4880K43 PVC pipe
Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long McMaster 48925K13 PVC pipe
Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long McMaster 48925K92 PVC pipe
Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick McMaster 8537K15 Table top material
Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness McMaster 8548K33 Structural table material
Part number:72
Tank Sediment TopDawg Pet Supply 8479001207 Sediment for bottom of fiddler crab tank
Part number:73
Temperature probe Neptune Systems Local Dealer Temperature probe for tanks
Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish Amazon B00025K0US Fish, shrimp, and crab food
Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums Petco 2335234 Air pump for smaller tanks
Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female McMaster 36895K843 PVC pipe
Part number:77
Vectra s2 pump Bulk Reef Supply 212141 Aquarium Pump
Part number:78
Water Pump TACKLIFE GHWP1A Pump for cleaning tanks
Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision Amazon B076H3SRXG DeepLabCut Recording
Part number:80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), 299 (2007).
  3. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Li, N., et al. Optogenetic-guided cortical plasticity after nerve injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8838-8843 (2011).
  5. Airan, R. D., Li, N., Gilad, A. A., Pelled, G. Genetic tools to manipulate MRI contrast. NMR Biomedicine. 26 (7), 803-809 (2013).
  6. Cywiak, C., et al. Non-invasive neuromodulation using rTMS and the electromagnetic-perceptive gene (EPG) facilitates plasticity after nerve injury. Brain Stimulation. 13 (6), 1774-1783 (2020).
  7. Hwang, J., et al. Regulation of Electromagnetic Perceptive Gene Using Ferromagnetic Particles for the External Control of Calcium Ion Transport. Biomolecules. 10 (2), (2020).
  8. Lu, H., et al. Transcranial magnetic stimulation facilitates neurorehabilitation after pediatric traumatic brain injury. Scientific Reports. 5, 14769 (2015).
  9. Krishnan, V., et al. Wireless control of cellular function by activation of a novel protein responsive to electromagnetic fields. Bioscience Reports. 8 (1), 8764 (2018).
  10. Mitra, S., Barnaba, C., Schmidt, J., Pelled, G., Gilad, A. A. Functional characterization of an electromagnetic perceptive protein. bioRxiv. , 329946 (2020).
  11. Hunt, R. D., et al. Swimming direction of the glass catfish is responsive to magnetic stimulation. PLoS One. 16 (3), 0248141 (2021).
  12. Kandel, E. R., Krasne, F. B., Strumwasser, F., Truman, J. W. Cellular mechanisms in the selection and modulation of behavior. Neurosciences Research Program bulletin. 17, 521 (1979).
  13. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. An analysis of dishabituation and sensitization of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. International Journal of Neuroscience. 2 (2), 79-98 (1971).
  14. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bioscience Reports. 21 (5), 565-611 (2001).
  15. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life-span of octopus-bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  16. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Behavior, body patterning and reproductive-biology of octopus-bimaculoides from California. Malacologia. 29 (1), 41-55 (1988).
  17. Pickford, B. M. The Octopus bimaculatus problem: A study in sibling species. Bulletin of the Bingham Oceanographic Collection. 12, 1-66 (1949).
  18. Sumbre, Y., Fiorito, G., Flash, T. Control of octopus arm extension by a peripheral motor program. Science. 293 (5536), 1845-1848 (2001).
  19. Gutfreund, Y., et al. Organization of octopus arm movements: a model system for studying the control of flexible arms. Journal of Neuroscience. 16 (22), 7297-7307 (1996).
  20. Gutfreund, Y., Matzner, H., Flash, T., Hochner, B. Patterns of motor activity in the isolated nerve cord of the octopus arm. The Biological Bulletin. 211 (3), 212-222 (2006).
  21. Hague, T., Florini, M., Andrews, P. L. R. Preliminary in vitro functional evidence for reflex responses to noxious stimuli in the arms of Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 100-105 (2013).
  22. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  23. Hochner, B., Glanzman, D. L. Evolution of highly diverse forms of behavior in molluscs. Current Biology. 26 (20), 965-971 (2016).
  24. Hvorecny, L. M., et al. Octopuses (Octopus bimaculoides) and cuttlefishes (Sepia pharaonis, S. officinalis) can conditionally discriminate. Animal Cognition. 10 (4), 449-459 (2007).
  25. Kier, W. M., Stella, M. P. The arrangement and function of octopus arm musculature and connective tissue. Journal of Morphology. 268 (10), 831-843 (2007).
  26. Levy, G., Hochner, B. Embodied organization of octopus vulgaris morphology, vision, and locomotion. Frontiers in Physiology. 8, 164 (2017).
