Summary
全膝関節形成術後の患者から得られた原発組織は、変形性関節症研究の実験モデルを提供し、最大の臨床翻訳性を有する。このプロトコルは、ヒト変形性関節症における機械治療研究を支援するために、7つのユニークな膝組織からRNAを同定、処理、分離する方法を説明しています。
Abstract
変形性関節症(OA)は、最も頻繁に膝に影響を与える慢性および変性関節疾患である。現在のところ治療法がないため、全膝関節形成術(TKA)は一般的な外科的介入である。TKAから得られたヒトの初原OA組織を用いた実験は、疾患メカニズム ex vivoを調査する能力を提供する。OAは以前は主に軟骨に影響を与えると考えられていたが、現在では関節内の複数の組織に影響を与えたことが知られている。このプロトコルは、患者の選択、サンプル処理、組織均質化、RNA抽出、および(RNAの純度、完全性、収率に基づく)品質管理(RNAの純度、完全性、収率に基づく)を、膝関節における疾患メカニズムの調査をサポートする方法を説明します。インフォームド・コンセントを得て、OAのTKAを受けている患者からサンプルを入手した。組織は解剖、洗浄、およびRNAのためのフラッシュ凍結または組織学のためのホルマリン固定によって手術の4時間以内に保存された。収集された組織には、関節軟骨、軟骨下骨、半月板、眼房蓋脂肪パッド、前十字靭帯、滑膜、および斜筋の中科が含まれていた。RNA抽出プロトコルは、各組織タイプについて試験した。最も重要な改変は、比較的高細胞、低マトリックス、低マトリックス、軟部組織(脂肪パッド、靭帯、滑膜、および筋肉と考えられる)に対して、低細胞、高マトリックス、硬組織(軟骨、骨、半月板と考えられる)に使用される崩壊の方法を含んでいた。粉砕は硬質組織に適しており、軟組織には均質化が適していることが分かった。複数の組織にわたって一貫して他の被験者よりも高いRNA完全性数(RIN)値を得るためのプロクチティティが観察され、疾患重症度などの根本的な要因がRNAの質に影響を与える可能性が示唆された。ヒトの原発組織から高品質のRNAを単離する能力は、シーケンシングを含む洗練された遺伝子発現実験に生理学的に関連するモデルを提供し、患者に翻訳されやすい臨床的洞察につながる可能性があります。
Introduction
膝は人体で最大の滑液関節であり、脛骨と大腿骨と膝蓋骨と大腿骨1の間の膝蓋骨関節との間の脛骨の関節を含む。膝の骨は関節軟骨で覆われ、半月、脂肪、靭帯、筋肉を含む様々な結合組織によって支えられ、滑膜膜は関節全体を封入して滑液充填空洞1、2、3を作り出す(図1)。健康な膝は前部平面1、3の摩擦のない動きを可能にする移動式ヒンジの接合箇所として機能する。病理学的状態下では、動きは制限され、痛みを伴うことがあります。最も一般的な変性膝関節疾患は変形性関節症(OA)4である。OAの発症に大きな影響を与えるさまざまな危険因子が知られています, 高齢者を含みます, 肥満, 女性のセックス, 関節外傷, 遺伝学, とりわけ5,6.現在、米国には症候性膝OAを持つ推定1,400万人が存在し、人口年齢の上昇と肥満率7,8による罹患率が増加しています。当初は軟骨の疾患であると考えられていたが、OAは現在、関節全体9の疾患として理解されている。OAで一般的に観察される病理学的変化は、関節軟骨浸食、骨棘形成、軟骨下骨肥厚、および滑膜9、10の炎症を含む。OAに対する既知の治療法がないため、治療は主に症状(例えば、疼痛)管理11、12に焦点を当て、そしてOAが末期に進行すると、関節置換手術は13を示すことが多い。
関節置換手術は、脛骨性関節関節全体と膝蓋骨関節関節の交換を含む全膝関節形成術(TKA)を伴う部分的または完全な膝置換のいずれかであり得る。2020年現在、米国では毎年約100万件のTKUが実施されています。TKAの間、整形外科医は脛骨台の上部と下腿骨顆(図2A、2B)を補間インプラントで装着するように分け替える。時には患者によって誤解され、TKAでは、各骨の端から8〜10mmしか切除され、その後キャップまたは再浮上し、金属で覆われる。介在ポリエチレンライナーは、2つの金属インプラント間の軸受面(すなわち、パディング)を形成する。さらに、関節のいくつかの軟部組織成分は、適切な関節バランスを達成するために完全または部分的に切除される。これらの組織の中には、内側および外側の月経(図2C)、歯膜脂肪パッド(図2D)、前十字靭帯(ACL;図2E、滑膜(図2F)、及び斜筋(VMO;図2G)TKAは一般的にOA治療に成功しているが、患者の約20%が手術後の痛みの再発を報告する16。高いコストと手順の相対的な侵襲性に加えて、これらの制限は、OAの進行を軽減するための代替治療を特定するためのさらなる研究の必要性を指摘する。
治療介入のための新たな道を提示し得るOAの疾患メカニズムを探求するために、細胞、組織外植物、および動物モデルを含む実験システムを使用することができる。細胞は、典型的には、単層で培養され、原発性ヒトまたは動物組織(例えば、軟骨から単離された軟骨細胞)または不死化細胞(例えば、ATDC517 およびCHON-00118)に由来する。細胞は制御された培養環境で実験変数を操作するのに有用であるが、細胞のフェノタイプ19に影響を与えると知られている自然な関節の条件を捕捉しない。OAの基になる化学的、機械的、および細胞間通信の複雑なカスケードをより良く再現するために、代わりの代替は、一次ヒトまたは動物組織サンプルに見られ、新鮮なまたは培養された ex vivo を外植として使用するかにかかわらず、組織構造および細胞微小環境20を保存する。 生体内で関節を研究するためには、小(例えばマウス21)および大きい(例えば、馬22)OAの動物モデル(例えば、外科的誘導、遺伝的変化、または老化を通じて)も有用である。しかし、これらのモデルからヒト疾患への翻訳は、解剖学的、生理学的、および代謝の違いによって制限され得る。実験システムの長所と短所を考えると、種特異的であることと、一次ヒトOA組織が提供する細胞外ニッチを維持することの主な強みは、研究結果の翻訳可能性を最大化する。
ヒトの初発組織は、TKAに続いて容易に得られ、TKAの高頻度を研究に役立つ貴重な資源とすることができる。潜在的な実験的応用の中には、遺伝子発現および組織学的分析がある。これらの研究アプローチ等に対するヒトの主要OA組織の可能性を実現するために、以下の重要な検討事項を概説する。まず、患者検体の使用は倫理的規制の対象となり、プロトコルは機関審査委員会(IRB)の承認を満たす必要があります。第二に、ヒト原発性疾患組織の固有の異質性と、年齢や性別などの変数の影響は、とりわけ、慎重な患者の選択(すなわち、適格性基準の適用)およびデータ解釈の必要性を生み出す。第三に、関節中の異なる組織の独特な生物学的特性(例えば、軟骨および半月板25の低い細胞性)は、実験中に課題を提示することができる(例えば、RNAの質および量を高く分化する)。このレポートでは、これらの考慮事項に対応し、患者の選択、サンプル処理、組織の均質化、RNA抽出、および品質管理(RNAの純度と完全性の評価)のためのプロトコルを提示します。 図3)研究コミュニティにおける主要ヒトOA組織の使用を奨励する。
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Protocol
この研究議定書は承認され、ヘンリーフォード健康システム制度審査委員会(IRB #13995)によって設定された制度ガイドラインに従った。
1. 患者の選択
- 整形外科医とTKAを受ける予定の患者の中から患者を特定する。
- 研究プロトコルで定義された適格性基準に基づいて患者を選択します。包含基準の例としては、18歳以上であることと、変形性膝関節症の確定診断を有することなどが挙げられる。除外基準の例としては、部分的な膝関節置換術を受けるか、関節リウマチの診断が確認済みである。
- 手術前に患者に連絡してインフォームド・コンセントを取得してください。
2. サンプル処理(RNA用)
注:クラスIIバイオセーフティキャビネットですべての組織処理を行い、滅菌技術に従ってください。人間のサンプルを処理する際には、適切なPPE(ニトリル手袋、ラボコート、安全ゴーグル)を着用してください。TKA中に複数の骨片が生成され、大量の骨/軟骨が解剖に利用できる可能性がある。疾患の進行により、関節軟骨の変性は、実験的な設計に因数を考慮することができるいくつかの骨部分でより重篤である可能性があります。切除のために電気コーテリを義務付ける組織だけが熱エッジ損傷を有し、損傷を最小限に抑えるためにメスでほとんどの組織を調達するために協調的な外科的努力がなされる。切除された組織は、滅菌PBSで常に水分補給を維持する必要があります。
- 70%エタノール、RNase除菌剤、DEPC処理水、70%エタノールで再び、すべての作業面と機器を消毒します。清潔で糸くずのないティッシュで残りの液体を拭き取ります。鉗子、骨カッターおよびメスは、使用前に少なくとも10分間、オートクレーブまたは70%エタノールに浸漬される。すぐに使用しない場合は、装置を70%エタノールに沈めておく。
- 各組織の非同定サンプル名とアリコート番号を有する少なくとも3つのクライオビアルを事前にラベル付けする(例えば、TKA-1軟骨1)。
- 図2に示したサイズ、形状、色、および質感の違いに基づいて、標本から各組織タイプを特定する。軟骨(図2A矢印)、骨(図2B矢印)、半月板(図2C)、眼底脂肪パッド(図2D)、前十字靭帯(図2E)、滑膜(図2F)、及び斜筋(図2G)の広大な内側を特定する。
- 関節軟骨を分離します。
- 軟骨分解を最小限に抑えた骨部分を選択します。
- No.10メスを使用して、軟骨層の完全な厚さを解剖するために可能な限り軟骨深さを切り抜ける。
注:No.10メスは骨ではなく軟骨に浸透するだけです。 - 軟骨の完全な厚さを使用して、3つの5ミリメートルキューブを解剖します。
- 軟骨下骨を分離する。
- 軟骨が採取されたのと同じ骨部を使用する。
- No.10メスを使用して、骨表面から残りの軟骨および残留組織を削ります。
- 鉗子で切断される骨部分を保持し、3つの5ミリメートルの立方体をカットするために骨カッターを使用しています。
- 半月板を分離します。
- 内側または横半月板の比較的損傷していない部分を特定します。
- No.10メスと鉗子を使用して、3つの5ミリメートルキューブを解剖します。
- 破砕脂肪パッドを分離します。
- No.10メスと鉗子を使用して、組織の黄色の部分を3つの等しい大きさと均質な部分(〜500mgそれぞれ)に切断します。
- 前十字靭帯(ACL)を分離します。
- No.10メスと鉗子を使用して、3つの5ミリメートルキューブを解剖します。
- 滑膜を分離します。
- No.10メスと鉗子を使用して、脂肪組織を掻き取ることによって膜のピンクの細胞部分を可能な限り分離する。
- 3つの等しい大きさと均質な部分(〜200mgずつ)を解剖する。
- 虚内側筋を斜め(VMO)分離する。
- No.10メスと鉗子を使用して、標本から脂肪組織を取り除き、赤い筋肉組織だけを残します。
- 3つの5ミリメートルキューブを解剖します。
注:組織の初期サイズは、部分のサイズを制限します。
- 滅菌PBSで組織部分をすすいで、残留物や破片を除去します。
- 組織学を行うために、 パート3に記載されているように各組織部分を固定する。
- RNA抽出を行うために、3つの組織部分をそれぞれ小さく切り取ります(〜1〜2mm の立方体)。
- 小片を2mLのクライオビアルに移し、キャップをしっかりと固定し、30sの液体窒素に沈めてフラッシュフリーズし、長期保存のために-80°C冷凍庫に移します(現在のプロトコルでテストされた最大4ヶ月)。すべての組織のすべてのアリコートについてこれを繰り返します。
- パート4で説明されているように、組織均質化に進みます。
3. サンプル処理(ヒストロジー用)
注意:ホルマリンは有害な化学物質であり、化学発煙フードでのみ使用されます。
- 10%ホルマリン溶液でラベル付けされた15 mL円錐管を充填します。
- 鉗子を使用して、ホルマリン充填チューブに組織セクションを移す。
- 可能であれば、揺れ/攪拌しながら室温で1週間ホルマリンで組織を固定します。
- 1週間後、ホルマリンを適切な化学廃棄物処理に廃棄し、組織をPBSでリンスし、試料が切り離しに埋め込まれるまで4°Cで長期保存するために70%エタノールを含む新鮮な15 mL円錐管に移します。
注:骨/軟骨の場合のみ、次のようにデケーションを実行します。 - 1週間後、ホルマリンを適切な化学廃棄物処理に廃棄し、PBSで組織をすすいだ。
- 10%EDTA溶液(pH 7.4)の45 mLで50 mL円錐形チューブに組織を移す。
- 揺れ/攪拌が不可能な場合は、チューブを1日1回10~15回反転してください。
- EDTA ソリューションを破棄して、週 1 回交換します。
- 週2回、器具(すなわち、スパチュラ)または手袋をした指でテクスチャをテストし、圧力が加えられると変形を観察して脱灰を確認する。骨組織を脱灰するのに要する時間は、4〜6週間のサンプル間で変化する。
- 脱灰したら、PBSで組織をすすい、試料が切片のために埋め込まれるまで4°Cで長期保存するために70%エタノールを含む新鮮な15 mLの円錐管に移す。
4. 組織均質化
注意:プロトコルは、有害な化学フェノールを使用しています。フェノールの作業は、化学発煙フードで行う必要があります。
