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Artigo de método

Dissecção de ovário planário para análise ultraestrutural e coloração de anticorpos

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DOI:

10.3791/62713

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10 de setembro de 2021

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta as etapas tomadas para dissecar ovários nas planárias de água doce, Schmidtea mediterranea. Os ovários dissecados são compatíveis para imunomarcação de anticorpos e análise ultraestrutural com microscopia eletrônica de transmissão para estudar a biologia celular dos oócitos e células somáticas, fornecendo uma profundidade e qualidade de imagem que antes eram inacessíveis.

Resumo

A acessibilidade às células germinativas permite o estudo do desenvolvimento, meiose e recombinação das células germinativas. O biótipo sexual da planária de água doce, Schmidtea mediterranea, é um poderoso modelo de invertebrado para estudar a especificação epigenética das células germinativas. Ao contrário do grande número de testículos e células germinativas masculinas, os oócitos planários são relativamente difíceis de localizar e examinar, pois existem apenas dois ovários, cada um com 5-20 oócitos. A localização mais profunda dentro do corpo da planária e a falta de tecidos epiteliais protetores também dificultam a dissecação direta dos ovários da planária.

Este protocolo usa uma breve etapa de fixação para facilitar a localização e dissecção de ovários planários para análise a jusante para superar essas dificuldades. O ovário dissecado é compatível para exame ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e imunomarcação de anticorpos. A técnica de dissecação descrita neste protocolo também permite experimentos de perturbação gênica, nos quais os ovários são examinados sob diferentes condições de interferência de RNA (RNAi). O acesso direto às células germinativas intactas no ovário obtido por este protocolo melhorará muito a profundidade e a qualidade da imagem e permitirá a interrogação celular e subcelular da biologia do oócito.

Introdução

A anatomia da planária foi examinada usando MET em muitos tecidos 1,2,3,4,5,6. No entanto, pouca atenção tem sido dada aos ovários ou oócitos. A escassez de literatura sobre oócitos se deve em parte à dificuldade de acesso a essas células, deixando a biologia dos oócitos planárias amplamente inexplorada. Ferramentas moleculares descobriram muitos mecanismos regulatórios do desenvolvimento do ovário nas planárias usando microscopia de luz ou fluorescência 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Todos esses experimentos foram realizados em vermes inteiros ou cortes histológicos de vermes inteiros. Os protocolos de coloração de anticorpos e hibridização in situ em vermes inteiros envolvem extensas etapas de branqueamento, lavagem e limpeza de tecidos, que são demoradas e levarão vários dias.

O objetivo geral do método descrito aqui é fornecer acessibilidade a ovários e oócitos planários intactos e dissecados, o que eliminará a necessidade de branqueamento ou seccionamento histológico e reduzirá o tempo de lavagem e limpeza do tecido na coloração de anticorpos e hibridização in situ. Os ovários dissecados também melhorarão a penetração da sonda ou do anticorpo e aumentarão a profundidade e a qualidade da imagem para microscópios ópticos e eletrônicos. A acessibilidade aos ovários e oócitos dissecados permite a pesquisa em biologia celular em resolução celular e subcelular com oócitos inteiros intactos. Um estudo recente sobre ovários planários dissecados caracterizou a meiose do oócito planário pela primeira vez com MET e microscopia confocal21. O trabalho forneceu uma descrição abrangente de um novo fenômeno durante a meiose chamado vesiculação do envelope nuclear.

Aqui, apresentamos os procedimentos detalhados na dissecção de ovários planários. Uma etapa de fixação foi suficiente para preservar a estrutura das células do ovário para dissecção e manipulação a jusante (ou seja, processamento para análise de MET e microscópio de luz). Dada a sua semelhança nos planos corporais e na arquitetura do tecido, este protocolo também deve ser amplamente informativo para o estudo de oócitos e seus núcleos em várias outras espécies de Platyhelminthes (por exemplo, o gênero Dugesia ou Polycelis). Este protocolo é provavelmente irrelevante para Macrostomum lignano por seus tamanhos pequenos e arquitetura corporal quase transparente, o que permitirá a observação direta do ovário e dos oócitos 22,23,24. A área do corpo contendo os ovários é mais opticamente distinguível (por exemplo, pigmento mais escuro ou pigmentado mais claro) em algumas espécies (por exemplo, Dugesia ryukyuensis 9,25) do que S. mediterranea. Os estudos nessas espécies podem depender menos das diretrizes para localização dos ovários em S. mediterranea aqui apresentadas, mas aproveitam as condições de fixação e dissecção.