  27. Giorgio-Serchi, F., Arienti, A., Laschi, C. Underwater soft-bodied pulsed-jet thrusters: Actuator modeling and performance profiling. The International Journal of Robotics Research. 35 (11), 1308-1329 (2016).
  28. Han, S., Kim, T., Kim, D., Park, Y., Jo, S. Use of deep learning for characterization of microfluidic soft sensors. IEEE Robotics and Automation Letters. 3 (2), 873-880 (2018).
  29. Hanassy, S., Botvinnik, A., Flash, T., Hochner, B. Stereotypical reaching movements of the octopus involve both bend propagation and arm elongation. Bioinspiration and Biomimetics. 10 (3), 035001 (2015).
  30. Hochner, B., Shomrat, T., Fiorito, G. The octopus: a model for a comparative analysis of the evolution of learning and memory mechanisms. The Biological Bulletin. 210 (3), 308-317 (2006).
  31. Imperadore, P., Fiorito, G. Cephalopod tissue regeneration: consolidating over a century of knowledge. Frontiers in Physiology. 9, 593 (2018).
  32. Imperadore, P., et al. Nerve regeneration in the cephalopod mollusc Octopus vulgaris: label-free multiphoton microscopy as a tool for investigation. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (141), 20170889 (2018).
  33. Levy, G., Flash, T., Hochner, B. Arm coordination in octopus crawling involves unique motor control strategies. Current Biology. 25 (9), 1195-1200 (2015).
  34. Li, F., et al. Chromosome-level genome assembly of the East Asian common octopus (Octopus sinensis) using PacBio sequencing and Hi-C technology. Molecular Ecology Resources. 20 (6), 1572-1582 (2020).
  35. Lopes, V. M., Rosa, R., Costa, P. R. Presence and persistence of the amnesic shellfish poisoning toxin, domoic acid, in octopus and cuttlefish brains. Marine Environmental Research. 133, 45-48 (2018).
  36. Mazzolai, B., Margheri, L., Dario, P., Laschi, C. Measurements of octopus arm elongation: Evidence of differences by body size and gender. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 160-164 (2013).
  37. McMahan, W., et al. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. , 2336-2341 (2006).
  38. Meisel, D. V., Kuba, M., Byrne, R. A., Mather, J. The effect of predatory presence on the temporal organization of activity in Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 75-79 (2013).
  39. Nesher, N., Levy, G., Grasso, F. W., Hochner, B. Self-recognition mechanism between skin and suckers prevents octopus arms from interfering with each other. Current Biology. 24 (11), 1271-1275 (2014).
  40. Wells, M. J. Octopus : Physiology and behaviour of an advanced invertebrate. , Chapman and Hall. Halsted Press. (1978).
  41. Young, J. Z. The anatomy of the nervous system of Octopus vulgaris. , Clarendon Press. (1971).
  42. Zullo, L., Sumbre, G., Agnisola, C., Flash, T., Hochner, B. Nonsomatotopic organization of the higher motor centers in octopus. Current Biology. 19 (19), 1632-1636 (2009).
  43. Albertin, C. B., et al. The octopus genome and the evolution of cephalopod neural and morphological novelties. Nature. 524 (7564), 220-224 (2015).
  44. Albertin, C. B., Simakov, O. Cephalopod Biology: At the intersection between genomic and organismal novelties. Annual Review if Animal Biosciences. 8, 71-90 (2020).
  45. Baik, S., et al. A wet-tolerant adhesive patch inspired by protuberances in suction cups of octopi. Nature. 546 (7658), 396-400 (2017).
  46. Pikul, J. H., et al. Stretchable surfaces with programmable 3D texture morphing for synthetic camouflaging skins. Science. 358 (6360), 210 (2017).
  47. Wehner, M., et al. An integrated design and fabrication strategy for entirely soft, autonomous robots. Nature. 536 (7617), 451-455 (2016).
  48. McMahan, W., et al. Field trials and testing of the OctArm continuum manipulator. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. ICRA. , 2336-2341 (2006).
  49. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  50. Tapia-Vasquez, A. E., et al. Proteomic identification and physicochemical characterisation of paramyosin and collagen from octopus (Octopus vulgaris) and jumbo squid (Dosidicus gigas). International Journal of Food Science & Technology. 55 (10), 3246-3253 (2020).
  51. Kim, B. -M., et al. The genome of common long-arm octopus Octopus minor. GigaScience. 7 (11), (2018).
  52. Zarrella, I., et al. The survey and reference assisted assembly of the Octopus vulgaris genome. Scientific data. 6 (1), 13 (2019).