注:70%エタノール(最低10分間浸漬)で使用するすべての機器と表面を徹底的に洗浄し、RNaseデコンタミナント(最低10分間浸す)、DEPC処理水で洗い流し、清潔で糸くずのないペーパータオルで拭き取り、70%エタノールで再スプレーまたは浸漬します。
-
硬質組織均質化(関節軟骨、軟骨下骨、半月板)
- 均質化する前に、乳鉢、害虫、およびヘラを液体窒素で冷やします。これらは、サンプルの解凍を防ぐために、できるだけ冷たく保つ必要があります。
- サンプルを1つずつ処理し、他のサンプルは使用するまで-80°Cに保ちます。
- チルドヘラを使用して、組織サンプルをモルタルに移します。組織の上に追加の液体窒素を注ぎ、蒸発させる。害虫を使用して組織を粉砕します。繰り返し組織サンプルに液体窒素を追加し、蒸発させ、次に微粉末を作るために害虫で粉砕を続けます。
- 可能な限り組織を粉末化した後、予め冷やされた1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
- 組織移動前に30sの液体窒素に沈めることによるプレチルチューブ。
- 各チューブに酸グアニジニウムフェノール溶液の1 mLを加え、氷の上に保管します。
- 各硬組織サンプルについて、ステップ 4.1.3~4.1.5 を繰り返します。
- 各組織の後、70%エタノール、RNase除菌、DEPC処理水、および70%エタノールに浸漬して、モルタル、害虫、およびヘラを洗浄します。清潔で糸くずのないティッシュで残った液体を拭きます。
- さらに20分間氷上でサンプルをインキュベートします。
-
軟部組織均質化(インフラペラー脂肪パッド、ACL、滑膜、VMO)
- 70%エタノール、RNase除菌剤、DEPC処理水、および更に70%エタノール洗浄を30sに対して加えて配管することにより、ホモジナイザーを消毒する。清潔で糸くずのないティッシュで残った液体を拭きます。各サンプル間で繰り返します。
- 各サンプルに対して5 mLの丸い底管をラベル付けします。各チューブに酸グアニジニウムフェノール溶液の1 mLを加えます。
- 一度に1つのサンプルに取り組み、他のサンプルを-80 °Cで処理し、使用するまで使用します。
- 酸グアニジニウムフェノールを用いて、あらかじめ標識された5 mLチューブに組織を移します。
- 30 sパルスで組織を均質化し、パルスの間およびパルス間で氷の上に保管します。組織が視覚的に溶解するまで、または最大5つの30 sパルスまで繰り返します。
注:いくつかの繊維組織(すなわち、筋肉)は、完全に均質化しない場合があります。 - 溶解した組織を氷の上にインキュベートし、次のサンプルに移動します。
- ステップ 4.2.1 で説明したようにホモジナイザーをクリーニングします。組織の塊がプローブの歯に残らないようにします。必要に応じて滅菌鉗子で除去します。
- すべてのサンプルを均一化した後、さらに20分間、酸性グアニジニウムフェノール中の氷上でインキュベートします。
- 丸底チューブからサンプルを、あらかじめラベル付けされた1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
5. 組織からのRNA抽出
注意: このプロトコルは、フェノール、クロロホルム、イソプロパノールなどの有害な化学物質を使用します。化学発煙フードですべての作業を実行します。
注:装置および試薬は、RNAの作業のために予約されており、分子用途(滅菌、ヌクレアーゼフリー)に適した化学的グレードでなければなりません。このプロトコルは 、パーツ 4.1 と 4.2 の両方の組織均質化プロトコルに成功します。70%エタノール(最低10分間浸漬)で使用するすべての機器と表面を徹底的に洗浄し、RNaseデコンタミナント(最低10分間浸漬)を行います。DEPC処理水で洗い流し、清潔で糸くずのないペーパータオルで残りの液体を拭き、70%エタノールで再スプレーまたは浸します。
- マイクロ遠心分離チューブを10000 x g で4°Cで10分間遠心し、破片をペレット化します。
- 上清を1.5mLのマイクロ遠心チューブに移します。
注:脂肪組織の場合、脂質層が上部に存在することがあります。ピペットチップでチューブの側面の層を突き刺すことによって、これを転送することを避けてください。 - 各サンプルに、酸グアニジニウムフェノール溶液の1mL当たり200μLのクロロホルムを加えます。30 sを混ぜるために手でチューブを激しく振ります。その後、氷の上で2分間インキュベートします。
- 遠心分離機サンプルを10000xgで4°Cで12分間用いた。
注:遠心分離後、RNAを含む水相、白色DNA間相、下部のピンクタンパク質相の3つの層が形成されます。 - 上側の約500μL、水相を新鮮な1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
注:相間およびタンパク質の分率を乱さないで下してください。これらの段階を-80 °Cで保存し、将来のDNAまたはタンパク質の分離を実現します。 - 転入水相に等量の酸グアニジニウムフェノール溶液を加え、チューブを8~10回反転して混合する。チューブを氷の上に20分間インキュベートします。
- 各サンプルに、酸グアニジニウムフェノール溶液の1mL当たり200μLのクロロホルムを加えます。30 sを混ぜ合わせ、氷の上で2分間インキュベートするために手で激しく振ります。
- 遠心分離機サンプルを10000xgで4°Cで12分間用いた。
- 水相<500μLを新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、サンプルを他のフェーズで汚染しないように注意してください。
注意: 適切な危険物の廃棄方法で残りのフェーズを廃棄します。 - 各サンプルに100%イソプロパノールの等体積(水相として)を加えます。チューブを8~10回反転して混ぜます。氷の上で5分間インキュベートします。
- 各サンプルに1μLのグリコーゲン共沈出剤を加え、遠心分離後のRNAペレットの位置を確認します。
- サンプルを4°Cで25分間12000 x g で遠心します。
- チューブ内のペレットを見つけます(コプラピタン剤を使用すると青色に表示されます)。上清を慎重に注ぎます。
- 各サンプルに1mLの氷冷75%エタノールを加えてペレットを洗浄し、渦液をチューブの底からペレットを外します。
注:分子グレードの純粋なエタノールとヌクレアーゼフリー水を使用して75%エタノールを調製してください。 - 遠心分離機 7000 x g で 5 分 4 °C. 上清を慎重に注ぎます。
- ステップ 5.13 と 5.14 をさらに 2 回繰り返します。
- クイックスピン(5sの場合は<2000 x g) を使用して、残った液体をチューブの底に持ち込みます。P20ピペットを使用して、チューブの底部から残留エタノールを除去します。
- ピペットチップでRNAペレットに触れないようにしてください。サンプル間のヒントを変更します。
- チューブキャップを開いた状態で、室温で10分間空気乾燥サンプルを使用します。
注:ペレットは乾燥するにつれて半透明になることがあります。全ての残留エタノールが蒸発していることを確認することで、RNAの純度が向上します。 - 各チューブに25μLのヌクレアーゼを含まない水を加えてペレットを溶解します。
- 室温で5分間インキュベートします。
- ピペットを上下に軽くしてRNAを混合します。
- アリコート5 μLサンプルを品質管理分析用の新鮮なチューブに入れる(第6部)。遺伝子発現アッセイのために残りの20 μLを-80 °Cで保管してください。
6. 品質管理
- メーカーの指示に従って分光光度計を使用してRNAの濃度と純度を決定します。
- メーカーの指示に従って電気泳動装置を使用してRNAの完全性を決定します。
注:チップ検出限界の範囲内に収まるようにRNAを希釈します。
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Representative Results
OAのTKAを受けている患者から収集するために7つのユニークなヒト膝関節組織が利用可能である(図1)。このプロトコルでは、これらの組織のそれぞれを特定し、外科的除去の4時間以内に処理した(図2)。図3に概説するステップに従って、各組織の部分は組織学的評価のためにホルマリン固定(図4)、他の部分はRNA単離のためにフラッシュ凍結した。崩壊の方法(それぞれ粉砕対均質化)によって軟組織から硬組織を分離し、高い完全性および純度のRNAを各組織タイプから抽出し、表1(高品質カラム)に示す代表的な結果を得た。特に、一部の被験者は、複数の組織にわたって低品質のRNAを生み出し(表1、低品質カラム)、最適化された方法にもかかわらず、外的要因(例えば、疾患重症度)が組織タイプ間のRNA品質に影響を与える可能性があることを示唆している。
図1:横断面を示すヒト膝関節の模式図。 7つの標識された組織のそれぞれは、TKA中に収集され、このプロトコルで説明されているように研究目的のために使用されます。VMO =虚内側筋斜筋。クリエイティブ・コモンズ・ライセンス26の下で OpenStax カレッジからアクセスおよび変更された画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: TKAを受けている患者から得られた7つの組織のそれぞれについて代表的な総画像(A)採取する関節軟骨を指す矢印で前大腿骨を切る。軟骨は、骨の表面に見られる白っぽい層によって識別される。(B)前大腿骨は、採取する軟骨下骨を指す矢印で切断する。(C)メニスカス。TKAの間に電気焼灼によって引き起こされる焼けたセクションを集めないようにしてください。(D) 内耳蓋脂肪パッド (黄色色)。(E)前十字靭帯(白、繊維状、海綿組織)。(F) スノビウム.一方の側は明るい色と繊維状に見え、しばしば脂肪組織を含み、反対側はピンクがかったと繊維性が低く見えます。膜のピンク側には滑膜の裏地が含まれています。(G) カスタス内側斜筋 (赤).これは、多くの場合、最小の組織部分であり、いくつかの脂肪組織を含んでいてもよいです.スケールバー= 2 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 組織学とRNAの主要ヒトOA組織を収集する手順の概要 このプロトコルは、患者の選択、組織学とRNAのサンプル処理、硬組織と軟組織の組織均質化、RNA抽出、および7つの原発ヒト膝OA組織の品質管理について説明する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TKAを受けた患者から得られた7つの組織のそれぞれについて組織学的セクションを示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたセクションは、パネルA-Fで6倍の拡大で示され、パネルA'-F'およびA"で40倍に拡大されたインセットを有する。(A, A')関節軟骨;(A, A")軟骨下骨;(B,B')半月板;(C、C')インフラ膝蓋脂肪パッド;(D, D') 前十字靭帯;(E, E') 滑膜;(F, F') 虚内側筋斜筋.スケールバー = A-Fの場合は 400 μm、A'-F' および A の場合は 50 μm です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 組織 | N | 鈴 | [RNA](ng/μL) 25 μL | A260:A280 | A260:A230 | ||||||||
| 高品質 | 低品質 | 高品質 | 低品質 | 高品質 | 低品質 | 高品質 | 低品質 | 高品質 | 低品質 | ||||
| 「硬い組織」 | |||||||||||||
| 関節軟骨 | 10 | 4 | 7.0 ± 0.8 | 1.3 ± 1.2 | 135 (36-243) |
46 (26-78) |
1.80 ± 0.09 | 1.47 ± 0.34 | 1.40 ± 0.36 | 0.45 ± 0.26 | |||
| 軟骨下骨 | 10 | 4 | 7.8 ± 0.6 | 3.6 ± 1.1 | 514 (181-1586) |
342 (122-769) |
1.96 ± 0.05 | 1.90 ± 0.17 | 1.72 ± 0.27 | 1.12 ± 0.62 | |||
| メニスカス | 10 | 4 | 7.5 ± 0.6 | 2.4 ± 0.3 | 242 (38-1629) |
95 (60-318) |
1.91 ± 0.05 | 1.71 ± 0.15 | 1.41 ± 0.47 | 0.77 ± 0.59 | |||
| 「軟組織」 | |||||||||||||
| インフラペラー脂肪パッド | 10 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 6.1 ± 1.4 | 1905 (668-5100) |
1151 (381-2306) |
1.99 ± 0.01 | 2.02 ± 0.03 | 2.09 ± 0.17 | 1.47 ± 0.71 | |||
| 前十字靭帯 | 8 | 3 | 7.4 ± 0.4 | 5.2 ± 1.9 | 1836 (613-8456) |
727 (97-1479) |
1.97 ± 0.03 | 1.91 ± 0.18 | 1.88 ± 0.20 | 1.35 ± 0.70 | |||
| シノビウム | 9 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 6.2 ± 3.1 | 2239 (401-4100) |
1897 (902-3366) |
1.99 ± 0.04 | 2.00 ± 0.03 | 2.05 ± 0.11 | 1.91 ± 0.20 | |||
| カストゥス・メディラ・斜め | 9 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 8.4 ± 0.7 | 1002 (377-1715) |
1097 (308-2138) |
1.96 ± 0.03 | 1.99 ± 0.03 | 1.82 ± 0.11 | 1.62 ± 0.27 | |||
表 1.TKA患者から採取したOA組織から単離されたRNAの質と量。リン = RNA 完全性数。RIN、A260、A280、A260の平均±標準偏差として提示されるデータ:A 230比、RNA濃度値の平均(範囲)を示す。高品質のサンプルは、すべての組織タイプがRIN>6(n = 8-10)でRNAを得た患者から構成されています。低品質のサンプルは、複数の組織タイプがRIN<6(n =3-4)でRNAを得た患者で構成されています。
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Discussion
提示されたプロトコルは、RNA抽出のための7つの主要なヒトOA組織を収集することに成功したことを証明しました(表1)および組織学的処理(図4)。患者のサンプルを収集する前に、理想的には外科医または外科チームと協力して、IRB承認プロトコルを確立する必要があります。試験片の収集に標準化されたプロトコル(例えば、その場での一貫した切除)を適用することは、実験再現性を最大化するために不可欠です。組織サンプルは、滅菌容器内の実験室に輸送し、分解を避けるために手術の4時間以内に処理する必要があります。組織解剖および処理中、すべての組織は無菌PBSで水分補給され、新鮮な滅菌PBSですすがって、RNA抽出のためにフラッシュ凍結されるか、組織学のためにホルマリン固定される前に、生体液やその他の不要な破片などの潜在的な表面汚染物質を除去します。組織学的分析の有用な応用は、組織の種類および疾患重症度の確認であり、これらは細胞数、分布、および形態によって区別され得るので、ヘマトキシリンおよびエオジンなどの標準的な染色によって観察可能な他の要因の中でも(図4)。
原発性ヒトOA組織は、純度と完全性27によって定義される十分な量および質のRNAを抽出するための課題を提示することができる。RNA量は組織の全体的な細胞性の関数であり、膝関節には軟骨、骨、半月板などの低細胞、高マトリックス組織、および脂肪パッド、ACL、スノビウム、VMOなどの比較的高細胞の低マトリックス組織があります。例えば、関節ヒアリン軟骨およびメニスカル線維軟骨28はいずれも、細胞性が低いことを特徴とし、コラーゲン、プロテオグリカン、および他の糖タンパク質28,29の様々な量を含む細胞外マトリックスを有する。より少ない細胞を有すると、組織の体積当たりのRNA(量の減少)が少なく、より多くのタンパク質を有すると、RNAとの共精製(還元純度)25,30になります。RNAの純度は、A260:A280およびA260:230値<1.5が有機汚染物質(例えば、タンパク質)の存在を反映し、〜2.0の値が純粋なRNA31を反映する分光光度測定によって決定することができる。 RNAの完全性は、分解のレベルを反映し、実験条件(すなわち、剪断力)または酵素消化(例えばヌクレアーゼ)によって引き起こされ、しばしば電気泳動分析によって決定される。RNAインテグリティ・ナンバー(RIN)1は分解されたRNAを反映し、RINは10個のRINは無傷のRNA31,32を反映する。RNA シーケンシングの場合、最小 RIN 7 は33、34、35を推奨します。表1に示すデータは、これらのA 260:A 280、A260:A230、およびRIN閾値が、低品質RNA群の患者サンプルと比較して、高品質RNA群の患者サンプルと比較して、すべての組織にわたって満たされたことを明らかにしている。 これは、低細胞、高マトリックス組織におけるRNAのタンパク質汚染を反映する可能性がある。与えられた患者のサンプルから分離されたRNAの質に寄与する可能性のある多くの要因があるが、その中でも疾患の重症度のレベルである可能性がある。OA組織の病気の性質は、組織だけでなくRNAを消化できる酵素のレベルの増加によって分解プロセスが起こっていることを示唆し、それによって品質を低下させる。
RNA抽出のためのこのプロトコルは、ヒトの初発組織からのRNA量と品質を最大化することを目的としています。最も重要なステップは、組織が粉砕または均質化されることによって組織が崩壊したかどうかに関連し、これは組織細胞性およびマトリックス組成と相関することが判明した。当初、7つの組織はすべて、液体窒素を用いてモルタルと害虫によって組織を粉砕し、次に酸グアニジニウムフェノール溶液に移し、さらにハンドヘルド組織ホモジナイザーを使用して均質化したのと同じプロトコルを受けた。この方法は、脂肪パッド、ACL、滑膜、およびVMO(総称して軟部組織、比較的高細胞、低マトリックス)に良好なRNA収量、純度および完全性を生み出したが、軟骨、骨、および半月板(総称して硬い組織;低細胞、高マトリックス)に好ましくない結果を生じさせた。これらの観測に基づいて、7つの組織は、さらなるプロトコルの改良のために2つのグループに分けられた。さらに均質化は、微細な粉末に粉砕された後、硬質組織をさらに崩壊させる効果が最小限であることが観察された。逆に、軟組織の解離は均質化だけでうまく行われ、粉砕を必要としなかった。したがって、硬質組織の均質化と軟組織の粉砕が排除された。これは、剪断力、処理時間、温度変動を最小限に抑える上で有益であり、RNAの完全性を向上させることができます。7つの組織すべてについてフェノール/クロロホルム相分離の2ラウンドが行われ、これは、収率31を低下させることなくRNAの純度を向上させることが報告されている。
このプロトコルの潜在的な制限は、実験計画がすべての組織間の比較を必要とする場合に組織を2つのグループに分離することから生じる可能性のあるバッチ効果である。粉砕対均質化法の使用は、変動性36を導入し得る技術的(例えば、処理時間)および環境(例えば、温度変動)条件を変化させる可能性がある。第2の制限は、被験者内および被験者間で組織を識別、解剖、および配向する(組織学的断面化)における潜在的な矛盾である。第3の制限は、現在の報告書における患者病の重症度とRNA品質との間の潜在的な相関関係を確認できないことである。第4の制限は、比較のための健全な対照組織の利用可能性の欠如である。制御サンプルは死体から入手できるが、これらはTKAのOA組織よりも容易に入手できない。これを回避するための実験的な戦略は、各被験者を独自のコントロールとして使用することです, 組織間で比較を行うか、治療と制御または保存領域に病変を比較する組織内で.最後に、RNA抽出のために組織外植物を使用しても、組織を構成する個々の細胞型の遺伝子発現解析が認められていない(例えば、滑液状線維芽細胞対滑液状マクロファージ37)。
指摘された制限にもかかわらず、一次ヒトOA組織は研究のための貴重な資源であり、細胞ニッチ23の保存を含むOAの他の実験システムよりも利点を提供する。しかし、一次ヒトOA組織は、ロジスティックまたは技術的な課題のために研究において十分に活用されていない可能性があります。このプロトコルは、TKAから得られたサンプルの使用をサポートするために、患者の選択、サンプル処理、組織均質化、RNA抽出、および品質管理について説明します。サンプル処理の後、遺伝子発現やヒストロジーなど、いくつかの実験的アプローチを追求することができます。急速に進化するオミクス分野に最も関連するのは、RNAシーケンシング38,39などの用途に十分な量の高品質RNAを分離する能力である。分子プロファイルは、特定の疾患のフェノタイプを有する対象(例えば、年齢、性別、および他のOA危険因子に基づく)を有する対象の組織内および組織間で比較することができる。得られた洞察は、OA患者集団により容易に翻訳できる新しい治療手段を知らせるかもしれない。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、この研究を可能にした研究参加者に感謝し、この報告書を変形性関節症分野の新しい科学者に捧げる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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