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Protocolo

1. Preparação

  1. Prepare vermes: alimente planárias sexuais duas vezes por semana com pasta de fígado orgânica para atingir a maturidade sexual.
    NOTA: Geralmente, esses vermes têm mais de 1 cm de comprimento e têm um gonóporo posterior à abertura da faringe.
  2. Prepare soluções.
    1. Prepare os seguintes reagentes: paraformaldeído a 16% (PFA); solução aquosa de glutaraldeído (GA) a 50%; N-acetil-L-cisteína (NAC); 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 e 2 mM KH2PO4.
    2. Dilua 50% de GA e 16% de PFA com PBS até obter uma mistura final de 2,5% de GA e 2% de PFA. Diluir 16% de PFA com PBS até uma concentração final de 4% de PFA.
    3. Dissolva 5 g de NAC em 100 mL de PBS para obter uma solução de trabalho a 5%.

2. Coleta de ovários

  1. Trate vermes sexualmente maduros com 5% de NAC em um prato em temperatura ambiente por 5 min.
    NOTA: Vermes grandes podem enrolar-se. Escovas ou pontas de pipeta podem ser usadas para achatar os vermes. A quantidade de 5% de NAC usada é mínima, o suficiente para cobrir a superfície da placa de Petri.
  2. Substitua o NAC por 10 mL de paraformaldeído a 4% recém-preparado e fixe os vermes por 1 h em temperatura ambiente com agitação ocasional. Inicie a dissecção 10 min após a adição de 4% de PFA e realize a dissecção em 4% de PFA à medida que os vermes estão sendo corrigidos.
  3. Observe a pigmentação epitelial para localizar os cordões nervosos ventrais, que aparecem como duas linhas com pigmentação mais clara que vão dos gânglios cefálicos anteriores em direção à cauda.
  4. Localize os ovários.
    NOTA: O ovário está localizado ao lado do cordão nervoso no lado medial (Figura 1A). Confie na pigmentação do epitélio para localizar a posição do ovário na direção ântero-posterior. Idealmente, a pigmentação do epitélio ventral na região do ovário é mais clara do que nas regiões circundantes. Em alguns vermes, a pigmentação do epitélio ventral não fornece confiança suficiente. Esses vermes podem ser descartados, pois alguns podem não ter ovários bem desenvolvidos.
  5. Valide as posições dos ovários assim que os ovários putativos estiverem localizados por pigmentação.
    NOTA: Primeiro, os ovários são posteriores aos gânglios cefálicos. Em segundo lugar, os testículos de cor escura são laterais à superfície dorsal acima do ovário. Os ovários localizam-se na frente do testículo mais anterior (Figura 1B). Às vezes, os lobos testiculares são posicionados no nível ou ligeiramente anterior aos ovários.
  6. Use duas facas cirúrgicas para cortar posterior e anterior aos dois ovários (Figura 1C) para remover completamente os fragmentos de vermes anterior e posterior. Use uma faca para ancorar o verme e limpe a outra faca usada para fazer os cortes.
  7. Corte na linha média do fragmento do ovário para separar os dois ovários. Vire o fragmento para ter o lado ventral para baixo.
  8. Retire o tecido dorsal para expor o intestino (Figura 1D) com dois pares de pinças pontiagudas (tipo 5-SA).
    NOTA: O ovário em forma de cúpula está localizado abaixo dos ramos intestinais.
  9. Remova suavemente os ramos intestinais situados acima dos tecidos ventrais com a ponta da pinça ou uma escova macia para expor o ovário (Figura 1E).
  10. Remova os tecidos circundantes para retirar o ovário (Figura 1F, G).
  11. Retire os ovários e transfira-os para um tubo de 1,5 mL para lavar com 1 mL de PBS.

3. Fixação para TEM

  1. Lave os ovários em PBS por 10 min com agitação suave. Mantenha as trompas em pé e deixe os ovários afundarem por gravidade. Repita a lavagem uma vez.
    NOTA: Se os ovários não afundarem, aplique uma centrifugação suave por 15 s com uma minicentrífuga de bancada (velocidade máxima de 2000 × g).
  2. Substitua o PBS por 2% PFA/2,5% GA/PBS.
  3. Fixar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h num agitador a 40 rpm.
  4. Manter as amostras em fixador a 4 °C durante a noite num agitador a 40 rpm.

4. Processamento de amostras para TEM

  1. Lave os ovários em PBS 3 vezes por 10 min cada.
  2. Lave os ovários em água bidestilada (ddH2O) 3 vezes por 10 min cada.
  3. Pós-fixar os ovários em OsO4 aquoso a 2% por 1-2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Os recipientes de amostra precisam ser selados com parafilme durante esta etapa. Prepare 2% de OsO4 com água tratada por osmose reversa (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Enxágue as amostras com ddH2O 3 vezes, 10 min cada.
  5. Corar previamente os ovários em acetato de uranilo (UA) aquoso a 2% durante a noite a 4 °C.
    NOTA: A solução de UA precisa ser filtrada antes do uso; Evite a luz durante a coloração em bloco . Prepare 2% de OsO4 com água tratada por osmose reversa (consulte a Tabela de Materiais).
  6. Enxágue as amostras em ddH2O 4 vezes com agitação suave, 10 min cada.
  7. Desidrate os ovários em uma série graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 95% e duas vezes 100%, 10 min cada solução) e, em seguida, equilibre-os em duas incubações (10 min) em óxido de propileno.
  8. Para infiltração com resina, incubar as amostras em uma mistura de 50% de óxido de propileno/50% de resina epóxi líquida durante a noite a 4 °C. Infiltrar as amostras com resina epóxi 100% com 3 trocas (1 h cada troca) com agitação suave.
  9. Incorpore os ovários em resina 100% epóxi e polimerize a resina a 60 °C por 48 h.

5. Ultramicrotomia

  1. Corte de blocos e verificação de amostras com um microscópio óptico
    1. Apare os blocos de amostra em forma de pirâmide com uma lâmina de barbear.
    2. Corte seções de 1-2 μm de espessura com uma faca de vidro ou diamante.
    3. Transfira as seções para uma lâmina com uma gota de água e, em seguida, aqueça a lâmina em uma placa quente até que as seções se achatem e adiram à superfície da lâmina durante a evaporação da água.
    4. Cubra as seções com uma gota de 1% de azul de toluidina O e aqueça-as em uma placa quente por ~ 10 s. Enxágue a lâmina com água corrente e deixe secar. Verifique as seções em um microscópio óptico comum.
  2. Corte de seções ultrafinas, coleta e pós-coloração.
    1. Corte seções ultrafinas de 50-70 nm de espessura com uma faca de diamante. Transfira as seções do barco aquático de faca para grades de cobre de malha ou ranhura única.
    2. Manchar as seções em 2% UA por 8 min. Lave as grades em ddH2O por 30 s.
    3. Manchar as secções com solução de chumbo a 1% durante 6 min. Lave as secções em ddH2O durante 1 min e seque ao ar.

6. Coleta e análise de dados

  1. Colete dados TEM usando software apropriado, por exemplo, Micrografia Digital (consulte a Tabela de Materiais para obter mais detalhes).
  2. Opere o osciloscópio a 80 kV. Insira a grade de amostra no osciloscópio quando o vácuo estiver pronto.
  3. Ligue o feixe clicando em Luz no menu. Gire o botão de intensidade no painel de controle esquerdo até que o tempo de exposição automática seja ~ 1 seg. Clique em Iniciar aquisição para obter uma imagem final.
  4. Construa modelos EM tridimensionais usando o pacote de processamento, modelagem e exibição de imagens (IMOD) de código aberto.