  53. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life span of Octopus bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  54. Stoskopf, M. K., Oppenheim, B. S. Anatomic features of Octopus bimaculoides and Octopus digueti. Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 27 (1), 1-18 (1996).
  55. Ramos, J. E., et al. Body size, growth and life span: implications for the polewards range shift of Octopus tetricus in south-eastern Australia. PLoS One. 9 (8), 103480 (2014).
  56. Hanlon, R. T., Forsythe, J. W. Advances in the laboratory culture of octopuses for biomedical research. Lab Animal Science. 35 (1), 33-40 (1985).
  57. Moltschaniwskyj, N. A., Carter, C. G. Protein synthesis, degradation, and retention: mechanisms of indeterminate growth in cephalopods. Physiological and Biochemical Zoology. 83 (6), 997-1008 (2010).
  58. Fiorito, G., et al. Guidelines for the care and welfare of Cephalopods in Research -A consensus based on an initiative by CephRes, FELASA and the Boyd Group. Lab Animal. 49, 2 Suppl 1-90 (2015).
  59. Valverde, J. C., Garcia, B. G. Suitable dissolved oxygen levels for common octopus (Octopus vulgaris cuvier, 1797) at different weights and temperatures: analysis of respiratory behaviour. Aquaculture. 244 (1-4), 303-314 (2005).
  60. Cardeilhac, P. T., Whitaker, B. R. Copper Treatments: Uses and Precautions. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 18 (2), 435-448 (1988).
  61. Hodson, P. V., Borgman, U., Shear, H. Toxicity of copper to aquatic biota. Copper in the Environment. (2), John Wiley. 307-372 (1979).
  62. Poole, B. M. Techniques for the culture of ghost shrimp (palaemonetes pugio). Environmental Toxicology and Chemistry. 7 (12), 989-995 (1988).
  63. Burggren, W. W. Respiration and circulation in land crabs: novel variations on the marine design. American Zoologist. 32 (3), 417-427 (1992).
  64. Reitsma, J., Murphy, D. C., Archer, A. F., York, R. H. Nitrogen extraction potential of wild and cultured bivalves harvested from nearshore waters of Cape Cod, USA. Marine Pollution Bulletin. 116 (1), 175-181 (2017).
  65. Messenger, J. B. Cephalopod chromatophores: neurobiology and natural history. Biological Reviews. 76 (4), 473-528 (2001).
  66. Morgan Holst, M. M., Miller-Morgan, T. The Use of a species-specific health and welfare assessment tool for the giant pacific octopus, enteroctopus dofleini. Journal of Applied Animal Welfare Science. 24 (3), 272-291 (2021).
  67. Rosas, C., et al. Energy balance of Octopus maya fed crab or an artificial diet. Marine Biology. 152 (2), 371-381 (2007).
  68. Anderson, R. C., Wood, J. B., Byrne, R. A. Octopus Senescence: The Beginning of the end. Journal of Applied Animal Welfare Science. 5 (4), 275-283 (2002).
  69. Butler-Struben, H. M., Brophy, S. M., Johnson, N. A., Crook, R. J. In vivo recording of neural and behavioral correlates of anesthesia induction, reversal, and euthanasia in cephalopod molluscs. Frontiers in Physiology. 9, 109 (2018).
  70. Jiang, X., et al. Octopus visual system: A functional MRI model for detecting neuronal electric currents without a blood-oxygen-level-dependent confound. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1311-1319 (2014).
  71. Hennig, J., Nauerth, A., Friedburg, H. RARE imaging: a fast imaging method for clinical MR. Magnetic Resonance in Medicine. 3 (6), 823-833 (1986).
  72. Brant-Zawadzki, M., Gillan, G. D., Nitz, W. R. MP RAGE: a three-dimensional, T1-weighted, gradient-echo sequence--initial experience in the brain. Radiology. 182 (3), 769-775 (1992).
  73. emit-Xerra. , Available from: http://emit-imaging.com/xerra/ (2021).
  74. Bertapelle, C., Polese, G., Di Cosmo, A. Enriched environment increases PCNA and PARP1 Levels in Octopus vulgaris central nervous system: first evidence of adult neurogenesis in Lophotrochozoa. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (4), 347-359 (2017).
  75. Maselli, V., Polese, G., Soudy, A. -S. A., Buglione, M., Cosmo, A. D. Cognitive stimulation induces differential gene expression in Octopus vulgaris: The key role of protocadherins. Biology. 9, Basel. (2020).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 175
הקמת מערכת אקולוגית של תמנון למחקר ביו-רפואי וביו-הנדסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp,… More

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp, P., Mallett, C. L., Pelled, G. Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research. J. Vis. Exp. (175), e62705, doi:10.3791/62705 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter