Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Resumo

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Introdução

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur¹. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia de^{fluidos 1,2,3} (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite mo....

Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995).

1. Seleção de pacientes

1. Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico.
2. Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter diagnóstico confirmado de osteoartrite do joelho. Exemplos de critérios de exclusão incluem submeter-se a substituição parcial do joelho ou ter um diagnóstico c....

Resultados

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas para o isolam.......

Discussão

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essencial para maximiz.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	05 402	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA.
10% Formalina	Cardinal Saúde	C4320-101	Armazene em armário químico quando não estiver em uso.
100% Clorofórmio (Grau de Biologia Molecular)	Fisher Scientific	ICN19400290	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA, armazene em gabinete químico quando não estiver em uso.
100% Etanol (Grau de Biologia Molecular)	Fisher Scientific	BP2818500	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para o trabalho de RNA, ao diluir use água livre de DEPC / nuclease.
100% Isopropanol (Grau de Biologia Molecular)	Fisher Scientific	AC327272500	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA, armazene em gabinete químico quando não estiver em uso.
Álcool reagente 100%	Cardinal Health	C4305	Diluído a 70% com dH2O para fins de limpeza.
Placas de cultura estéreis de 15 cm	Thermo Scientific	12-556-003	Estéril, sem nuclease.
Tubos de polipropileno (Falcon) de 15 mL Fisher	Scientific	14 959 53A	Estéril, livre de nuclease.
2 mL criogeniais (rosca externa)	Fisher Scientific	10 500 26	Estéril, livre de nuclease.
Tubos de fundo redondo de 5 mL	Corning	352052	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA.
Tubos de polipropileno (Falcon) de 50 mL	Fisher Scientific	12 565 271	Estéril, sem nuclease.
Bioanalisador	Agilent	G2939BA	Para medição da integridade do RNA.
Gabinete de Biossegurança Equipamento			geral de laboratório
Cortadores de ossos	Fisher Scientific	08 990	Esterilizado com 70% de EtOH.
Capa de Fumaça Química	Equipamento
Bisturis descartáveis (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Estéril, livre de nuclease.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	Solução de 10% com dH2O.
Fórceps	Qualquer fornecedor		esterilizado com 70% de EtOH.
Coprecipitante Glycoblue	Fisher Scientific	AM9516	Reservado apenas para trabalho de RNA, armazenar a -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Nitrogênio Líquido	Qualquer fornecedor
Nitrogênio Líquido Dewar	Equipamento
Almofariz e pilão	Qualquer fornecedor		Reservado apenas para trabalho de RNA, esterilizado por protocolo.
Espectrofotômetro Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000	Para medições de pureza e rendimento de RNA.
Água sem nuclease/tratada com DEPC	Fisher Scientific		Estéril, sem nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA.
PBS (Estéril)	Gibco	20 012 050	Estéril, livre de nuclease.
Pipetas (2 µ L, 20 µ L, 200 µ L, 1000 µ L) & dicas	Qualquer fornecedor		Estéril, livre de nuclease.
Kit avançado de miRNA de plasma/soro	Qiagen	217204
Centrífuga refrigerada 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Estéril, livre de nuclease.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Espátula (tamanho semimicro)	Qualquer fornecedor		Reservado apenas para trabalho de RNA.
Homogeneizador de tecidos	Pro Scientific	01-01200	Reservado apenas para trabalho de RNA, esterilizado por protocolo.
Reagente de TRIzol	Fisher Scientific	15 596 026	Estéril, livre de nuclease. Reservado apenas para trabalho de RNA.

geral de laboratóriogeral de laboratório