7. Coloração de anticorpos

  1. Lave os ovários dissecados (passo 2.16) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 1 mL de 1x PBS suplementado com 0,5% de Triton X-100 (PBST). Coloque os tubos em um agitador para agitação a 40 rpm por 10 min. Deixe as trompas ficarem em um rack e os ovários afundarem por gravidade. Substitua a lavagem por PBST novo e repita duas vezes.
  2. Digerir os tecidos com 2 μg/mL de Proteinase K e dodecilsulfato de sódio a 0,1% por 10 min em temperatura ambiente em PBST.
  3. Lave os ovários digeridos em PBST três vezes por 10 min a cada lavagem.
  4. Incube os ovários com soro de cavalo a 10% em PBST por 1 h em temperatura ambiente.
  5. Dilua os anticorpos primários de 1 a 100 na solução de bloqueio (soro de cavalo a 10% em PBS com Triton X-100 a 0,5%). Incubar os ovários com anticorpos primários durante a noite a 4 °C com agitação suave.
  6. Lave os ovários em PBST três vezes por 10 min cada lavagem.
  7. Incubar os ovários com anticorpos secundários durante a noite a 4 °C com agitação suave. Diluir todos os anticorpos secundários a 1:300 na solução de bloqueio.
  8. Lave os ovários em PBST três vezes, garantindo que a primeira e a terceira lavagens durem 10 min. Manchar os núcleos ovarianos com Hoechst 33342 na diluição de 1:300 em PBST por 30 min em temperatura ambiente na segunda lavagem.
  9. Monte os ovários em lâminas.
    NOTA: O mountant anti-desbotamento pode ser usado para prolongar os sinais de fluorescência.

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Resultados

O método aqui apresentado foi descrito por Guo et al.21. A chave para uma dissecção bem-sucedida é identificar corretamente a pigmentação do ovário e as guias de posição. A estratégia do método é passar de posições amplas para um local específico. Primeiro, para conseguir isso, confie nos padrões de pigmentação dorsal e ventral (Figura 1A, B). A pigmentação ventral, onde residem os ovários, ficará branca após o tratamento com NAC a 5% e a fixação com ...

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Discussão

Esses procedimentos baseados em fixação para dissecar ovários planários facilitarão a compreensão da meiose do oócito, bem como o desenvolvimento e regeneração dos ovários. Os tamanhos dos oócitos e suas células somáticas de suporte podem variar de 20 μm a 50 μm. Os métodos baseados em dissecação fornecerão acessibilidade a células intactas de um único ovário que os métodos de seccionamento ou baseados em montagem inteira não podem alcançar. Este protocolo facilitará o estudo da anatomia...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute (LK e ASA) e pela Helen Hay Whitney Foundation (LHG).

Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados no Repositório de Dados Originais da Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
16% de paraformaldeído Ciências deMicroscopia Eletrônica15710EM grau
2% aquoso OsO4Microscopia Eletrônica Ciências19152
50% glutaraldeídoMicroscopia Eletrônica Ciências16320EM grau
Digital MicrografiaGatan Inc.Versão 2.33.97.1, coleta de dados TEM
Resina EponMicroscopia Eletrônica Ciências14120Embed 812 Kit, líquido, resina epóxi
EtanolTed Pella19207Desnaturado
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Soro de cavaloSigmaH1138
Acetato de chumboMicroscopia eletrônica CiênciasÁgua tratada com
osmose reversaágua
MilliQ N-acetil-L-cisteínaSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Óxido de propilenoMicroscopia Eletrônica Ciências75569Grau EM
  Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
Toluidine blue OMicroscopia Eletrônica Ciências92319
Microscópio Eletrônico de TransmissãoFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Acetato de uranilaCiências de MicroscopiaEletrônica 541093
de 6080564

Referências

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